עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות 1R21HL092370-01 (ג&quot;ג), 1R01 HL095764-01 (ג&quot;ג); R01HL082694 (ג&quot;ו); איגוד לב אמריקאי, שותפי מייסדים (0855943D, ג&quot;ג); סטוני ולד - הרברט קרן, ניו יורק (SHP).

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונים הבאים ואבובים (לוח 1), כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקס פתרון, לא סידן, מגנזיום או חיווי עם פניצילין (100 U / ml) / סטרפטומיצין (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נאגר מלוח פוספט (PBS), 1x, לא סידן, לא מגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול, 70%, להפוך את 500 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Buffered פורמלדהיד, 7-10% עם PBS, להפוך את 500 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרוני אלחוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Avertin. בזהירות להוסיף 5 מ&quot;ל של 2-Methyl-2-butanol עד 5 גרם של 2,2,2-Tribromoethanol. נמס ברגע, לשמור פתרון מנייה בטמפרטורת חדר בחושך. קח 0.25 מ&quot;ל של פתרון המנייה ולדלל אותו עם 10 מ&quot;ל של 1xPBS בבקבוק זכוכית תחתונה. לעטוף את הבקבוק בנייר אלומיניום, במקום על 37 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה ולאחר מכן aliquot לתוך 5 צינורות פוליפרופילן מ&quot;ל ולשמור במקרר. לחמם aliquot 1 בבוקרו של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומר הרגעה. לדלל פתרון מניות עם PBS לתת 2.6% רביטורטים סולution. הנח aliquots מ&quot;ל 3-4 בצינורות פוליפרופילן. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארגן 3 עבודת אזורים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור: סדר את הפריטים הבאים: טופס מחקר להקליט מספר זיהוי מחקר, תאריך, משקל גוף, משקולות של לב ימני, לב ומחץ שמאל; קנה מידת דיוק (0-50 בגרם דיוק 0.01 גר &#39;) כדי לקבוע את משקל גוף; קנה מידת מייקרו כדי לקבוע משקולות לב בדיוק 0.001 גרם; פתרוני הרדמה (מסומן באופן ברור);; לשקול סירות קטנים דיואר עם חנקן נוזלי; מכל מבודד עם קרח; צינורות וצלחת 24 גם לאיסוף דם ודגימות רקמה (טבלה 1); מכשירי ניתוח ( טבלה 2, איור 2); ופתרונות כדי לנקות את המכשירים (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השטח B: סדר את הפריטים הבאים: מיקרוסקופ לנתח; קטטר לב הימני מחובר ליחידת שליטה בלחץ שמחוברת למגבר ומחשב נייד. מכניס צנתרמבחנה המכילה מים. סדר מכשירי ניתוח (טבלה 2), חתיכות לחתוך תפר לאורך אופטימלי והניח למשקל סירה; קלטת (קלטת חיטוי היא אופטימלית) חתוכה להאורך ולרוחב האופטימלי ועומדת בשורה על ספסל מיקרוסקופ או במעבדה לשם גישה נוחה; מטליות גפן פתרון מסיר שיער. כייל את הצנתר בתחילת המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השטח C: סדר את הפריטים הבאים: זכוכית מגדלת העדשה; צינורית קנה נשימה; 1 מיליליטר מזרקים; לחתוך תפר לאורך אופטימלי ולהציב לתוך סירה לשקול; דיואר הקטן עם חנקן נוזלי; מכל מבודד עם קרח; צינורות וצלחת 24 היטב כדי לאסוף BAL ודגימות רקמה (טבלה 1); מכשירי ניתוח (טבלה 2); פתרונות לבצע BAL ולנקות את הצינורית קנה נשימה ואת המכשירים (טבלה 1). </li></ol></li></ol> 2. צנתור לב ימני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר לשקול שימוש בסולם דיוק על ידי צבת עכבר בעדינות לתוך שוקל בשיבולת שועל. הקפד לטפל בבעלי החיים בעדינות ובשקט. הקלט משקל. הפרוטוקול המתואר עובד הכי טוב עבור עכברים שהם 20 גרמו או יותר בגלל הקוטר של עורק הצוואר צריך להכיל את הקטטר הלחץ; אפשר צנטר עכברים קטנים יותר (17 גרם או יותר), כל עוד הווריד גדול מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר באמצעות הזרקת Avertin תלוי במשקל הגוף (10 μl / g), לדוגמה, עבור 20 גרם לתת 200 μl, ל25 גרם לתת 250 μl, עבור 30 גרם לתת 300 μl. נפח ההזרקה המדויקת צריך להיות מותאם בהתאם לזן העכבר. הקפד לטפל בבעלי החיים בעדינות ובשקט, כי מתח יכול לשנות את התגובה לחומרי ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהעכבר מסומם, מניח על נייר טישו כפול קפלים. שים לב למספר תעודת הזהות על נייר. לשפשף בעדינות קרם להסרת שיער להיבט הגחון של הצוואר כדי לנקות את שדה הניתוח. הנח את העכבר חזרה על נייר ולחכות 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער מהיבט הגחוןשל הצוואר על ידי מלטף את השיער נגד כיוון צמיחת השיער בעדינות עם צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לקבוע את העומק המספיק של הרדמה בבדיקה להיעדר רפלקס בוהן: העכבר לא מגיב לצביטות האצבעות שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות ובנינוחה, את שארית צנתור הלב הימני לא אמורה לקחת יותר מ 10 דקות, 3-6 דקות בצורה אופטימלית. חשובה שהרקמה לא תתייבש כי הצנתר צריך להחליק לתוך הווריד ולנוע בתוך הווריד על שכבת לחות. תזמון עקבי של ההליך הוא חשוב עבור הדור של נתונים שאינם ברים השוואה בין קבוצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גב עכבר מקום על נייר טישו והעברה בנייר טישו על קלקר לוח. תקן את כפות רגליים וראש למקומו באמצעות קלטת חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חתך של עור מלסתות לעצם חזה (שד עצם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנתח את מעלה הגדול בבלוטת התריס כלפי הצבתות לחשוף את עורק הצוואר הימניnd קנה נשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קלקר הלוח מחזיק את העכבר מתחת למיקרוסקופ לנתיחה במטוס המוקד כבר במקום ועדשה בכ 0.8x הגדלה (גדלה מוחלטת [x חתיכת עדשת עין] הוא כ 8x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות microdissect וריד צוואר הזכות על ידי הסרת רקמות חיבור המקיפים עם מלקחיים כירורגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שתי חתיכות של תפרים על גבי עורק הצוואר הימני. לקשור את התפר הקרוב ללסתות כדי לסגור את זרימת דם בווריד לטפטוף זעיר, הנח את התפר שהוא קרוב ביותר לעצם החזה / שד העצם בקשר רופף מסביב לווריד. אפשר להשתמש בטפטוף הזעיר של דם מאוחר יותר כדי למצוא את החור בווריד, זה צריך להיות נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנשום ולהירגע (לשחרר את השרירים בצוואר והלסת) כדי לשמור את העיניים על הווריד דרך עיני. זה יבטיח שהידות ואצבעות יהיו להעביר באופן מאובטח, בצורה חלקה ונינוח. בעוד מחזיק את הווריד עם מלקחיים בצד הקרוב להלסתות, לחתוך חור לווריד בין שני התפרים באמצעות מייקרו מספריים המופעלים על ידי היד השנייה. תוריד את מייקרו מספריים, ושמירה שרגועת יד, מרגיש לקטטר. בעדינות לשלוף את הקטטר מחזיק אותו בין אגודל והאצבע הראשונה (איור 3). הכנס את הקטטר אל תוך החור של הווריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות קידום הצנתר לתוך הלב הימני (איור 3). שימו לב לסימנים בקטטר שייתן מדד משוער של כמה רחוק קטטר צריך להיות מוכנס ולהתבונן בצג. ברגע עקומות הלחץ מוצגות, בעדינות להדק את התפר הנמוך סביב קטטר. בגלל קטטר יש חוזק מתיחה שנותן לו סליל, וכי קצב הנשימה ולב של העכבר להוסיף תנועה, בנוסף לקבע את הקטטר באמצעות קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות שיא לחץ ל2 דקות לניתוח מאוחר יותר (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התפר מחזיק קטטר, ואז בעדינות retrieve קטטר. נגב את החלק מאחורי מתמר לחץ, למקם אותו בחזרה לתוך הכוס עם מים. אל תיגע במתמר הלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר על גבי נייר הטישו לאזור להמתת חסד, אוסף של רקמת דם וטחול. נקה מכשירי ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את התהליך עם בעלי החיים הבאים. כאשר העיתוי מתיר, מזריק חומר ההרדמה בזמן המתנה כדי להקליט את עקומת לחץ (2.15). </li></ol> 3. איסוף דגימות דם וטחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק barbiturate פתרון, 400 μl לעכבר ולחכות 1-2 דקות. זו מבוצעת באופן שגרתי במעבדה שלנו, כדי למנוע את האפשרות שעכברי טעות להתאושש מAvertin-הרדמה בעת היותו דמם. התקינה המתאימה של ניסוי מושגת על ידי