מחקר זה נתמך על ידי מענקים בארה&quot;ב שירות בריאות ציבור AI69233 וAI073843 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. EPS הוא עמית בורוז Wellcome בפתוגנזה של מחלות זיהומיות. קמ&quot;ש מומן על ידי התאית ומולקולרית מיקרוביולוגיה הדרכת מענק תכנית 5 T32 A107611-10.

1. טיהור של המוגלובין מדם טרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש דם אדם טרי בתוספת נוגדי קרישה. לשמור על דם על קרח או ב 4 ° C בכל הטיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דם במשך 20 דקות ב1500 x גרם. תאי הדם האדומים (RBCs) יהיו בתחתית של התחתית. בזהירות לשאוב supernatant והעדינות resuspend גלול ב 0.9% (w / v) פתרון NaCl קר כקרח. חזור צנטריפוגה ולשטוף 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה בנפח 1 מתוך קרים כקרח 10 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 8.0). זה יניע תמוגה של RBCs עקב לחץ האוסמוטי. הוסף ל~ טולואן נפח סופי של 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 4 מעלות צלזיוס בצלייה למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב20000 XG לשעה 1. לאסוף את שבר hemolysate האמצע עוזב טולואן (צף על גבי) וגלולה ללא פגע. השתמש פיפטה-צוואר ארוך כדי לאסוף את שבר האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר דרך מסנן מזרק 0.44 מיקרומטר. אם הפתרון מכיל חלקיקיםעניין ולא יכול להיות מועבר דרך המסנן, חזור על שלב 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר המוגלובין (HB) עם כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהי עמודה (HPLC) אניון חליפין (ריאן, 1000 8 מיקרומטר PL-סקסופון, 150 מ&quot;מ × 4.6 מ&quot;מ). השלב הנייד הוא 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) ושלב ב &#39;נייד הם 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) + 0.5 M NaCl. 0% -100% שיפוע של B ממס נדרס 2 דקות בשיעור 2.0 מ&quot;ל / דקת זרימה. Elution מנוטר על בסיס קליטה (λ: 410 ננומטר ו 280 ננומטר). לאסוף רק השבריר מתאפיין בצבע אדום בהיר ושיא ספיגה בולט (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזת elution נגד פוספט נאגר מלוח (PBS) למשך הלילה ולאחר מכן לכמה שעות שוב. לעקר על ידי עובר דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את ריכוז המוגלובין, להכין פתרוני המוגלובין סטנדרטיים של ריכוזים ידועים בPBS. לקבוע את הריכוז של המוגלובין במדגם על ידי ערבוב את הפתרונים הסטנדרטיים (ראה טבלה עם ריאגנטיםed) או פתרון לדוגמא עם ריאגנט של 2x דרבקין (שהוכן מאבקה) ביחס 1:1. לדוגמה, לערבב פתרון Hb 100 μl עם מגיב 100 μl 2x של דרבקין בצלחות 96-כן. דגירה במשך 15 דקות וספיגה במידה 540 ננומטר. להתוות עקומת סטנדרט ולקבוע את ריכוז המוגלובין במדגם. חמש עד 15 תשואות מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​הן טיפוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוגרם 15-20 המטוהרים המוגלובין על 15% SDS-PAGE בשני עותקים. כתם אחד מהג&#39;לי; להעביר את החלבונים מג&#39;ל אחר על גבי קרום ניטרוצלולוזה וimmunoblot למוגלובין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא ולאחסן 1 aliquots מ&quot;ל של המוגלובין בחנקן נוזלי. </li></ol> 2. הכנת הברזל פוגע תקשורת צמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Roswell Park Memorial מכון (RPMI) מרק על ידי המסת אבקת RPMI במים, מוסיף סודה לשתייה כפי שהומלץ על ידי היצרן וחומצות cassamino% 1 (CA) (W / V). לעקר על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר והחנות refrigמקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מתכת מדולדלת RPMI (NRPMI) על ידי הוספת 7% (w / v) Chelex 100 וערבוב במשך הלילה על צלחת ומערבבים. הסר Chelex 100 על ידי עובר דרך מסנן וחנות בקירור 0.2 מיקרומטר. תוספת תקשורת עם מתכות שאינן ברזל חיוניים: 25 מיקרומטר ZnCl 2, 25 מיקרומטר MnCl 2, 100 מ&quot;מימ CaCl 2 ו1 המ&quot;מ MgCl 2 הוכן מראש כפתרון x סטרילי 1000. השתמש בכלי פלסטיק חד פעמים לצעד זה כדי למנוע זיהום מאספקת ברזל מחדש שמישה. </li></ol> 3. צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות המוגלובין כמקור ברזל Sole <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצף ס סטפילוקוקוס לבידוד באגר סויה tryptic (TSA) ממניות קפוא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ethylenediamine-N, ניצבת בין bis (חומצה 2-hydroxyphenylacetic) (EDDHA) באתנול נטול מים עד 100 מ&quot;מ. EDDHA אינו נכנס פתרון אבל מעוקרת על ידי אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לEDDHA RPMI לריכוז סופי של 0.5 מ&quot;מ. להתירEDDHA לפזר לפחות 30 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. עקב וריאציה תצווה לתצווה, ריכוז EDDHA סופי ייתכן שיהיה הצורך הוריד ל0.25 מ&quot;מ כדי לאפשר התפתחות חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבות בודדות של ס סטפילוקוקוס לתוך 5 מ&quot;ל של RPMI מכיל EDDHA ב15 צינורות חרוטי פקק מ&quot;ל. לדגור על 37 ° C עם הרעד ב180 סיבובים לדקה (סל&quot;ד) ל16-20 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תרבויות הלילה עבור 5 דקות ב7500 XG וresuspend בגלולה המכילה NRPMI EDDHA 0.5 מ&quot;מ. לנרמל OD 600 ל ~ 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן NRPMI המכיל 2.5 מיקרוגרם למ&quot;ל והמוגלובין EDDHA 0.1-1.0 מ&quot;מ. בשל שונות בין הקבוצות, ריכוז EDDHA נדרש Chelate ברזל חופשי בNRPMI עשוי להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl תת השעיה של חיידקים מצעד 3.5 לתוך 1 מ&quot;ל NRPMI + + EDDHA המוגלובין בצינור 15 מיליליטר פקק חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התרבויות על 37 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות עם הרעד ב180 סל&quot;ד או בתוף מתגלגל. </li><li&gt; כל 6-12 שעות תיקח 600 קריאות OD על ידי הסרת 50 μl של התרבות ולערבב אותו עם 150 μl של PBS בצלחות 96-כן. </li></ol>

