עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome (WT 0,795,880).

פרוטוקול הבא יתאר את המחקר של הפלישה תא האנדותל ש &#39; aureus אבל תיאורטית יכול לשמש כדי ללמוד הפלישה הסלולר על ידי חיידק כלשהו culturable. ספציפית ס שלבים בתאי האנדותל aureus ו מסומנים. 1. הכנה של חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות S. aureus זנים של 4-16 שעות (תלוי שלב הצמיחה חובה) ב 10 Brain-Heart מרק מ&quot;ל (BHI) עירוי ב 37 מעלות צלזיוס באוויר עם רועד בסל&quot;ד 200. אלה התנאים לצמיחה הן ספציפיות עבור ס aureus ו - ייתכן שיהיה צורך להתאים לחיידקים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיידקים שלוש פעמים בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM; Invitrogen) על ידי סיבובים חלופי של צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (5000 x גרם, 10 דקות), הסרת supernatant התרבות resuspension של גלולה חיידקי בהיקף שווה ערך של DMEM. מדוד את צפיפות אופטית של ההשעיה של חיידקים וכתוצאה מכך אשר לאחר מכן ניתן להתאים לפי הצורך. עבור ס aureus, אנו מכינים השעיה על OD 600 = 1, אשר מתאים ~ 10 9 CFU -1 מ&quot;ל. </li></ol> 2. תא האנדותל תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות קו תא האנדותל EA.hy926 1 ב DMEM בתוספת העובר שור בסרום (FBS; 10%) ו-L-גלוטמין (2 mM) ב 37 ° C ב 5% CO 2. לחלופין, ונקווה העיקרי האדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) ניתן לרכוש Lonza (באזל, שווייץ) ו בתרבית בינוני הבסיס אנדותל בתוספת 2% FBS, תמצית מוח שור (כולל הפרין), גדילה אנושי גורם האנדותל הידרוקורטיזון ב 37 מעלות 5% CO 2 על פי ההוראות של היצרן (Lonza). אלה התנאים לצמיחה ספציפיים עבור תאים אלה ייתכן שיהיה צורך להתאים את סוגי תאים אחרים המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול לתאי אנדותל ב T75 צלוחיות להשלים confluency, מאומת על ידי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את 24 גם צלחות להכנסה של coverslips. מלקחיים פיין (להבה מעוקרים) יש צורך להעביר את coverslips, אשר יש משטח אחד מבריק אטום אחת. המקום coverslips בבארות של צלחת 24 היטב עם משטח אטום כלפי מעלה כדי לאפשר התקשרות לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את התאים מן הבקבוק T75 עם 3 מ&quot;ל טריפסין-EDTA (0.25%), ולהוסיף 10 מ&quot;ל של המדיום תרבות הרלוונטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של תאים resuspended ל 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox זכוכית. אחת T75 בקבוק ומחוברות של תאים תאים סיפק מספיק עבור שני 24 גם צלחות, וכתוצאה מכך כ 5 × 10 5 תאים לכל טוב (בינוני 500 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות עבור 48 שעות כפי שתואר לעיל, ולוודא 100 תא% confluency על ידי מיקרוסקופ אור הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים לשטוף coverslips ב PBS ולהוסיף 24 גם צלחות חדשות המכילות 490 DMEM μl FBS המכיל 10% בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את תפקידה של תהליכים מטבוליים ספציפיים הפלישה התא, מעכבי ניתן להוסיף תאים בתרבית 1 שעות לפני תוספת של חיידקים בריכוזים נשמר במהלך assay. לדוגמה, כדי לקבוע את התפקיד של סידור מחדש של אקטין ס הפלישה aureus של בתאי האנדותל, 50 מיקרומטר cytochalasin D ניתן להוסיף, או לתפקיד של caveolae, 5 מ&quot;מ methyl-β-cyclodextrin ניתן להוסיף. </li></ol> 3. הפלישה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של חיידקים שטף (וכתוצאה מכך כ 2 × 10 7 CFU מ&quot;ל aureus -1 ס) זה טוב המכיל coverslip שטף