עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome (WT 0,795,880).

פרוטוקול הבא יתאר את המחקר של הפלישה תא האנדותל ש &#39; aureus אבל תיאורטית יכול לשמש כדי ללמוד הפלישה הסלולר על ידי חיידק כלשהו culturable. ספציפית ס שלבים בתאי האנדותל aureus ו מסומנים. 1. הכנה של חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות S. aureus זנים של 4-16 שעות (תלוי שלב הצמיחה חובה) ב 10 Brain-Heart מרק מ&quot;ל (BHI) עירוי ב 37 מעלות צלזיוס באוויר עם רועד בסל&quot;ד 200. אלה התנאים לצמיחה הן ספציפיות עבור ס aureus ו - ייתכן שיהיה צורך להתאים לחיידקים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיידקים שלוש פעמים בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM; Invitrogen) על ידי סיבובים חלופי של צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (5000 x גרם, 10 דקות), הסרת supernatant התרבות resuspension של גלולה חיידקי בהיקף שווה ערך של DMEM. מדוד את צפיפות אופטית של ההשעיה של חיידקים וכתוצאה מכך אשר לאחר מכן ניתן להתאים לפי הצורך. עבור ס aureus, אנו מכינים השעיה על OD 600 = 1, אשר מתאים ~ 10 9 CFU -1 מ&quot;ל. </li></ol> 2. תא האנדותל תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות קו תא האנדותל EA.hy926 1 ב DMEM בתוספת העובר שור בסרום (FBS; 10%) ו-L-גלוטמין (2 mM) ב 37 ° C ב 5% CO 2. לחלופין, ונקווה העיקרי האדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) ניתן לרכוש Lonza (באזל, שווייץ) ו בתרבית בינוני הבסיס אנדותל בתוספת 2% FBS, תמצית מוח שור (כולל הפרין), גדילה אנושי גורם האנדותל הידרוקורטיזון ב 37 מעלות 5% CO 2 על פי ההוראות של היצרן (Lonza). אלה התנאים לצמיחה ספציפיים עבור תאים אלה ייתכן שיהיה צורך להתאים את סוגי תאים אחרים המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול לתאי אנדותל ב T75 צלוחיות להשלים confluency, מאומת על ידי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את 24 גם צלחות להכנסה של coverslips. מלקחיים פיין (להבה מעוקרים) יש צורך להעביר את coverslips, אשר יש משטח אחד מבריק אטום אחת. המקום coverslips בבארות של צלחת 24 היטב עם משטח אטום כלפי מעלה כדי לאפשר התקשרות לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את התאים מן הבקבוק T75 עם 3 מ&quot;ל טריפסין-EDTA (0.25%), ולהוסיף 10 מ&quot;ל של המדיום תרבות הרלוונטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של תאים resuspended ל 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox זכוכית. אחת T75 בקבוק ומחוברות של תאים תאים סיפק מספיק עבור שני 24 גם צלחות, וכתוצאה מכך כ 5 × 10 5 תאים לכל טוב (בינוני 500 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות עבור 48 שעות כפי שתואר לעיל, ולוודא 100 תא% confluency על ידי מיקרוסקופ אור הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים לשטוף coverslips ב PBS ולהוסיף 24 גם צלחות חדשות המכילות 490 DMEM μl FBS המכיל 10% בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את תפקידה של תהליכים מטבוליים ספציפיים הפלישה התא, מעכבי ניתן להוסיף תאים בתרבית 1 שעות לפני תוספת של חיידקים בריכוזים נשמר במהלך assay. לדוגמה, כדי לקבוע את התפקיד של סידור מחדש של אקטין ס הפלישה aureus של בתאי האנדותל, 50 מיקרומטר cytochalasin D ניתן להוסיף, או לתפקיד של caveolae, 5 מ&quot;מ methyl-β-cyclodextrin ניתן להוסיף. </li></ol> 3. הפלישה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של חיידקים שטף (וכתוצאה מכך כ 2 × 10 7 CFU מ&quot;ל aureus -1 ס) זה טוב המכיל coverslip שטף