מחקר זה נתמך על ידי קרן הסטארט-אפ VCU (לי.ג.) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01GM132329 (ל- Y.G.) התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים למונטסראט סאמסו וקווין מקרוברטס על תמיכתם הנדיבה בהקלטת וידאו.

1. ביטוי חלבון
<ol><li>לחסן 15 מ"ל של מרק נהדר (TB) מדיה עם אנטיביוטיקה ספציפית פלסמידים עם BL21(DE3) pLysS תאים המכילים את AcrB המביעים פלסמידים ב 50 צינורות מ"ל לילה ב 37 °C (69 °F) עם רועד ב 250 סל"ד.</li>
	<li>בדוק את הצפיפות האופטית של תרבות הלילה ב 600 ננומטר (OD600) ולוודא שזה מעל 2.0.</li>
	<li>לדלל 5 מ"ל של תרבות התא לתוך 1 L של מדיה שחפת המכילה אנטיביוטיקה ספציפית פלסמידים דגירה ב 37 °C (67 °F) עם רועד עד OD600=0.8 ולאחר מכן לגרום עם IPTG כי יש ריכוז סופי של 1 mM.</li>
	<li>לבצע אינדוקציה ב 20 מעלות צלזיוס עם רועד במשך 20 שעות.</li>
	<li>גלולה במורד התאים באמצעות צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ו 4,000 x גרם.</li>
</ol>2. תמוגת תאים ובידוד קרום
<ol><li>Resuspend גלולת התא במאגר A(טבלה 1, להשתמש DDM מאגר A או NCMNs מאגר A בהתאם ערכת טיהור כי הוא לעקוב) באמצעות 80 מ"ל עבור כל 20 גרם של גלולת התא.</li>
	<li>הומוגניזציה כדורי התא resuspended באמצעות homogenizer Dounce זכוכית ב 4 מעלות צלזיוס או אם בטמפרטורת החדר הקפד לשים על קרח מיד לאחר.</li>
	<li>מעבירים את הדגימה לתוך כיפת מתכת על קרח ו lyse התאים על ידי טעינת אותם לתוך הומוגניזר בלחץ גבוה ב 4 מעלות צלזיוס ו 1,500 בר.<ol>
<li>חזור על תהליך הטעינה של התאים לתוך homogenizer ומאפשר להם לעבור את homogenizer במשך 3-4 מחזורים או עד lysate מתחיל להבהיר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צנטריפוגה lysate ב 15,000 x g במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף את supernatant ולהעמיס לתוך צינורות ultracentrifuge וצנטריפוגה ב 215,000 x g עבור 1 שעה ב 4 °C (69 °F).</li>
	<li>להשליך את supernatant ולאסוף את כדורי הממברנה מן הצינורות ultracentrifuge. לאחסן כל גלולה קרום עודף ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. הכנת חלקיקי קרום התא המקומי
<ol><li>Resuspend 1 גרם של גלולת ממברנה ב 10 מ"ל NCMNs מאגר A(טבלה 1).</li>
	<li>הומוגניזציה של דגימת קרום התא בשימוש חוזר עם homogenizer Dounce זכוכית ב 20 °C (69 °F).</li>
	<li>העבר את דגימת הממברנה המושעית לצינור פוליפרופילן 50 מ"ל והוסף פתרון מלאי פולימרים פעילים ממברנה ומאגר NCMNs נוסף A כדי להביא את המדגם לריכוז סופי של 2.5% (w / v) ממברנה פולימר פעיל (NCMNP1-1 או NCMNP5-2). הערה: פתרונות מלאי של פולימרים פעילים קרום צריך להתבצע במים מזוקקים כפולים ניתן לשמור בריכוזים שונים, אבל בדרך כלל 10% (w / v).</li>
	<li>לנער את המדגם במשך 2 שעות ב 20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לטעון את המדגם לתוך ultracentrifuge ולהסתובב ב 150,000 x g עבור 1 שעה ב 20 °C (69 °F).</li>
	<li>בעוד המדגם הוא להיות אולטרה צנטריפוגה להתחיל לאיזון עמודה 5 מ"ל Ni-NTA עם 25 מ"ל של מאגר NCMNs A.</li>
	<li>לאסוף את supernatant לאחר ultracentrifugation הושלם לטעון אותו על 5 מ"ל של עמודה Ni-NTA בטמפרטורת החדר עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק.</li>