<ol>
	<li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus.">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li><li>Pishchany, G., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+for+blood:+hemoglobin+as+a+nutrient+source+for+pathogens.">Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens.</a> PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).</li><li>Haley, K. P., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+battle+for+iron:+host+sequestration+and+Staphylococcus+aureus+acquisition.">A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition.</a> Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).</li><li>Krishna Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+hemoglobin+capture+by+Staphylococcus+aureus+cell-surface+protein.">Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein.</a> IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).</li><li>Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-coordinating+tyrosine+is+a+key+determinant+of+NEAT+domain+heme+transfer.">Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer.</a> Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).</li><li>Villareal, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+weak+protein-protein+complexes+transfer+heme+across+the+cell+wall+of+Staphylococcus+aureus.">Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).</li><li>Muryoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+the+iron-regulated+surface+determinant+(Isd)+heme+transfer+pathway+in+Staphylococcus+aureus.">Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).</li><li>Reniere, M. L., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+haem+oxygenases+are+differentially+regulated+by+iron+and+haem.">Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem.</a> Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+hemin+transfer+from+IsdA+to+IsdC+in+the+iron-regulated+surface+determinant+(Isd)+heme+acquisition+system+of+Staphylococcus+aureus.">Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).</li><li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection.">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).</li><li>Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+the+Staphylococcus+aureus+heme+iron+transport+components+IsdA+and+IsdB.">Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB.</a> Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).</li><li>Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+IsdB+is+a+hemoglobin+receptor+required+for+heme+iron+utilization.">Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization.</a> J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsdA+and+IsdB+antibodies+protect+mice+against+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+lethal+challenge.">IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge.</a> Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).</li><li>Cheng, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+requirements+for+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+persistence+in+host+tissues.">Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues.</a> Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).</li><li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+ions+in+biological+catalysis:+from+enzyme+databases+to+general+principles.">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li><li>Weinberg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+availability+and+infection.">Iron availability and infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).</li><li>Drabkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+Hemin+Chromoproteins.">Metabolism of the Hemin Chromoproteins.</a> Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).</li><li>Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD163:+a+signal+receptor+scavenging+haptoglobin-hemoglobin+complexes+from+plasma.">CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 34, 309-314 (2002).</li><li>Torres, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Fur+regulates+the+expression+of+virulence+factors+that+contribute+to+the+pathogenesis+of+pneumonia.">Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia.</a> Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).</li><li>Hammer, N. D., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+of+Staphylococcus+aureus+Iron+Acquisition.">Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition.</a> Annu. Rev. Microbiol. , (2011).</li><li>Hurd, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iron-regulated+surface+proteins+IsdA,+IsdB,+and+IsdH+are+not+required+for+heme+iron+utilization+in+Staphylococcus+aureus.">The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus.</a> Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).</li><li>Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+behavior+of+hemoglobin+alpha-+and+beta-+subunits+during+acid-induced+denaturation+observed+by+electrospray+mass+spectrometry.">Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry.</a> Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).</li><li>Williams, R. C., Tsay, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+chromatographic+method+for+the+preparation+of+human+hemoglobin.">A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin.</a> Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).</li><li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli.">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li><li>Manjula, B. N., Acharya, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+molecular+analysis+of+hemoglobin+by+high-performance+liquid+chromatography.">Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography.</a> Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).</li><li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+envelope+proteins+related+to+iron.">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li><li>Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulated+outer+membrane+proteins+of+Escherichia+coli:+variations+in+expression+due+to+the+chelator+used+to+restrict+the+availability+of+iron.">Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron.</a> Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).</li><li>Rogers, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-Binding+Catechols+and+Virulence+in+Escherichia+coli.">Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