בשכבה ומחוברות של בתאי האנדותל ב 490 DMEM μl המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 15-90 דקות 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את המספר הכולל של חיידקים הקשורים התאים (חסיד והפנימו), לטבול, לשטוף את coverslips שלוש פעמים PBS ולהוסיף בארות טרי המכיל 500 טריטון 0.5% μl X-100 ב PBS. כדי להבטיח את התאים באופן מלא lyse ולשחרר את כל החיידקים הפנימו, פיפטה מספר פעמים, מצביע על קצה פיפטה ישירות על פני השטח של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת החיידקים על ידי ציפוי ההשעיה נוזלי (או דילולים זה במידת הצורך) על פני השטח של צלחות TSA. מאז TX-100 יהיה lyse רבים חיידקים גראם שליליים, saponin יכול לשמש במקום 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את מספר החיידקים הפנימו, להסיר את supernatant תרבות מכל המכיל חיידקים מאוגד היטב ולהחליף 500 μl DMEM/10% FBS בתוספת 200 מיקרוגרם מ&quot;ל -1 גנטמיצין. אנו משתמשים באופן שגרתי גנטמיצין ולא lysostaphin כאן כפי שהוא זול יותר מאפשר לנו לעבור בין הניסויים באמצעות סוגים שונים של חיידקים (למשל Staphylococci ו Lactococci) מבלי לשנות את פרוטוקול הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 דקות 60 להרוג את כל החיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3 פעמים PBS,lyse ו למנות על ידי ציפוי על גבי ה-TSA, כמתואר עבור assay את הידבקות לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים זה עשוי להיות עדיף על פני חזותית לספור את מספר החיידקים באמצעות מיקרוסקופ אור. במקרה זה, והן ספציפיות ס תא הפלישה aureus, להשתמש lysostaphin (10 מיקרוגרם מ&quot;ל -1) במקום גנטמיצין פיזית להשמיד את החיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עבור 20min ב 37 ° C ב-CO 2 בתמיסה lysostaphin, ולאחר מכן לשטוף ולתקן עם Cytopath (Cellpath). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבול coverslips עם קריסטל סגול (0.5% w / v) עבור 5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים לשטוף במים, האוויר יבש לעלות על שקופיות הזכוכית. מספר חיידקים לכל מ&quot;מ 2 של בתאי האנדותל ומחוברות ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור. </li></ol> 4. נציג תוצאות: ביטוי של חלבונים מחייב פיברונקטין (FnBPA ו FnBPB) על פני השטח של ס aureus מקנה את היכולת לפלוש לתאי אנדותל. מחקר שנערך לאחרונה מחדש את תחום פיברונקטין מחייב של FnBPA 3. Wild-type (WT) ס aureus 8325.4 פולש לתאי אנדותל עם יעילות גבוהה, תוך זן חסר הן FnBPA ו-B (Δ fnb) הראו רמות נמוכות משמעותית של internalisation (איור 1A). השלמה של מוטנטים עם fnb קידוד פלסמיד מינוס תחום פיברונקטין מחייבים (pFnR0) לא לקדם פלישה (איור 1A). לעומת זאת, השלמה של מוטנטים בקידוד פלסמיד fnb כל הגן (pFnBA4) משוחזר הפלישה לרמות WT (איור 1A). תפקידה של FnBPA בפלישה תא האנדותל יכול להיות גם הדגימו באמצעות לארח את הביטוי Heterologous lactis Lactococcus. ביטוי של הפלסמיד המקודד FnBPA ב L. lactis (pRM9 9) לא לשפר באופן משמעותי את הידבקות לתאי אנדותל לעומת חיידקים להביע שום FnBPA (CTL) (ברים פתוחים, 1B איור). לעומת זאת, ל-לבטא FnBPA lactis פלשו לתאי אנדותל ברמות גבוהות משמעותית המתח לא הביע (ברים סגור, 1B איור). הניסויים בוצעו ארבע פעמים כפולות סטיית תקן ממוצע ± מוצג. * מייצגים נתונים שאינם שונים באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית (p = &lt;0.05) מ WT או ערכים CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הפלישה של EA. Hy926 לתאי אנדותל ש &#39; aureus (א) או ל lactis (B).

<ol>
	<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li><li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells.">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li><li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper.">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li><li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics.">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria.">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li><li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells.">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li><li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li><li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA.">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li><li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li><li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li><li>Schr&#246;der, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells.">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li><li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells.">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<html> Assay אנו מתארים מבוסס על assay ההגנה גנטמיצין, אשר נמצאת בשימוש נרחב כדי ללמוד את הפלישה של תאים לארח על ידי חיידקים. תצפיות של חוסר היכולת של אנטיביוטיקה גנטמיצין אחרים כדי להרוג חיידקים תאיים נוצלו במחקרים מוקדם הפלישה של תאים לארח על ידי חיידקים 4-8. השימוש של 24, 48 או אפילו 96-היטב צלחות מאפשרת את הדור של כמויות גדולות של נתונים כמותיים לשחזור בתקופה קצרה של זמן ובעלות נמוכה יחסית. Assay היא גם מושכת משום שהיא אינה מצריכה ציוד מומחה, זה יכול להיות מותאם לעבודה עם חיידקים ותאים שונים, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד את התפקיד של תהליכים בתא שני חיידקים מארח בפלישה 9. ואכן, מאז הניסויים המוקדמים, assay ההגנה גנטמיצין הועסק נרחב כדי למדוד תא הפלישה לארח על ידי מגוון של חיידקים שונים או אפילו שילוב של חיידקים 10,11. בעוד עקרונות הליבה זהים, שינויים קלים רבים בשיטת דווחו. במאמר זה תיארנו גרסה שלנו המצוין בו שינויים עשוי להיות נחוץ עבור חיידקים אחרים או לתאי המארח. בעת תכנון ניסוי כדי למדוד את התא המארח הפלישה שימוש בגישה זו יש מספר נקודות חשובות שיש לשקול: רגישות חיידקים גנטמיצין. זה אולי נראה מובן מאליו, אבל חשוב לוודא את החיידק הנלמד רגיש גנטמיצין בטמפרטורת הריכוז, על משך הזמן לשמש. במקרה של רגישות, יתכן שניתן יהיה להשתמש באנטיביוטיקה אחרת 5. גישה חלופית ניתן להשתמש אנזימים ממס (lysostaphin, mutanolysin, ליזוזים) 12. דגירה ו inoculum. כאשר ביצוע assay בפעם הראשונה חשוב לקבוע את הזמנים הדגירה אופטימלית inoculum חיידקי לשמש. לכן, הניסויים הראשוניים צריכה לבחון הן את הידבקות הפלישה לאורך זמן (5 דקות של עד 6 שעות). חשוב גם להעריך כיצד הפלישה מושפע ריבוי של זיהום (משרד הפנים, מספר החיידקים לכל תא). באופן כללי עדיף להשתמש במספר הנמוך ביותר של חיידקים האפשרי זה יצמצם נזק תאים בתרבית. הבדלים חשובים בין זנים עשוי לפספס אם תקופות דגירה ממושכת או inocula גדולים משמשים 9,13. נזק נייד. חשוב לשטוף את החיידקים לפני השימוש. עם זאת, הנזק התאי אינו מוגבל ייצור הרעלן. פלישה חיידקית, אינדוקציה של אפופטוזיס והפרעה תפקודים תאיים נורמליים יכולים לגרום נזק הסלולר. זה יכול להוביל חדירה של גנטמיצין לתוך התא, להרוג חיידקים הפנימו ולתת את הרושם כי הפלישה לא קרה 14. תנאי דגירה. הטמפרטורה ועל ההרכב של המדיום התרבות יכולה להיות השפעה משמעותית על הפלישה. למשל, פלישה של תאים על ידי הלה pyogenes סטרפטוקוקוס תלוי בנוכחות של פיברונקטין מסיסים, שהוא בדרך כלל קיים בסרום 15. שיקול נוסף הוא התפתחות חיידקים במדיום תרבות במהלך הניסוי. תרבות וכימות של חיידקים תוך תאיים. למרות TX-100 לא יכול להרוג חיידקים תאיים, היא עלולה לעכב את הצמיחה שלהם. ככזה, הוא חשוב לבדוק שכפול חיידקים על התקשורת מוצק בנוכחות של חומרי ניקוי. איפה השפיע, יתכן שניתן יהיה להשתמש בריכוז נמוך יותר של חומר ניקוי או להשתמש אלטרנטיבה כגון saponin. היתרון של assay הגנה גנטמיצין על מכתים את סגול קריסטל assay מיקרוסקופיה היא כי פחות עבודה אינטנסיבית, והוא מאפשר איתור בידול של תת אוכלוסיות של חיידקים הפנימו. לדוגמה, ס &#39; aureus יכול לייצר או סוג המושבה רגילה (NCT) או גרסה מושבה קטנה (SCV) 16, אשר לא יהיה להבחין באמצעות מיקרוסקופ בתאי חיידקים בודדים. היתרון של מכתים את סגול קריסטל assay assay במיקרוסקופ על ההגנה גנטמיצין היא clumping התא ניתן להסביר וכי חיידקים תאיים כי הזן &#39;קיימא אבל לא culturable &quot;המדינה יזוהו 17. בחינת התפקיד של תהליכי התא המארח בפלישה חיידקי. מחקרים רבים המועסקים מעכבי תפקוד התא המארח כגון cytochalasin D, אשר מפריעה התארגנות אקטין. מחקרים כאלה יכולים לכלול גם נוגדנים היעד על פני קרום התא קולטנים מציאה siRNA של גנים ספציפיים 18. חשוב וחיוני על מנת להבטיח כי טיפולים אלה אינם משפיעים על כדאיות או עיקול של תאים בתרבית או להיות השפעה רעילה על חיידקים. העתיד כיוונים: &quot;&gt; ontent בגלל זה assay מבוצע בדרך כלל רב גם צלחות תרבית תאים, זה אפשרי תיאורטית להתאים אותה פעולה תפוקה גבוהה הקרנה, אשר עשויה לכלול בחינה של ספריות של התא לתפקד מעכבי פוטנציאל, אנטי infectives או אנטיביוטיקה נועדה למקד חיידקים תוך תאיים. לחילופין, גישה כזו יכולה לשמש מסך ספריות מוטציה לזהות גנים המעורבים הידבקות, פלישה או הישרדות תאיים. במקרים מסוימים זה עשוי להיות רצוי לכלול כוחות גזירה (זרימה) במערכת מודל, למשל כאשר הדוגמנות האנדותל, כדי לחקות באופן הדוק יותר בסביבת vivo. מקדמות שוטפות בעיצוב וייצור של תאים זרימה microfluidic התרבות מערכות תא לספק את האפשרות של העסקת assay הגנה גנטמיצין in-host הפתוגן מודלים המשלבים כוחות גזירה. לסיכום, פרוטוקול המתואר כאן מבוסס על גישות דומות בשימוש במשך שנים רבות. זה נרחב החלים על סוגים רבים של תאים בתרבית מינים חיידקים יכולים לייצר כמויות גדולות של נתונים במהירות ובעלות נמוכה יחסית.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Brain heart infusion</td><td>BioChemika</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;tal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial basal medium</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3121</td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract (including heparin)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelial growth factor</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4017C</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4035C</td><td></td></tr><tr><td>GA-1000</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092C</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Lysostaphin</td><td>AMBI</td><td>LSPN-50</td><td></td></tr><tr><td>Thermanox coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TKT-210-330P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Cytopath</td><td>TCS Biosciences</td><td>HC8595</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2618</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>332615</td><td></td></tr></tbody></table>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

להלן נתאר כיצד אנחנו לומדים את הפלישה לתאי אנדותל אנושיים על ידי Staphylococcus aureus חיידקים פתוגנים. פרוטוקול כללי ניתן ליישם מחקר של הפלישה תא החיידק על ידי כמעט כל culturable. שלבי בו היבטים ספציפיים של הפלישה ניתן ללמוד, כגון תפקידה של התארגנות אקטין או caveolae, יהיו מודגשות. תאים מארח מגדלים צלוחיות וכאשר מוכן לשימוש הן seeded לתוך 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox. שימוש coverslips מאפשר הסרת הבאים של התאים מבארות כדי להפחית מהפרעות חלבונים בסרום מופקדים על הצדדים של בארות (אשר S. aureus היה לצרף). חיידקים גדלים לצפיפות הנדרשת ושטף כדי להסיר כל החלבונים המופרשים (רעלים למשל). Coverslips בשכבות ומחוברות של בתאי האנדותל מועברים 24 גם צלחות חדשות המכילות בינוני תרבות טרי לפני תוספת של חיידקים. חיידקים ותאים מודגרת אז יחד סכום נדרש זמן של 5% CO 2 ב 37 ° C. עבור ס aureus זה הוא בדרך כלל בין 15-90 דקות. Coverslips Thermanox יוסרו גם כל לטבול לרחוץ PBS להסיר חיידקים פנויות. אם חיידקים הקשורים הכולל (חסיד והפנימו) יש לכמת, coverslips ממוקמות אז גם טרי המכיל טריטון 0.5% X-100 ב PBS. Pipetting עדין מוביל להשלים תמוגה תאים וחיידקים הם המנויים על ידי דילול ציפוי סדרתי על אגר. אם מספר חיידקים פלשו התאים נדרשת, coverslips מתווספים בארות המכיל 500 ברקמת μl תרבות בינוני בתוספת גנטמיצין ו הדגירה נמשך 1 שעה, אשר יהרגו את כל החיידקים חיצוני. Coverslips אז יכול להיות שטף, lysed תאים וחיידקים המנויים על ידי ציפוי על אגר כמתואר לעיל. אם הניסוי דורש ראיה ישירה, coverslips ניתן לתקן ומוכתמת עבור במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי או confocal או מוכן במיקרוסקופ אלקטרונים.