	<li>לשטוף קווי כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) עם מספיק NCMNs מאגר B (טבלה 1) כדי לשטוף לחלוטין את המערכת ולאחר מכן לחבר את העמודה למכונת FPLC.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר NCMNs B עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר NCMNs C (טבלה 1) עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.</li>
	<li>יש לאלוט את החלבון ב-20 מ"ל של NCMNs Buffer D(טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף את הדגימה באמצעות אספן שברים והשברים שכל אחד מהם מוגדר ל-1.0 מ"ל.</li>
	<li>אחסן את דגימות החלבון ב-4°C.</li>
	<li>הפעל בדיקת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE על מנת לבדוק את הדגימות המתאימות לפסגות שנצפו בגרף elution FPLC.</li>
</ol>4. אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE
<ol><li>הכינו את תא הליהוק על ידי הידוק הזכוכית למנגנון הליהוק.</li>
	<li>מכינים את ג'ל ההפרדה 12% על פי המתכון המפורט בטבלה 1. הערה: לאחר הוספת TEMED הג'ל יתמזג במהירות ולכן רק להוסיף את זה פעם אחת מוכן לשפוך את הג'ל.</li>
	<li>יוצקים את הג'ל, משאירים 2 ס"מ מתחת לתחתית המסרק עבור ג'ל הערימה.</li>
	<li>הסר את כל הבועות על ידי שכבות החלק העליון של הג'ל עם 100% isopropanol ולחכות ג'ל ההפרדה כדי polymerize.</li>
	<li>הסר את isopropanol ולשטוף את כל העקבות של isopropanol עם מים מזוקקים.</li>
	<li>מכינים את ג'ל הערימה לפי המתכון המפורט בטבלה 1. הערה: לאחר הוספת TEMED הג'ל יתמזג במהירות ולכן רק להוסיף את זה פעם אחת מוכן לשפוך את הג'ל.</li>
	<li>יוצקים את ג'ל הערימה על גבי ג'ל ההפרדה.</li>
	<li>מוסיפים מסרק לתא כדי ליצור את הבארות ומחכים שהג'ל לערום יתוקן לחלוטין.</li>
	<li>מניחים μL אחד של 1 M DTT לתוך צינור microcentrifuge עבור כל מדגם שבר שצריך לרוץ על הג'ל.</li>
	<li>הוסף 7 μL של מאגר טעינה 4x לכל צינור גם כן.</li>
	<li>הוסף 20 μL של מדגם מן השברים כי צריך להיות לרוץ על הג'ל לכל צינור microcentrifuge.</li>
	<li>וורטקס הצינורות המכילים את הדגימות.</li>
	<li>סובבו את צינורות הדגימה באמצעות מיקרוצנטריפוגה על השולחן במשך 3 שניות וודאו שכל הדגימה חזרה לתחתית הצינורות.</li>
	<li>הכינו את תא האלקטרופורזה של הג'ל על ידי אבטחת קלטת ג'ל פוליאקרילמיד 12% למקומו ומילוי התאים הפנימיים והחיצונים של התא במאגר Tris-acetate-EDTA (TAE)(טבלה 1).</li>
	<li>טען את סמן המשקל המולקולרי לנתיב הראשון של הג'ל עם הנפח המתאים הנדרש על פי הוראותיו.</li>
	<li>טען 28 μL של המדגם מכל צינור מעורבב עם DTT ומאגר טעינה.</li>
	<li>הנח את המכסה של תא האלקטרופורזה על גבי התיבה וחבר את המכסה לאספקת החשמל.</li>
	<li>הפעל את ספק הכוח והגדר אותו ל- 100 V ואפשר לו לפעול במשך 20 דקות.</li>
	<li>לאחר 20 דקות, להגדיל את זרם אספקת החשמל ל 140 V ולהמשיך להפעיל אותו עוד 30-40 דקות או עד הלהקה של צבע מאגר טעינה מגיע לתחתית קלטת הג'ל.</li>
	<li>לאחר השלמת כתם אלקטרופורזה ו de-stain הג'ל כדי לדמיין את רצועות החלבון הכלולות בתוך הג'ל.</li>
</ol>5. טיהור חלבונים באמצעות DDM
הערה: מטרת ביצוע תהליך טיהור זה היא לשמש כבקרה לניסויים העושים שימוש בפולימרים הפעילים של הממברנה.