ברזל הוא חומר מזין חיוני הנדרש על ידי אורגניזמים מכל הממלכות של 15 חיים. בבעלי חוליות, ברזל מבודד את להימנע מרעילות הנגרמת על ידי רכיב זה. תפיסה זו גם מסתירה ברזל מפלישת חיידקים בתהליך המכונה חסינות תזונתית 16. בתגובה, פתוגנים התפתחו אסטרטגיות עוקפות חסינות ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> טור חילופי אניון HPLC </td><td> ריאן </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> המגיב של דרבקין </td><td> סיגמא </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> סטנדרטי המוגלובין </td><td> פואנטה מדעית </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> צורת נתרן Chelex 100 </td><td> סיגמא </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC התקנים GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> המוגלובין נוגדן </td><td> סנט קרוז ביוטכנולוגיה, Inc </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> אגר סויה Tryptic </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus growth using human hemoglobin as an iron source

ס aureus הוא חיידק הפתוגני שדורש ברזל כדי למלא תפקידים מטבוליים חיוניים ובגורמים למחלות. המאגר העשיר ביותר של ברזל בתוך המארח האנושי הוא heme, שהוא cofactor של המוגלובין. לרכישת ברזל מהמוגלובין, ס סטפילוקוקוס מנצל מערכת מורכבת ידועה כגורם המשטח ברזל המוסדר (ISD) 1 המערכת. מרכיבי ההמוגלובין ISD המערכת הראשון לאגד המארח, ואז לחלץ ולייבא heme, ולבסוף לשחרר ברזל ממקור צמחי בציטופלסמה החיידקים 2,3. מסלול זה כבר נתח באמצעות מספר רב של מחקרים במבחנת 4-9. יתר על כן, תרומתה של מערכת ISD לזיהום הודגמה שוב ושוב במודלי עכבר 8,10-14. הקמת התרומה של מערכת ISD לרכישת ברזל המוגלובין-נגזר וצמיחה הוכיחה להיות יותר מאתגר. מבחני צמיחה באמצעות ההמוגלובין כמקור ברזל בלעדי מסובכים בy חוסר היציבות של המוגלובין הזמין מסחרי, מזהם ברזל חופשי במדיום הגידול, והרעילות הקשורה chelators ברזל. כאן אנו מציגים שיטה המתגברת על מגבלות אלה. המוגלובין באיכות הגבוהה מוכן מדם טרי ומאוחסן בחנקן נוזלי. המוגלובין מטוהר הוא בתוספת ברזל לימוצה בינוני מחקה את סביבת ברזל העניים נתקלה ידי פתוגנים בתוך מארח החוליות. על דרך רעבה ס סטפילוקוקוס של ברזל חופשי ולהשלים עם צורת מניפולציות מינימאליות של המוגלובין נזרז את הצמיחה באופן שתלוי לחלוטין ביכולת לקשור המוגלובין, לחלץ heme, יעבור heme דרך מעטפת תא החיידק ולבזות heme בציטופלסמה. assay זה יהיה שימושי לחוקרים המבקשים להבהיר את המנגנונים של רכישת הברזל hemoglobin-/heme-derived בס סטפילוקוקוס ואולי חיידקים פתוגנים אחר.