Watch this Scientific Journal Video about Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

פרוטוקול כללית לחקר פלישה של תאים לארח על ידי פתוגן חיידקי, תוך התמקדות<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; ותאי האנדותל האדם.

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.7K Views.  University of Bath. פרוטוקול כללית לחקר פלישה של תאים לארח על ידי פתוגן חיידקי, תוך התמקדות Staphylococcus aureus ותאי האנדותל האדם.

Video: Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי<em&gt; במבחנה</em&gt; באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.

The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.

מודל אפיתל דמה מקלעת מבוססת תאים של הגדר ודם-השדרתי נוזל לחקר זיהום חיידקים מצד basolateral

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

Medicine

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A Bacterial Infection Assay for Studying Anaerobic Bacteria-Host Cell Interactions

Source: Wunsch, C. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53408">Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a technique for assessing the ability of Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, to adhere to and invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). After infecting the host cells with the bacteria, the host cells are lysed to release both adhered and internalized bacteria. When the lysate is plated in an appropriate medium, the presence of colonies indicates successful bacteria-host cell interactions.

בדיקת זיהום חיידקי לחקר אינטראקציות אנאירוביות בין חיידקים לתאים מארחים

The following protocols will describe methods for culturing and studying the invasion by the anaerobic species, P. gingivalis; however, these protocols ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in an Ex Vivo Organ Culture

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates a method to establish an infection model in placental tissues to study infection propagation. An ex vivo placental organ culture is infected with Listeria monocytogenes, a facultative intracellular parasite. The bacteria invade extravillous trophoblasts (EVTs) to enter the placental tissue and then propagate to other cells via cell-to-cell spread.

טכניקה לביסוס מודל זיהום חיידקי בתרבית איברים Ex Vivo

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

Immunopathology

In Vitro Models

A Permeable Membrane Insert-Based Infection System to Study the Impact of Bacterial Toxins

Source: Flaherty, R. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54406">Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a permeable membrane insert-based infection system to assess the impact of secreted bacterial toxins. By eliminating direct contact between the bacterial pathogen and the host cells using a permeable membrane, this technique allows for studying the effect of toxins secreted by pathogenic bacteria on mammalian host cells.

מערכת זיהום חדירה המבוססת על החדרת ממברנה לחקר ההשפעה של רעלנים חיידקיים

1. Bacterial Culture

	Generate isogenic mutant strains to be used for the study of the specific secreted factor of interest.
	Note: The GAS (Group A ...

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video