<ol><li>Resuspend 6-10 גרם של גלולת ממברנה, משלב 2.6, ב DDM Buffer A (טבלה 1) באמצעות 5 מ"ל / גרם של גלולת ממברנה.</li>
	<li>הומוגניזציה מדגם resuspended עם homogenizer Dounce זכוכית ב 4 מעלות צלזיוס או אם בטמפרטורת החדר הקפד לשים על קרח מיד לאחר.</li>
	<li>להעביר מדגם 50 מ"ל של צינור פוליפרופילן ולהוסיף DDM ומאגר DDM נוסף A להביא את המדגם לריכוז הסופי של 2% DDM.</li>
	<li>לנער את המדגם במשך 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>טען את הדגימה לתוך צינורות ultracentrifuge וצנטריפוגה עבור 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס ו 150,000 x גרם.</li>
	<li>בעוד המדגם הוא להיות אולטרה צנטריפוגה להתחיל להכין את 5 מ"ל של עמודה Ni-NTA על ידי כביסה עם 25 מ"ל של מאגר DDM A (טבלה 1).</li>
	<li>לאחר השלמת ultracentrifugation, לאסוף את supernatant ולהעמיס אותו על 5 מ"ל Ni-NTA עמודה ב 4 °C (69 °F) עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק.</li>
	<li>שטיפת קווי FPLC עם מספיק DDM Buffer B + 0.05% DDM (טבלה 1)כדי לרוקן לחלוטין את המערכת ולאחר מכן לחבר את העמודה למכונת FPLC.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר DDM B + 0.05% DDM עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר DDM C + 0.05% DDM (טבלה 1) עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.</li>
	<li>יש לטבול את החלבון ב-20 מ"ל של DDM Buffer D + 0.05% DDM(טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף את הזרימה באמצעות אספן שברים והשברים שכל אחד מהם מוגדר ל-1.0 מ"ל.</li>
	<li>בחר את השברים המכילים את שיא elution עבור איגום והתרכזות באמצעות רכז צנטריפוגלי צנטריפוגה ב 4,000 x g ו 4 °C (60 °F) עד להגיע 500 μL.</li>
	<li>באמצעות לולאת μL 500 לטעון את המדגם לתוך מכונת FPLC ולאחר מכן על עמודת אי הכללה בגודל 25 מ"ל ב 4 °C (69 °F). יש להשתמש ב-30 מ"ל של DDM Buffer E + 0.05% DDM (טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף כשברים כשגדלי השבר מוגדרים כ- 0.5 מ"ל לשבר.</li>
	<li>קח את השברים ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות ספיגה של 280 ננומטר כדי לאשר עקומת UV-Vis מגרף elution FPLC.</li>
	<li>לאסוף 20 μL מכל שבר מדגם התואמים פסגות שנצפו על גרף elution FPLC ואושרו להיות מדויק עם בדיקת הספיגה.</li>
	<li>להקפיא את שאר שברי מדגם אלה באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש aliquots הרצוי ולאחסן דגימות חלבון ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפעל בדיקת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE כפי שתואר קודם לכן כדי לבדוק את הדגימות המתאימות לפסגות שנצפו בגרף elution FPLC.</li>
</ol>6. הכנת רשת כתמים שלילית
<ol><li>מניחים את הרשתות כי הם הולכים לשמש להכנת מדגם על שקופית זכוכית עטוף נייר מסנן עם צד הפחמן פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>מניחים את שקופית הזכוכית עם רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים לתוך התא של הפרש זוהר בין שתי האלקטרודות ולהחליף את מכסה הזכוכית לוודא שהוא ממורכז ואטום היטב.</li>
	<li>הפעל את מכונת פריקת הזוהר וודא שהאור הסגול שנוצר על-ידי הפלזמה נראה לעין.</li>
	<li>כאשר המכונה נעשית פועל, לחכות עד התא הגיע ללחץ אטמוספרי כדי להסיר את מכסה הזכוכית ולאחר מכן להחזיר את השקופית עם הרשתות לספסל שבו דגימות יהיה טעון עליהם.</li>
	<li>להתאים את הריכוז של דגימות חלבון מטוהרים על 0.1 מ"ג / מ"ל על ידי דילול המדגם עם המאגר המתאים או להתרכז באמצעות רכז צנטריפוגלי.</li>
	<li>לטעון 3.5 μL של דגימת חלבון על רשת פחמן 10 ננומטר עבה ולחכות 1 דקות.</li>
	<li>הסר את הנוזל מפני השטח של רשת EM עם נייר מסנן.</li>
	<li>לשטוף את משטח הרשת 3x על ידי להרים 3 טיפות μL של מים עם הרשת והסרת המים מהרשת עם נייר מסנן בין להרים כל טיפה.</li>
	<li>לשטוף את משטח הרשת 2x על ידי להרים 3 טיפות μL של טרי, מסונן 2% אורניום אצטט ולהסיר את פתרונות לשטוף על הרשת עם נייר מסנן בין להרים כל טיפה.</li>
	<li>הכתים את הרשת עם טיפה 3 μL של טרי, מסונן 2% אצטט אורניום במשך 1 דקות.</li>
	<li>הסר את פתרון אצטט אורניום על פני השטח של רשת EM עם נייר מסנן ואוויר לייבש את הרשת לפחות 1 דקות.</li>
	<li>אחסן את הרשת בתיבת רשת לשימוש במועד מאוחר יותר.</li>