בשכבה ומחוברות של בתאי האנדותל ב 490 DMEM μl המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 15-90 דקות 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את המספר הכולל של חיידקים הקשורים התאים (חסיד והפנימו), לטבול, לשטוף את coverslips שלוש פעמים PBS ולהוסיף בארות טרי המכיל 500 טריטון 0.5% μl X-100 ב PBS. כדי להבטיח את התאים באופן מלא lyse ולשחרר את כל החיידקים הפנימו, פיפטה מספר פעמים, מצביע על קצה פיפטה ישירות על פני השטח של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת החיידקים על ידי ציפוי ההשעיה נוזלי (או דילולים זה במידת הצורך) על פני השטח של צלחות TSA. מאז TX-100 יהיה lyse רבים חיידקים גראם שליליים, saponin יכול לשמש במקום 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את מספר החיידקים הפנימו, להסיר את supernatant תרבות מכל המכיל חיידקים מאוגד היטב ולהחליף 500 μl DMEM/10% FBS בתוספת 200 מיקרוגרם מ&quot;ל -1 גנטמיצין. אנו משתמשים באופן שגרתי גנטמיצין ולא lysostaphin כאן כפי שהוא זול יותר מאפשר לנו לעבור בין הניסויים באמצעות סוגים שונים של חיידקים (למשל Staphylococci ו Lactococci) מבלי לשנות את פרוטוקול הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 דקות 60 להרוג את כל החיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3 פעמים PBS,lyse ו למנות על ידי ציפוי על גבי ה-TSA, כמתואר עבור assay את הידבקות לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים זה עשוי להיות עדיף על פני חזותית לספור את מספר החיידקים באמצעות מיקרוסקופ אור. במקרה זה, והן ספציפיות ס תא הפלישה aureus, להשתמש lysostaphin (10 מיקרוגרם מ&quot;ל -1) במקום גנטמיצין פיזית להשמיד את החיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עבור 20min ב 37 ° C ב-CO 2 בתמיסה lysostaphin, ולאחר מכן לשטוף ולתקן עם Cytopath (Cellpath). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבול coverslips עם קריסטל סגול (0.5% w / v) עבור 5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים לשטוף במים, האוויר יבש לעלות על שקופיות הזכוכית. מספר חיידקים לכל מ&quot;מ 2 של בתאי האנדותל ומחוברות ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור. </li></ol> 4. נציג תוצאות: ביטוי של חלבונים מחייב פיברונקטין (FnBPA ו FnBPB) על פני השטח של ס aureus מקנה את היכולת לפלוש לתאי אנדותל. מחקר שנערך לאחרונה מחדש את תחום פיברונקטין מחייב של FnBPA 3. Wild-type (WT) ס aureus 8325.4 פולש לתאי אנדותל עם יעילות גבוהה, תוך זן חסר הן FnBPA ו-B (Δ fnb) הראו רמות נמוכות משמעותית של internalisation (איור 1A). השלמה של מוטנטים עם fnb קידוד פלסמיד מינוס תחום פיברונקטין מחייבים (pFnR0) לא לקדם פלישה (איור 1A). לעומת זאת, השלמה של מוטנטים בקידוד פלסמיד fnb כל הגן (pFnBA4) משוחזר הפלישה לרמות WT (איור 1A). תפקידה של FnBPA בפלישה תא האנדותל יכול להיות גם הדגימו באמצעות לארח את הביטוי Heterologous lactis Lactococcus. ביטוי של הפלסמיד המקודד FnBPA ב L. lactis (pRM9 9) לא לשפר באופן משמעותי את הידבקות לתאי אנדותל לעומת חיידקים להביע שום FnBPA (CTL) (ברים פתוחים, 1B איור). לעומת זאת, ל-לבטא FnBPA lactis פלשו לתאי אנדותל ברמות גבוהות משמעותית המתח לא הביע (ברים סגור, 1B איור). הניסויים בוצעו ארבע פעמים כפולות סטיית תקן ממוצע ± מוצג. * מייצגים נתונים שאינם שונים באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית (p = &lt;0.05) מ WT או ערכים CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הפלישה של EA. Hy926 לתאי אנדותל ש &#39; aureus (א) או ל lactis (B).