הזרקת המנה הזהה של חומר הרגעת פתרון לעכבר, ועל ידי מתנה את אותה הכמות של זמן לפני הקציר של דם. אם מותר בטיפול בבעלי החיים המוסדי והשתמש ועדה ועוד החיות במעקב צמודות לעומק של הרדמה לפני exsanguination, צעד זה יכול להיות מושמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חתך לתוך הבטן. פתח את וריד הזנב (וריד נבוב) ולאסוף דם באמצעות פיפטה העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הטחול, או חתיכת הטחול לתוך צינור אפנדורף והקפאת צמד בחנקן נוזלי, או לתוך הצלחת גם 24 לחוצץ גם מכיל הנקס להכנה מאוחר יותר של תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר על גבי נייר הטישו לC עבודת שטח לאיסוף BAL, ימפה ריאות ניקוז, ריאות ורקמות לב. נקה מכשירי ניתוח. </li></ol> 4. אוסף של ריאות ולב דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתח את קנה הנשימה החופשית של שרירים ורקמות חיבור. מלקחיים אותו תחת קנה הנשימה, דרך למשוך תפר. עדינות לייצר מתיחה מספיק כדי לחתוך חור. שמירה על המתיחה העדינה, הכנס את הצינורית של קנה הנשימה באמצעות תנועה מעט מפנה, ותפר הצינורית into מקום. להחדרה של צינורית קנה נשימה, לוודא שקנה ​​הנשימה לח, אם יש צורך מוסיף טיפה של פתרון הנקס. במהלך ההליך, לנשום, להירגע צוואר ושרירי לסת, כדי לשמור על תנועות ידות בטוחות וחלקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח לפתוח את כלוב צלעות על ידי הסרת שד העצם החל מתום הבטן בזהירות. נא לא להפריע את התוכן של בית החזה, כי זה עושה את זה מאוד קשה למצוא לימפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע רונכואלוואולרית שטיפה (BAL) על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של חיץ הנקס בעדינות, בעדינות להפוך את המזרק ולאחזר נוזל BAL. חזור 3 פעמים, צינור ומקום קרוב על קרח. במהלך ההליך, לשמור על עיניים בקצה הצינורית של קנה הנשימה המתחברת למזרק. מבט לבית החזה להתבונן האינפלציה והדפלציה של הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צומת קציר ריאות הלימפה ידי החזקת קיר כלוב צלעות עם סט אחד של מלקחיים, מציאה ואחזור ימפה עם מלקחיים עוד. ימפה מקום לצלחת גם 24. חשוב kעכשיו איפה לחפש: החל מהצוואר, למצוא את הכניסה של כלוב הצלעות בצד הימני של העכבר ונראה מעל עמוד השדרה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב קציר ומניח על נייר טישו. לבודד את הלב הימני על ידי ביתור בזהירות לאורך המחיצה. העברה לעבודה באזור לשקול, רשום את המשקל והמקום לתוך צינורות Eppendorf לצלם הקפאה בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח תפר סביב אונת הריאה השמאלית כדי לסגור את הסמפונות הראשית. מנתח את אונת הריאה השמאלית החופשית, מקום לצינור אפנדורף והקפאת צמד בחנקן נוזלי, או מקום לטוב של צלחת 24 היטב המכילה פתרון הנקס לבידוד מאוחר יותר של השעיות תא בודדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס כ. 0.5 מ&quot;ל בופר פתרון פורמלדהיד דרך הצינורית קנה נשימה לאונות הריאה הנותרות. לאחר אינפלציה, לנתח את אונות ריאה מבית החזה והמקום לתוך שפופרת המכילה 50 מיליליטר תמיסת פורמלדהיד. לתכנון מחקר חלופי, הריאות יכולות להיות מנופחות עם optimal חיתוך התקשורת (אוקטובר, דילול 01:04 עם PBS) ולהקפיא בתבנית המכילה אוקטובר החי להכנה מאוחר יותר של חלקים קפואים. תכנון מחקר נוסף עשוי להצריך השגת רקמה קפוא צמד ריאות והשעיות תא בודדות מהריאות. במקרה זה, אין אינפלציה היא הכרחית: לנתח את אונות ריאה הנותרות; אחזר אותם לבית החזה והמקום לצלחת גם 24 לחוצץ הנקס גם מכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורית קנה נשימה, נקיה על ידי שטיפה עם חיץ הנקס, לנקות מכשירי ניתוח. </li></ol> 5. ניתוח עקום לחץ שנוצר מצנתר הלב הימני נתוני הלחץ הוקלטו חדרית מנותחים באמצעות 7 תוכנת LabChart ללא כל ידע בזהות הקבוצתית של כל הקלטה. יותר מ 20 עקומות נבחרות באופן אקראי וההבדל בין לחץ מקסימאלי והמינימאלי של חדר לכל עקומה נמדד (ΔP). ΔP הממוצע מחושב לתת זכות vלחץ הסיסטולי entricular.

<ol>
	<li>Price, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Inflammation in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 141, 210-221 (2012).</li><li>Olschewski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathophysiology+and+therapy+of+pulmonary+hypertension.">Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension.</a> J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).</li><li>Hassoun, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+growth+factors,+and+pulmonary+vascular+remodeling.">Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).</li><li>Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension.</a> J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).</li><li>Steudel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+pulmonary+hypertension+and+right+ventricular+hypertrophy+after+chronic+hypoxia+in+mice+with+congenital+deficiency+of+nitric+oxide+synthase+3.">Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3.</a> J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).</li><li>Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+serine+elastase+inhibitor+elafin+protects+transgenic+mice+from+hypoxic+pulmonary+hypertension.">Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension.</a> Circulation. 105, 516-521 (2002).</li><li>Guignabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-mediated+loss+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+in+mice+causes+PDGF+receptor-beta-dependent+pulmonary+arterial+muscularization.">Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+transgenic+mice+expressing+a+dominant-negative+BMPRII+gene+in+smooth+muscle.">Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle.</a> Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).</li><li>Cook, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+eNO+and+pulmonary+iNOS+expression+in+eNOS+null+mice.">Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice.</a> Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+expressing+BMPR2R899X+transgene+in+smooth+muscle+develop+pulmonary+vascular+lesions.">Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+fibroblast+growth+factor-2+signaling+contributes+to+altered+endothelial+phenotype+in+pulmonary+hypertension.">Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).</li><li>Daley, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+arterial+remodeling+induced+by+a+Th2+immune+response.">Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response.</a> J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+endothelial+injury,+and+persistent+pulmonary+hypertension+in+heterozygous+BMPR2-mutant+mice.">Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).</li><li>Thibault, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+murine+pulmonary+arterial+pressure:+validation+and+application+to+models+of+pulmonary+hypertension.">Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension.</a> Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).</li><li>Otto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+and+right+heart+failure+in+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+type+I+receptor-deficient+mice.">Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice.</a> Circulation. 110, 3245-3251 (2004).</li><li>Burton, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+leukocyte+recruitment+via+CXCR1/2+inhibition+stops+the+progression+of+PAH+in+mice+with+genetic+ablation+of+endothelial+BMPR-II.">Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II.</a> Blood. 118, 4750-4758 (2011).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+TNF-alpha-overexpressing+mice+is+associated+with+decreased+VEGF+gene+expression.">Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression.</a> J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).</li><li>Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Short+Periods+of+Induced+Acute+Anoxia+Upon+Pulmonary+Artery+Pressures+in+Man.">The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man.</a> Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).</li><li>Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Pulmonary+Arterial+Blood+Pressure.">Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure.</a> Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).</li><li>Euler, U. S. V., Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+pulmonary+arterial+blood+pressure+in+the+cat.">Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat.</a> Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+prevents+hypoxic+pulmonary+hypertension+and+vascular+changes+in+rat.">Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat.</a> Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).</li><li>Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+pulmonary+circulation+after+chronic+hypoxia:+hemodynamic+and+structural+features.">Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features.</a> Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+pulmonary+blood+flow+affect+vascular+response+to+chronic+hypoxia+in+rats.">Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats.</a> Circ. Res. 52, 432-441 (1983).</li><li>Kugathasan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiopietin-1-Tie2+pathway+prevents+rather+than+promotes+pulmonary+arterial+hypertension+in+transgenic+mice.">The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice.</a> J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).</li><li>Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+tobacco+smoke+exposure+and+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).</li><li>Graham, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis-induced+experimental+pulmonary+hypertension:+role+of+interleukin-13+signaling.">Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling.</a> Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).</li><li>Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+disease+in+the+developing+world.">Pulmonary vascular disease in the developing world.</a> Circulation. 118, 1758-1766 (2008).</li><li>Crosby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Praziquantel+reverses+pulmonary+hypertension+and+vascular+remodeling+in+murine+schistosomiasis.">Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הזרימה הניסויית המתוארת כאן מאפשרת מדידה מהירה וסימולטני של לחץ הנכון חדרית סיסטולי וקציר של דגימות לניתוח התשובות בריאות, לב והמערכת החיסונית בעכברים. ההליך משלב מדידות לב פיזיולוגיה, מייקרו נתיחה וקציר רקמה הבאה ללימודים חיים תא, ניתוח היסטולוגית או omics-ניתוח של ה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> 2-מהתיל-2-butanol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2-Tribromoethanol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> סבון חיטוי (כיסוי תרסיס חפת בתוספת Steris) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 1629-08 </td><td></td></tr><tr><td> אתיל אלכוהול, 200 גהה, מוחלטת, נטולת מים ACS כיתה / USP </td><td> PHARMCO-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> לדלל עד 70% במים מזוקקים </td></tr><tr><td> פתרון פורמלדהיד </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> F1635-500 מ&quot;ל </td><td> מדולל ל7-10% פורםריכוז ldehyde בריכוז של PBS 1x באמצעות פתרון PBS מניות ומים </td></tr><tr><td> הנקס פתרון, לא סידן, מגנזיום </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> אוקטובר </td><td> רקמה-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין (10000 U / ml) / סטרפטומיצין (10,000 מ&quot;ג / מ&quot;ל) פתרון </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט (PBS), לא סידן, לא מגנזיום, פתרונות ו10x 1x </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 26% נתרן פנטוברביטל </td><td> לבריאות בעלי חי דודג&#39; פורט </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> צלחות 12, 24, 96 גם </td><td> בז </td><td></td><td></td></p&gt; <tr><td> Pipet העברה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 13-711-9BM </td><td></td></tr><tr><td> צינור, מצופה EDTA </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> 0.65 מיליליטר צינורות צנטריפוגה ומייקרו 1.7 מ&quot;ל </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 פוליפרופילן המ&quot;מ x 75 צינורות </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14-956-1D </td><td></td></tr><tr><td> צינורות, גדלים שונים, פוליפרופילן </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מכשירים </td></tr><tr><td> מלקחיים, Dumon # 5 פיין </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים, טיפים גרפו-0.5mm קנס נוספים מעוקלים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> המלקחיים, נוסף Fine-גרף 0.5mm טיפים ישרים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> צינורית 18ga, 19 ga </td><td> BD </td><td> מחטי Precision Glide </td><td> לחתוך לאורך אופטימלי, קהה ומחוץ צרם כדי ליצור משטח מחוספס מבחוץ </td></tr><tr><td> מספריים, להבי מספריים מבתרים-Slim 9cm </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> תפר לBAL, תפר משי קלוע, 4-0 </td><td> כלי מדע פיין </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> תפר לצנתור לב ימני, תפר משי קלוע, 6-0 </td><td> Teleflex רפואי </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק, 1 מ&quot;ל </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מגבר, PowerLab 4/30 </td&gt; <td> ADInstrument </td><td> דגם ML866 </td><td></td></tr><tr><td> קטטר, לחץ F1.4 </td><td> מילר מכשירים, Inc </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים, להבי מספרי Vannas האביב-2 מ&quot;מ </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> הלוגן מואר מגדלת קבלה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> מחשב נייד </td><td> Asus </td><td> מספר דגם מעבד i5 A52F; 15 אינץ </td><td></td></tr><tr><td> מקור אור </td><td> Amscope </td><td> HL-250 </td><td></td></tr><tr><td> יחידת בקרת לחץ </td><td> מילר מכשירים, Inc </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> תוכנה, Labchart-Pro V.7 </td><td> ספירה בstruments </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

תפקוד הלב הנכון הוא להזרים דם דרך הריאות, ובכך מקשר פיזיולוגית לב ימנית ופיזיולוגיה של כלי דם ריאתי. דלקת היא צירוף שכיח של תפקוד לב וריאות, על ידי חדירה לפרט סלולרית, ייצור ציטוקינים וגורמי גדילה, ועל ידי ייזום תהליכי שיפוץ 1. בהשוואה לחדר השמאלי, חדר ימין הוא משאבה בלחץ נמוך הפועלת באזור צר יחסי של שינויים בלחץ. לחצי עורק ריאה מוגברת קשורים ללחץ מוגבר במיטת כלי דם הריאה ויתר לחץ דם ריאתי 2. יתר לחץ דם ריאה קשור לעתים קרובות עם מחלות דלקתיות ריאה, למשל מחלת ריאות חסימתית כרונית, או מחלות אוטואימוניות 3. בגלל יתר לחץ דם ריאה מעניק פרוגנוזה גרועה לאיכות חיים ותוחלת חיים, הרבה מחקר מכוון להבנת המנגנונים שהמיגHT להיות מטרות להתערבות 4 תרופות. האתגר העיקרי לפיתוח של כלים לניהול יעילים עבור יתר לחץ דם ריאתי נשאר את המורכבות של ההבנה סימולטנית של שינויים מולקולריים ותאיים בלב הימני, ריאות ולמערכת החיסונית. כאן, אנו מציגים את זרימת פרוצדורליים למדידה המהירה ומדויקת של שינויים בלחץ בלב הימני של עכברים וקציר סימולטני של דגימות מלב, ריאות ורקמות חיסוניות. השיטה מבוססת על הצנתור הישיר של חדר ממני דרך וריד הצוואר בעכברים קרובים חזה, פותח לראשונה בסוף 1990 כמדד חלופי של לחצים בעורק הריאה 5-13. צוות הגישה המאורגנת מאפשרת טכניקת צנתור מהירה מאוד נכונה לב. זה מאפשר לבצע את המדידות בעכברים כי באופן ספונטני לנשום אוויר חדר. הארגון של זרימת העבודה באזורי עבודה שונים-מפחית את השהיית זמן ופותח את האפשרות במקביל לביצוע ניסויי פיזיולוגיה וקציר רקמות חיסוניים, לב וריאות. זרימת פרוצדורליים המתוארים כאן ניתן להתאים למגוון רחב של הגדרות במעבדה ועיצובי לימוד, מניסויים קטנים וממוקדים, למבחני מיון תרופות גדולים. הרכישה סימולטני של נתוני פיזיולוגית לב כי ניתן להרחיב לכלול אקו 5,14-17 וקציר של רקמות לב, ריאה וחיסון מפחיתה את מספר בעלי החיים הדרושים כדי להשיג נתונים שנעים בבסיס הידע המדעי קדימה. זרימת פרוצדורליים מוצגת כאן גם מספקת בסיס אידיאלי לרכישת ידע מהרשתות שהקישור, ריאות חיסוניות ותפקוד לב. את אותם עקרונות שהתוו כאן ניתן להתאים ללמוד איברים אחרים או נוספים במידת צורך.

התוצאה העיקרית להשגת עקומות לחץ לב ימניות מושגת על ידי המיקום הנכון של צנתר הלב הימני. הצורה של העקומות בזמן לחץ היא קריטית, כי המיקום הנכון של הצנתר בתוך של חדר ממני יגרום מישורי לחץ (איור 4). קימורים מחודדים, במקום, מצביעים קטטר שמועבר על ידי הנשימה או תנועת פ...

Watch this Scientific Journal Video about Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice at JoVE.com

מדידות לחץ סיסטולי בחדר ימין בשילוב עם קצירת דגימות ריאות ורקמות חיסוניות בעכברים | אימונולוגיה וזיהום | וִידֵאוֹ

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

פרוטוקול ספציפי ומהיר במקביל לחקירת פונקציה נכונה לב, דלקת ריאות, והתגובה החיסונית מתואר ככלי למידה. וידאו ודמויות מתארים פיזיולוגיה וטכניקות microdissection בצוות גישה מאורגנת שניתנת להתאמה לשימוש לקטן למחקרים בגודל גדולים.

מדידות נכונות חדרית סיסטולי לחץ בשילוב עם קציר של ריאה ודגימות רקמה חיסוניות בעכברים

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

right-ventricular-systolic-pressure-measurements-combination-with

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Human Biology

Circulatory and Pulmonary Systems

SCIENTISTS IN ACTION

25.0K Views.  New York University School of Medicine, Tuxedo. פרוטוקול ספציפי ומהיר במקביל לחקירת פונקציה נכונה לב, דלקת ריאות, והתגובה החיסונית מתואר ככלי למידה. וידאו ודמויות מתארים פיזיולוגיה וטכניקות microdissection בצוות גישה מאורגנת שניתנת להתאמה לשימוש לקטן למחקרים בגודל גדולים.

Video: Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

אינדוקציה של הפעלה האימהית חיסונית בעכברים בשלב אמצע הריון עם ויראלי לחקות פולי (אני: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

ניטור נויטרופילים אלסטאז וקטפסין G פעילות בדגימות כיח אנושי

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

הפרדת תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון בדגימות דם היקפיות מילדים עם מונונוקלאוזיס זיהומית

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.