</ol>7. הדמיה EM
<ol><li>טען את הרשת המוכנה למחזיק הרשת בשולחן עבודה בטוח.</li>
	<li>מכינים את המיקרוסקופ על ידי הצבת המיקרוסקופים dewar לתוך תיבת פוליסטירן ולמלא את dewar 3/4th מלא חנקן נוזלי.</li>
	<li>ודא כי כיסוי הגומי של חלון המיקרוסקופ מכסה אותו ולאחר מכן לטעון את dewar על המיקרוסקופ על ידי הצבת חוטי נחושת לתוך dewar עד שהוא מתאים על הפלטפורמה.</li>
	<li>ממלאים את שארית החנקן בנוזל ומניחים כובע על גבי ה dewar כדי לכסות אותו.</li>
	<li>להפעיל את המתח הגבוה, להתנות את המיקרוסקופ, ולחכות מיקרוסקופ להתחמם וליצור רמת ואקום בטוח לשימוש.</li>
	<li>ברגע שהמיקרוסקופ מוכן לפתוח את שסתום העמודה ולאשר את הקרן קיימת על ידי הסרת כיסוי הגומי על חלון המיקרוסקופ.</li>
	<li>בדוק את סטיגמות הקרן על ידי התפשטות פנימה והחוצה על ידי התאמת עוצמת הקרן. אם אסטיגמציה קיימת הקרן תהיה צורה אליפטית כמו אחד נע מן הצלבה ואת הקרן צריכה להיות באותה צורה אליפטית משני הצדדים.</li>
	<li>התאם את משקפת המיקרוסקופ כך שתהיה הגובה והמרחק הנכונים לפי עיניו של הצופה.</li>
	<li>בדוק את מיקום הקרן עבור מצבי חיפוש, מיקוד וחשיפה על-ידי רכיבה על אופניים בכל שלושת המצבים עד שהקרן תמרכז בכל אחד מהם.</li>
	<li>סגור את שסתום העמודה והמשך לטעון את מחזיק הרשת למיקרוסקופ האלקטרונים.</li>
	<li>התאם את המיקרוסקופ לגובה האוצנטרי באמצעות התכונה microscopes wobbler והתאמת תנועת הבמה באמצעות ציר Z עד שלא תהיה תנועה מצד לצד של המדגם במרכז.</li>
	<li>באמצעות מצב חיפוש במינון נמוך על מיקרוסקופ לחפש את הרשת עבור אזור רצוי של ניגודיות סבירה עם מולקולות מדגם נוכח להתמקד במדגם.</li>
	<li>התמקד בדוגמה במצב מיקוד באמצעות גודל שלב גבוה עד שהדוגמה תיראה ולאחר מכן הקטן שלבים למציאת רמת המוקד הנכונה.</li>
	<li>אפס וריק הקרן ולאחר מכן להיות בטוח כרית הגומי מכסה את חלון המיקרוסקופ.</li>
	<li>במצב חשיפה, צלם את התמונה של אזור הרשת הרצוי לחשיפה של 1 שניות בהגדלה של 62,000x ובדוק את התמונה שהתקבלה.</li>
	<li>כאשר נעשה הדמיה רשת לסגור את שסתומי העמודה ולהסיר את מחזיק הרשת מהעמודה.</li>
	<li>כאשר סיים לדמיין את כל רשתות העניין לכבות את המיקרוסקופ על ידי כיבוי כוח חוטים והסרת חנקן נוזלי dewar מן המיקרוסקופ.</li>
	<li>מניחים משהו לספוג לחות על הדוכן שבו דיואר ישב לתפוס עיבוי מן סלילי הנחושת של המיקרוסקופ.</li>
	<li>הפעל את מצב מחזור Cryo וודא שמשאבת הטורבו כבויה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Huang, H., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+recall+estimates+for+two-hybrid+screens.">Precision and recall estimates for two-hybrid screens.</a> Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).</li><li>Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+system+and+false+positives.+Approaches+to+detection+and+elimination.">Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination.</a> Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).</li><li>Ngounou Wetie, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+stable+and+transient+protein-protein+interactions:+Past,+present,+and+future.">Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future.</a> Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).</li><li>Schaufele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+the+quantitative+accuracy+and+reproducibility+of+Forster+resonance+energy+transfer+measurement+for+screening+by+high+throughput+widefield+microscopy.">Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy.</a> Methods. 66 (2), 188-199 (2014).</li><li>Berney, C., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+or+no+FRET:+a+quantitative+comparison.">FRET or no FRET: a quantitative comparison.</a> Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).</li><li>Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+human+membrane+proteome:+a+majority+of+the+human+membrane+proteins+can+be+classified+according+to+function+and+evolutionary+origin.">Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin.</a> BMC Biology. 7, 50 (2009).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there.">How many drug targets are there.