<ol>
	<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li><li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells.">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li><li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper.">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li><li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics.">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria.">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li><li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells.">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li><li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li><li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA.">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li><li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li><li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li><li>Schr&#246;der, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells.">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li><li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells.">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<html> Assay אנו מתארים מבוסס על assay ההגנה גנטמיצין, אשר נמצאת בשימוש נרחב כדי ללמוד את הפלישה של תאים לארח על ידי חיידקים. תצפיות של חוסר היכולת של אנטיביוטיקה גנטמיצין אחרים כדי להרוג חיידקים תאיים נוצלו במחקרים מוקדם הפלישה של תאים לארח על ידי חיידקים 4-8. השימוש של 24, 48 או אפילו 96-היטב צלחות מאפשרת את הדור של כמויות גדולות של נתונים כמותיים לשחזור בתקופה קצרה של זמן ובעלות נמוכה יחסית. Assay היא גם מושכת משום שהיא אינה מצריכה ציוד מומחה, זה יכול להיות מותאם לעבודה עם חיידקים ותאים שונים, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד את התפקיד של תהליכים בתא שני חיידקים מארח בפלישה 9. ואכן, מאז הניסויים המוקדמים, assay ההגנה גנטמיצין הועסק נרחב כדי למדוד תא הפלישה לארח על ידי מגוון של חיידקים שונים או אפילו שילוב של חיידקים 10,11. בעוד עקרונות הליבה זהים, שינויים קלים רבים בשיטת דווחו. במאמר זה תיארנו גרסה שלנו המצוין בו שינויים עשוי להיות נחוץ עבור חיידקים אחרים או לתאי המארח. בעת תכנון ניסוי כדי למדוד את התא המארח הפלישה שימוש בגישה זו יש מספר נקודות חשובות שיש לשקול: רגישות חיידקים גנטמיצין. זה אולי נראה מובן מאליו, אבל חשוב לוודא את החיידק הנלמד רגיש גנטמיצין בטמפרטורת הריכוז, על משך הזמן לשמש. במקרה של רגישות, יתכן שניתן יהיה להשתמש באנטיביוטיקה אחרת 5. גישה חלופית ניתן להשתמש אנזימים ממס (lysostaphin, mutanolysin, ליזוזים) 12. דגירה ו inoculum. כאשר ביצוע assay בפעם הראשונה חשוב לקבוע את הזמנים הדגירה אופטימלית inoculum חיידקי לשמש. לכן, הניסויים הראשוניים צריכה לבחון הן את הידבקות הפלישה לאורך זמן (5 דקות של עד 6 שעות). חשוב גם להעריך כיצד הפלישה מושפע ריבוי של זיהום (משרד הפנים, מספר החיידקים לכל תא). באופן כללי עדיף להשתמש במספר הנמוך ביותר של חיידקים האפשרי זה יצמצם נזק תאים בתרבית. הבדלים חשובים בין זנים עשוי לפספס אם תקופות דגירה ממושכת או inocula גדולים משמשים 9,13. נזק נייד. חשוב לשטוף את החיידקים לפני השימוש. עם זאת, הנזק התאי אינו מוגבל ייצור הרעלן. פלישה חיידקית, אינדוקציה של אפופטוזיס והפרעה תפקודים תאיים נורמליים יכולים לגרום נזק הסלולר. זה יכול להוביל חדירה של גנטמיצין לתוך התא, להרוג חיידקים הפנימו ולתת את הרושם כי הפלישה לא קרה 14. תנאי דגירה. הטמפרטורה ועל ההרכב של המדיום התרבות יכולה להיות השפעה משמעותית על הפלישה. למשל, פלישה של תאים על ידי הלה pyogenes סטרפטוקוקוס תלוי בנוכחות של פיברונקטין מסיסים, שהוא בדרך כלל קיים בסרום 15. שיקול נוסף הוא התפתחות חיידקים במדיום תרבות במהלך הניסוי. תרבות וכימות של חיידקים תוך תאיים. למרות TX-100 לא יכול להרוג חיידקים תאיים, היא עלולה לעכב את הצמיחה שלהם. ככזה, הוא חשוב לבדוק שכפול חיידקים על התקשורת מוצק בנוכחות של חומרי ניקוי. איפה השפיע, יתכן שניתן יהיה להשתמש בריכוז נמוך יותר של חומר ניקוי או להשתמש אלטרנטיבה כגון saponin. היתרון של assay הגנה גנטמיצין על מכתים את סגול קריסטל assay מיקרוסקופיה היא כי פחות עבודה אינטנסיבית, והוא מאפשר איתור בידול של תת אוכלוסיות של חיידקים הפנימו. לדוגמה, ס &#39; aureus יכול לייצר או סוג המושבה רגילה (NCT) או גרסה מושבה קטנה (SCV) 16, אשר לא יהיה להבחין באמצעות מיקרוסקופ בתאי חיידקים בודדים. היתרון של מכתים את סגול קריסטל assay assay במיקרוסקופ על ההגנה גנטמיצין היא clumping התא ניתן להסביר וכי חיידקים תאיים כי הזן &#39;קיימא אבל לא culturable &quot;המדינה יזוהו 17. בחינת התפקיד של תהליכי התא המארח בפלישה חיידקי. מחקרים רבים המועסקים מעכבי תפקוד התא המארח כגון cytochalasin D, אשר מפריעה התארגנות אקטין. מחקרים כאלה יכולים לכלול גם נוגדנים היעד על פני קרום התא קולטנים מציאה siRNA של גנים ספציפיים 18. חשוב וחיוני על מנת להבטיח כי טיפולים אלה אינם משפיעים על כדאיות או עיקול של תאים בתרבית או להיות השפעה רעילה על חיידקים. העתיד כיוונים: &quot;&gt; ontent בגלל זה assay מבוצע בדרך כלל רב גם צלחות תרבית תאים, זה אפשרי תיאורטית להתאים אותה פעולה תפוקה גבוהה הקרנה, אשר עשויה לכלול בחינה של ספריות של התא לתפקד מעכבי פוטנציאל, אנטי infectives או אנטיביוטיקה נועדה למקד חיידקים תוך תאיים. לחילופין, גישה כזו יכולה לשמש מסך ספריות מוטציה לזהות גנים המעורבים הידבקות, פלישה או הישרדות תאיים. במקרים מסוימים זה עשוי להיות רצוי לכלול כוחות גזירה (זרימה) במערכת מודל, למשל כאשר הדוגמנות האנדותל, כדי לחקות באופן הדוק יותר בסביבת vivo. מקדמות שוטפות בעיצוב וייצור של תאים זרימה microfluidic התרבות מערכות תא לספק את האפשרות של העסקת assay הגנה גנטמיצין in-host הפתוגן מודלים המשלבים כוחות גזירה. לסיכום, פרוטוקול המתואר כאן מבוסס על גישות דומות בשימוש במשך שנים רבות. זה נרחב החלים על סוגים רבים של תאים בתרבית מינים חיידקים יכולים לייצר כמויות גדולות של נתונים במהירות ובעלות נמוכה יחסית.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31885-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brain heart infusion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioChemika</td>
<td>53286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HUVECs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-2519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endothelial basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-3121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine brain extract (including heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human endothelial growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4017C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4035C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GA-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysostaphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMBI</td>
<td>LSPN-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermanox coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>TKT-210-330P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytopath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCS Biosciences</td>
<td>HC8595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystal violet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>430641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochalasin D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl-B-cyclodextrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>332615</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