יש לנו מטוהר ההמוגלובין אנושי מhemolysate עם HPLC (צעד הפרוטוקול 1.7). איור 1 הקלטות ספיגת eluate ב 280 ואורכי גל 410 ננומטר. חלק 5 נאסף ומקטעים אחרים שנזרקו. תשואות של 5-15 מיליגרם של המוגלובין למ&quot;ל של eluate נרכשות בדרך כלל. המוגלובין מטוהר נותח על ידי SDS-PAGE במשוכפל וג&#39;לים היה...

Watch this Scientific Journal Video about Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source at JoVE.com

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

כאן אנו מתארים assay צמיחה<em&gt; סטפילוקוקוס אוראוס</em&gt; באמצעות ההמוגלובין כמקור היחידי של ברזל תזונתי זמין. בדיקה זו קובעת את התפקיד של גורמי חיידקים המעורבים ברכישת ברזל המוגלובין נגזר.

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

16.5K Views.  Vanderbilt University Medical School. כאן אנו מתארים assay צמיחה סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין כמקור היחידי של ברזל תזונתי זמין. בדיקה זו קובעת את התפקיד של גורמי חיידקים המעורבים ברכישת ברזל המוגלובין נגזר.

Video: Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Biochemistry

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג&#39;ין<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes (PMNs or neutrophils). This protocol describes both the purification of human PMNs and the quantification of S. aureus cytotoxicity against PMNs in three different sections. Section 1 details the isolation of PMNs and serum from human blood using density centrifugation. Section 2 tests the cytotoxicity of extracellular proteins produced by S. aureus against these purified human PMNs. Section 3 measures the cytotoxicity against human PMNs following the phagocytosis of live S. aureus. These procedures measure disruption of PMN plasma membrane integrity by S. aureus leukocidins using flow cytometry analysis of PMNs treated with propidium iodide, a DNA binding fluorophore that is cell membrane impermeable. Collectively, these methods have the advantage of rapidly testing S. aureus cytotoxicity against primary human PMNs and can be easily adapted to study other aspects of host-pathogen interactions.

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

This protocol describes a method for the purification of polymorphonuclear leukocytes from whole human blood and two distinct assays that quantify the cytotoxicity of Staphylococcus aureus against these important innate immune cells.

ככמת את רעילות הציטוהילווקיוס האורמית נגד פולימורציטים אנושיות

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands

Trace metals such as iron and zinc are vital nutrients known to play key roles in prokaryotic processes including gene regulation, catalysis, and protein structure. Metal sequestration by hosts often leads to metal limitation for the bacterium. This limitation induces bacterial gene expression whose protein products allow bacteria to overcome their metal-limited environment. Characterization of such genes is challenging. Bacteria must be grown in meticulously prepared media that allows sufficient access to nutritional metals to permit bacterial growth while maintaining a metal profile conducive to achieving expression of the aforementioned genes. As such, a delicate balance must be established for the concentrations of these metals. Growing a nutritionally fastidious organism such as Neisseria gonorrhoeae, which has evolved to survive only in the human host, adds an additional level of complexity. Here, we describe the preparation of a defined metal-limited medium sufficient to allow gonococcal growth and the desired gene expression. This method allows the investigator to chelate iron and zinc from undesired sources while supplementing the media with defined sources of iron or zinc, whose preparation is also described. Finally, we outline three experiments that utilize this media to help characterize the protein products of metal-regulated gonococcal genes.

Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands

We describe here a method for growth of Neisseria gonorrhoeae in metal-restricted liquid medium to facilitate the expression of genes for metal uptake. We also outline downstream experiments to characterize the phenotype of gonococci grown in these conditions. These methods may be adapted to be suitable for characterization of metal-responsive genes in other bacteria.

מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של ניציבטיים לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס

Trace metals such as iron and zinc are vital nutrients known to play key roles in prokaryotic processes including gene regulation, catalysis, and protein ...

T3SS Activity in Yersinia pseudotuberculosis Under Iron Depletion & Anaerobic Stress

Quantifying Yersinia pseudotuberculosis Type III Secretion System Activity Following Iron Starvation and Anaerobic Growth

A key virulence mechanism for many Gram-negative pathogens is the type III secretion system (T3SS), a needle-like appendage that translocates cytotoxic or immunomodulatory effector proteins into host cells. The T3SS is a target for antimicrobial discovery campaigns since it is accessible extracellularly and largely absent from non-pathogenic bacteria. Recent studies demonstrated that the T3SS of Yersinia and Salmonella are regulated by factors responsive to iron and oxygen, which are important niche-specific signals encountered during mammalian infection. Described here is a method for iron starvation of Yersinia pseudotuberculosis, with subsequent optional supplementation of inorganic iron. To assess the impact of oxygen availability, this iron starvation process is demonstrated under both aerobic and anaerobic conditions. Finally, incubating the cultures at the mammalian host temperature of 37 &#176;C induces T3SS expression and allows quantification of Yersinia T3SS activity by visualizing effector proteins released into the supernatant. The steps detailed here offer an advantage over the use of iron chelators in the absence of iron starvation, which is insufficient for inducing robust iron starvation, presumably due to efficient Yersinia iron uptake and scavenging systems. Likewise, acid-washing laboratory glassware is detailed to ensure the removal of residual iron, which is essential for inducing robust iron starvation. Additionally, using a chelating agent is described to remove residual iron from media, and culturing the bacteria for several generations in the absence of iron to deplete bacterial iron stores. By incorporating standard protocols of trichloroacetic acid-induced protein precipitation, SDS-PAGE, and silver staining, this procedure demonstrates accessible ways to measure T3SS activity. While this procedure is optimized for Y. pseudotuberculosis, it offers a framework for studies in pathogens with similar robust iron uptake systems. In the age of antibiotic resistance, these methods can be expanded to assess the efficacy of antimicrobial compounds targeting the T3SS under host-relevant conditions.

Bacteria colonize host tissues that vary in oxygen and iron bioavailability, yet most approaches to studying bacteria use aerated, rich media. This protocol describes culturing the human pathogen Yersinia pseudotuberculosis under varying iron concentrations and oxygen tension, and quantifying activity of the Yersinia type III secretion system, which is an important virulence factor.

A key virulence mechanism for many Gram-negative pathogens is the type III secretion system (T3SS), a needle-like appendage that translocates cytotoxic or ...

<meta charset="utf8"></head><body>מודלים ממוטבים in vivo למחקרי זיהום תוך-תאיים של S. aureus

Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus

S. aureus can invade and persist within host cells, including immune cells, which allows it to evade immune detection and clearance. This intracellular persistence contributes to chronic and recurrent infections, complicating treatment and prolonging the disease. Consequently, there is a critical need for an intracellular infection model to better understand, prevent, and treat infections caused by S. aureus. This study indicated that antibiotics effectively eliminated extracellular bacteria but could not eradicate those that had entered the cells. Thus, a stable intracellular infection in vitro was established by RAW264.7 infected with S. aureus and co-culturing them with antibiotics. Subsequently, an intracellular infection model in mice was established by injecting peritoneal macrophages containing the intracellular infection. Vancomycin effectively cleared bacterial loads in mice challenged with planktonic S. aureus; however, it was ineffective against mice infected with equal or lower levels of intracellular bacteria within the peritoneal macrophages. This indicates that the intracellular infection model of S. aureus was successfully established, offering potential insights for the prevention and treatment of intracellular infections.

<meta charset="utf8"></head><body>פיתוח והערכה של מודלים של זיהום תוך-תאי לסטפילוקוקוס זהוב

Staphylococcus aureus (S. aureus) has the capability to disseminate throughout the body, causing persistent and recurrent infections. To better understand these processes, this study establishes an intracellular infection model for S. aureus. This model will provide a crucial foundation for investigating the mechanisms behind intracellular infections.