</a> Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Data+Bank.">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li><li>Overduin, M., Esmaili, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memtein:+The+fundamental+unit+of+membrane-protein+structure+and+function.">Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).</li><li>Qiu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+activity+of+lipid+bilayer+within+a+membrane-protein+transporter.">Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).</li><li>Knowles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+solubilized+intact+in+lipid+containing+nanoparticles+bounded+by+styrene+maleic+acid+copolymer.">Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).</li><li>Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+Lipid+Nanodisk+Formation+by+Styrene-Maleic+Acid+Copolymers.">Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers.</a> Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).</li><li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure.">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).</li><li>Yu, L., Lu, W., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AcrB+trimer+stability+and+efflux+activity,+insight+from+mutagenesis+studies.">AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies.</a> PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).</li><li>Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy+as+demonstrated+by+measuring+the+activation+of+the+serine/threonine+kinase+Akt.">Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt.</a> Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).</li><li>Ma, L., Yang, F., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+protein+studies.">Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).</li><li>Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+electronic+energy+transfer+in+the+determination+of+lipid+nanodomain+sizes.">Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).</li><li>Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal/noise+analysis+of+FRET-based+sensors.">Signal/noise analysis of FRET-based sensors.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+oligomeric+states+of+a+wild+type+and+mutant+trimeric+inner+membrane+multidrug+transporter.">Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter.</a> Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+Negative+Stain+Electron+Microscopy+Methods:+Tools+for+Tackling+Challenging+Systems.">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

י.ג. רשום כממציא מערכת הפולימר הפעילה של הממברנה NCMNP5-2 ו- NCMN.

אינטראקציות חלבון חלבון חשובות לשלמות המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה. גישות רבות פותחו כדי לחקור אינטראקציות חלבון חלבון. בהשוואה לחלבונים מסיסים, חלבוני ממברנה ו- PPIs שלהם קשה יותר ללמוד בשל המאפיינים המהותיים הייחודיים של חלבוני ממברנה. קושי זה נובע בעיקר מהדרישה של חלבוני ממברנה להיות ...

אינטראקציות חלבון חלבון (PPI) ממלאות תפקידים מרכזיים בביולוגיה, החל מתחזוקת המבנה והתפקוד של חלבונים ועד לוויסות מערכות שלמות. PPIs מגיעים בצורות רבות ושונות וניתן לסווג על סמך סוגי האינטראקציות שהם יוצרים. סיווג אחד כזה הוא הומו-אוליגומרי או הטרואוליגומרי, בהתבסס על השאלה אם האינטראקציות הן בין יחידות משנה זהות או חלבונים שונים הפועלים כיוני משנה. סיווג נוסף מבוסס על עוצמת האינטראקציה אם האינטראקציות מובילות להיווצרות קומפלקסים יציבים או מצבים מורכבים חולפים. מידע מבני על PPIs בין חלבונים הוא חיוני בהבנת המנגנון שבאמצעותו חלבונים לבצע את תפקידם. ההערכה היא כי מעל 80% של חלבונים להסתמך על היווצרות מורכבת על מנת לבצע את תפקידם התפקודי1. בהתחשב באחוז החלבונים שנצפו להסתמך על PPIs לתפקוד מולד תקין משמעותם בביולוגיה ניכרת בקלות, אך היכולת לחקור כראוי את החלבונים העוסקים באינטראקציות אלה נותרה מאתגרת בשל מגבלות בטכניקות הזמינות לצפייה ניסיונית כאשר חלבונים יוצרים PPIs.
יש רמה גבוהה של חילוקי דעות בין התוצאות עבור PPIs רבים שנקבעו בניסויים בשל כמות גבוהה של רעש, תוצאות חיוביות שגויות, ותשלילים כוזבים הנגזרים רבים של טכניקות קביעת PPI זמין כיום. זה במיוחד עבור מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H), ספקטרומטריית טיהור-מסה טנדם (TAP-MS), והעברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET), המייצגים שלוש מהשיטות הנפוצות ביותר לקביעת PPI2,3,4,5,6,7. לשם השוואה, ניתן להשתמש בטכניקות ביולוגיה מבנית של חלבונים, כגון תהודה מגנטית גרעינית (NMR), קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), כדי להשיג מידע מבני ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות חלבון-חלבון עד לרמה האטומית ולאפשר אישור חזותי ישיר של האינטראקציות המתרחשות עבור חלבון יעד בעל עניין. כל PPI שאינו מבוסס על מבנה זמין כיום הקובע טכניקות מחקר (למשל, Y2H, TAP-MS ו- FRET) חסר יכולת זו ובנוסף סובלים מקושי בזיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות בין חלבונים5. חסרונות אלה משופרים עוד יותר כאשר לומדים חלבונים קרום בשל המורכבות הנוספת הביא על ידי המשתנה הנוסף של סביבת השומנים המשפיעה על היווצרות של מבנה quaternary הנכון הרכבה מורכבת הטרומרית.
חלבוני ממברנה מהווים חלק גדול של פרוטאום ידועים לשחק תפקידים מכריעים רבים בתפקוד התא תקין בתוך כל האורגניזמים החיים. למרות העובדה כי חלבוני ממברנה מוערך לפצות 27% של הגנום האנושי ומהווים ~ 60% מכל מטרות התרופה הנוכחית יש אנומליה גדולה במספר המודלים שנפתרו עבור חלבוני ממברנה המהווים רק ~ 2.2% מכלל מבני החלבון שפורסמו8,9,10. הגורם העיקרי לפער בזמינות של מידע מבני טמון בתכונות המהותיות של חלבוני הממברנה עצמם. בשל המסיסות הירודה שלהם, הסתמכות על אינטראקציות עם סביבת השומנים לשמירה על מבנה ותפקוד מקומיים, ותכונות פיזיוכימיות שונות של קרום השומנים עצמו, חלבוני קרום ממשיכים לייצג בעיה משמעותית בעת יישום טכניקות ביולוגיה מבנית כדי ללמוד אותם. מבין תכונות מהותיות אלה, החשוב ביותר להשגת מידע מבני מדויק הוא הדרישה לקיים אינטראקציות עם סביבת השומנים הטבעית שלהם כדי לשמור על המבנה והתפקוד המקוריים שלהם. סביבת השומנים היא חלק בלתי נפרד מהמבנה והתפקוד של חלבוני הממברנה שהמושג של ממטאין (שילוב של המילים קרום וחלבון) הוצע כיחידה הבסיסית של מבנה חלבון קרום ותפקוד11. למרות החשיבות של אינטראקציות חלבון השומנים, טכניקות קביעת PPI המבוססות על מבנה הזמינות כיום דורשות לעתים קרובות שהחלבונים הנחקרים יהיו מסיסים או יהיו מסיסים בחומרי ניקוי. חשיפה לחומרי ניקוי קשים יכולה לרוקן את החלבונים או לגרום לחיוביות ותשלילים כוזבים עקב דילול, אשר יכול לגרום לצבירה, denaturation של חלבון, ניתוק של אינטראקציות שאינן covalent, היווצרות של מצבים אוליגומריים מלאכותיים. בשל הצורך בשמירה על סביבת שומנים טבעית לקביעה מדויקת של המצב האוליגומרי המקורי של חלבוני ממברנה פיתחנו מערכת חלקיקי קרום התא המקומי (NCMNs)12 בהתבסס על שיטת Styrene Maleic Acid Lipid (SMALP)13 שדווחה בעבר.
SMALP משתמשת בקופולימר חומצה גברית סטירן כמו פולימר פעיל קרום כדי לחלץ ולטבול חלבוני קרום. פולי (Styrene-co-Maleic Acid) הוא פולימר אמפיפילי ייחודי בשל הסטירן ההידרופובי שלו moiety ו diametricic מול חומצה גברית הידרופילית moiety. זה יוצר חלקיקים על ידי ספיחה, ערעור היציבות, ושיבוש קרום התא במנגנון תלוי pH14. פעילות תפקודית זו של SMA היא המאפשרת לו להיות מנוצל כמערכת ללא חומרי ניקוי עבור מיצוי חלבון קרום ו solubilization. מערכת NCMN נבדלת ממערכת SMALP במספר היבטים. התכונה הייחודית ביותר של מערכת NCMN היא שיש לה ספריית פולימר פעילה קרום עם שפע של פולימרים בעלי תכונות ייחודיות שהופכות אותם מתאימים לבידוד של חלבוני ממברנה רבים ושונים הדורשים תנאים שונים ליציבות ותפקוד ילידי. למערכת NCMN יש גם פרוטוקולים שונים בהשוואה לשיטת SMALP כשמדובר בהכנת הננו-חלקיקים. דוגמה אחת לכך היא ש- NCMNs משתמשים בטיהור עמודת זיקה ניקל חד-שלבית לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה; ההשפעה של פרוטוקולים שונים אלה ניתן לראות בעת השוואת פרוטוקול NCMNs, אשר יצר 3.2 ו 3.0 Å קריו-EM AcrB מבנים, עם מחקר דומה באמצעות שיטת SMALP, אשר הביא מבנה AcrB cryo-EM ב 8.8 Åרזולוציה 12,15. תכונות ייחודיות אלה של מערכת NCMN הן השיפורים שנעשו בשיטת SMALP שהוקמה בעבר ולהפוך אותה למועמד אידיאלי לחקר PPIs.
טרנספורטר efflux multidrug AcrB קיים כהומוטרימר פונקציונלי ב E. coli12. ניתוח מוטגני הציע כי מוטציה נקודת P223G אחת, הממוקמת על לולאה האחראית ליציבות של שולי AcrB, מערערת את מצב השליש ומניבה מונומר AcrB כאשר הוא מוכן עם DDM חומר הניקוי, אשר יכול להיות מזוהה עם אלקטרופורזה ג'ל כחול יליד16. עם זאת, ניתוח FRET של מוטציית AcrB-P223G הציע כי כאשר בסביבת bilayer השומנים קרום התא המקורי, רוב מוטציה AcrB-P223G עדיין היה קיים כמו טרימר וכי רמות הביטוי עבור שני סוג פראי AcrB ו AcrB-P223G דומים. עם זאת, למרות תוצאות ניתוח FRET, בדיקה פעילות עבור טרנספורטר מוטנטים הראה כי הפעילות ירדה באופן דרמטי בהשוואה לסוג פראי16. למרות טכנולוגיית FRET שימשה העממית לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון, מחקרים הראו כי זה יכול לעתים קרובות לתת תוצאות חיוביות שגויות17,18,19,20.
לאחרונה, מבנים ברזולוציה גבוהה cryo-EM של טרימר AcrB נקבעו אשר הראו את האינטראקציה של AcrB עם bilayer השומנים קרום התא המקורי המשויך שלה באמצעות NCMNs12. באופן עקרוני, NCMNs יכול להיות מנוצל בקלות לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון נמצאו על קרום התא המקומי. במבחן של מערכת זו, ניסויים בוצעו כדי לבחון ישירות את המצב האוליגומרי של AcrB-P223G עם שימוש חלקיקי קרום התא המקומי מיקרוסקופ אלקטרונים כתמים שליליים. כדי להשוות עם חלקיקי AcrB מסוג פראי, השתמשנו באותו פולימר פעיל קרום (SMA2000 שנעשו במעבדה שלנו, אשר אינדקס כמו NCMNP1-1 בספריית NCMN) המשמש לקביעת מבנה cryo-EM ברזולוציה גבוהה של AcrB ופולימרים חלופיים שנמצאו בספריית NCMNs12. בהתבסס על התוצאות שדווחו בעבר, זה היה צפוי כי רוב מוטציה AcrB-P223G יתקיים בצורה של חלקיקי קרום תא מקורי טריטרי21. עם זאת, לא נמצאו חותכי AcrB במדגם, כגון אלה שנצפו עם סוג הפרא AcrB. זה מרמז על הרוב של AcrB-P223G אינו יוצר קוצצים על קרום התא המקורי כפי שהוצע בעבר.
כאן אנו מדווחים על ניתוח מפורט של המוטנט E. coli AcrB-P223G בהשוואה לסוג הפראי E. coli AcrB באמצעות NCMNs. מקרה מבחן זה של AcrB מצביע על NCMNs היא מערכת טובה לניתוח אינטראקציה חלבון חלבון.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

אינטראקציות חלבון-חלבון במערכות קרום התא ממלאות תפקידים מכריעים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, החל מאינטראקציות בין תא לתא ועד העברת אותות; החל מחישה של אותות סביבתיים ועד לתגובה ביולוגית; מוויסות מטבולי לבקרה התפתחותית. מידע מבני מדויק של אינטראקציות חלבון-חלבון חיוני להבנת המנגנונים המולקולריים של קומפלקסים של חלבוני ממברנה ולעיצוב מולקולות ספציפיות מאוד לווסת חלבונים אלה. גישות רבות in vivo ו- in vitro פותחו לגילוי וניתוח של אינטראקציות חלבון-חלבון. ביניהם הגישה הביולוגית המבנית היא ייחודית בכך שהיא יכולה לספק מידע מבני ישיר של אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית. עם זאת, הביולוגיה המבנית של חלבון הממברנה הנוכחי עדיין מוגבלת במידה רבה לשיטות מבוססות חומר ניקוי. החיסרון העיקרי של שיטות מבוססות חומר ניקוי הוא שהם לעתים קרובות לנתק או denature קומפלקסים חלבון קרום פעם הסביבה המקומית שלהם bilayer השומנים מוסר על ידי מולקולות דטרגנט. פיתחנו מערכת ננו-חלקיקים של קרום התא המקומי לביולוגיה מבנית של חלבון קרום. כאן, אנו מדגימים את השימוש במערכת זו בניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון על קרום התא עם מקרה מבחן של המצב האוליגומרי של AcrB.

באמצעות ההליכים המוצגים כאן, דגימות של סוג פראי E. coli AcrB ו E. coli מוטציה AcrB-P223G טוהרו. הדגימות נספגו אז לרשתות מיקרוסקופיות של אלקטרון כתם שלילי פחמן ומוכתמות באמצעות אורניל אצטט בשיטת הכתםהצדדית 22. תמונות כתם שליליות נאספו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. תמונת הכתם ...

Watch this Scientific Journal Video about Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis at JoVE.com

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

native-cell-membrane-nanoparticles-system-for-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.9K Views.  Virginia Commonwealth University. מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

Video: Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave pyrophosphate into two orthophosphate molecules, which is coupled with proton and/or sodium ion pumping across the membrane. Since no homologous proteins occur in animals and humans, mPPases are good candidates in the design of potential drug targets. Here we present a detailed protocol to screen for mPPase inhibitors utilizing the molybdenum blue reaction in a 96 well plate system. We use mPPase from the thermophilic bacterium Thermotoga maritima (TmPPase) as a model enzyme. This protocol is simple and inexpensive, producing a consistent and robust result. It takes only about one hour to complete the activity assay protocol from the start of the assay until the absorbance measurement. Since the blue color produced in this assay is stable for a long period of time, subsequent assay(s) can be performed immediately after the previous batch, and the absorbance can be measured later for all batches at once. The drawback of this protocol is that it is done manually and thus can be exhausting as well as require good skills of pipetting and time keeping. Furthermore, the arsenite-citrate solution used in this assay contains sodium arsenite, which is toxic and should be handled with necessary precautions.

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Here we present a screening method for membrane-bound pyrophosphatase (from Thermotoga maritima) inhibitors based on the molybdenum blue reaction in a 96 well plate format.

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...