להלן נתאר כיצד אנחנו לומדים את הפלישה לתאי אנדותל אנושיים על ידי Staphylococcus aureus חיידקים פתוגנים. פרוטוקול כללי ניתן ליישם מחקר של הפלישה תא החיידק על ידי כמעט כל culturable. שלבי בו היבטים ספציפיים של הפלישה ניתן ללמוד, כגון תפקידה של התארגנות אקטין או caveolae, יהיו מודגשות. תאים מארח מגדלים צלוחיות וכאשר מוכן לשימוש הן seeded לתוך 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox. שימוש coverslips מאפשר הסרת הבאים של התאים מבארות כדי להפחית מהפרעות חלבונים בסרום מופקדים על הצדדים של בארות (אשר S. aureus היה לצרף). חיידקים גדלים לצפיפות הנדרשת ושטף כדי להסיר כל החלבונים המופרשים (רעלים למשל). Coverslips בשכבות ומחוברות של בתאי האנדותל מועברים 24 גם צלחות חדשות המכילות בינוני תרבות טרי לפני תוספת של חיידקים. חיידקים ותאים מודגרת אז יחד סכום נדרש זמן של 5% CO 2 ב 37 ° C. עבור ס aureus זה הוא בדרך כלל בין 15-90 דקות. Coverslips Thermanox יוסרו גם כל לטבול לרחוץ PBS להסיר חיידקים פנויות. אם חיידקים הקשורים הכולל (חסיד והפנימו) יש לכמת, coverslips ממוקמות אז גם טרי המכיל טריטון 0.5% X-100 ב PBS. Pipetting עדין מוביל להשלים תמוגה תאים וחיידקים הם המנויים על ידי דילול ציפוי סדרתי על אגר. אם מספר חיידקים פלשו התאים נדרשת, coverslips מתווספים בארות המכיל 500 ברקמת μl תרבות בינוני בתוספת גנטמיצין ו הדגירה נמשך 1 שעה, אשר יהרגו את כל החיידקים חיצוני. Coverslips אז יכול להיות שטף, lysed תאים וחיידקים המנויים על ידי ציפוי על אגר כמתואר לעיל. אם הניסוי דורש ראיה ישירה, coverslips ניתן לתקן ומוכתמת עבור במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי או confocal או מוכן במיקרוסקופ אלקטרונים.

Watch this Scientific Journal Video about Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

פרוטוקול כללית לחקר פלישה של תאים לארח על ידי פתוגן חיידקי, תוך התמקדות<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; ותאי האנדותל האדם.

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.7K Views.  University of Bath. פרוטוקול כללית לחקר פלישה של תאים לארח על ידי פתוגן חיידקי, תוך התמקדות Staphylococcus aureus ותאי האנדותל האדם.

Video: Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי<em&gt; במבחנה</em&gt; באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.