פיתוח והערכה של מודלים של זיהום תוך-תאי לסטפילוקוקוס זהוב

S. aureus can invade and persist within host cells, including immune cells, which allows it to evade immune detection and clearance. This intracellular ...

Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds

Staphylococcus aureus expresses virulence factors to trigger its internalization into eukaryote cells and to survive inside different subcellular compartments. This paper describes an enzyme protection assay to study the extent of S. aureus internalization and its intracellular survival in adherent non-professional phagocytic cells (NPPCs) as well as the intracellular efficacy of antimicrobial compounds. NPPCs are grown in a multi-well plate until they reach 100% confluence. S. aureus cultures are grown overnight in cell culture medium. The bacterial suspension is diluted according to the number of cells per well to inoculate the cells at a controlled multiplicity of infection. Inoculated cells are incubated for 2 h to allow the bacteria to be internalized by the NPPCs, following which lysostaphin is added to the culture medium to selectively kill extracellular bacteria. Lysostaphin is present in the culture medium for the rest of the experiment. 
At this point, the infected cells could be incubated with antimicrobial compounds to assess their intracellular activities against S. aureus. Next, the cells are washed three times to remove the drugs, and intracellular S. aureus load is then quantified by culturing on agar plates. Alternatively, for studying staphylococcal virulence factors involved in intracellular survival and cell toxicity, lysostaphin could be inactivated with proteinase K to eliminate the need for washing steps. This tip improves the reliability of the intracellular bacterial load quantification, especially if cells tend to detach from the culture plate when they become heavily infected because of the multiplication of intracellular S. aureus. These protocols can be used with virtually all types of adherent NPPCs and with 3D cell culture models such as organoids.

Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds

This protocol aims to describe how to study the extent of Staphylococcus aureus internalization and its ability to survive inside the human host cell, as well as the intracellular efficacy of antimicrobial compounds.

שיפור הגנה מפני אנזימים כדי לחקור הפנמת Staphylococcus aureus ויעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית

Staphylococcus aureus expresses virulence factors to trigger its internalization into eukaryote cells and to survive inside different subcellular ...

Biology

הערכה של ייצור סידרופור מבודד Pseudomonas aeruginosa

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such mechanism is the scavenging of iron through siderophore production. P. aeruginosa produces two different siderophores: pyochelin, which has lower iron-chelating affinity, and pyoverdine, which has higher iron-chelating affinity. This report demonstrates that pyoverdine can be directly quantified from bacterial supernatants, while pyochelin needs to be extracted from supernatants before quantification.
The primary method for qualitatively analyzing siderophore production is the Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agar plate assay. In this assay, the release of CAS dye from the Fe3+-Dye complex leads to a color change from blue to orange, indicating siderophore production. For the quantification of total siderophores, bacterial supernatants were mixed in equal proportions with CAS dye in a microtiter plate, followed by spectrophotometric analysis at 630 nm. Pyoverdine was directly quantified from the bacterial supernatant by mixing it in equal proportions with 50 mM Tris-HCl, followed by spectrophotometric analysis. A peak at 380 nm confirmed the presence of pyoverdine. As for Pyochelin, direct quantification from the bacterial supernatant was not possible, so it had to be extracted first. Subsequent spectrophotometric analysis revealed the presence of pyochelin, with a peak at 313 nm.

מחבר זרקור: כימות סידרופורים ופיוצ'לין לבקרת זיהומים 

This protocol provides both qualitative and quantitative analyses of total siderophores, pyoverdine, and pyochelin from Pseudomonas aeruginosa.

ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט

מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג'ין

ככמת את רעילות הציטוהילווקיוס האורמית נגד פולימורציטים אנושיות

מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של ניציבטיים לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס

Quantifying Yersinia pseudotuberculosis Type III Secretion System Activity Following Iron Starvation and Anaerobic Growth

פיתוח והערכה של מודלים של זיהום תוך-תאי לסטפילוקוקוס זהוב

פיתוח והערכה של מודלים של זיהום תוך-תאי לסטפילוקוקוס זהוב

פיתוח והערכה של מודלים של זיהום תוך-תאי לסטפילוקוקוס זהוב

שיפור הגנה מפני אנזימים כדי לחקור הפנמת Staphylococcus aureus ויעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית

ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa