שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סינתזת פפטיד כגון סינתזה של פפטידים עשירים disulfide וקביעת דפוס גשר disulfide המתאים שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת סינתזה סלקטיבית של איזומרים שונים פפטיד דיסולפיד פנד ואת האפיון הכימי והמבני הבאים שלהם. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו כי כל פפטיד עשיר disulfide מתנהג אחרת.
סינתזה וניתוח עשויים להיות אופטימיזציה חלקית עבור פפטיד בודדים או חלבון. העבר את הרייטנטים המפורטים בפרוטוקול הטקסט לכלי הדם המתאימים והצב אותם במחבטים המתאימים של סינתיסייזר פפטיד שלב מוצק. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיליגרם של שף יבש לעמודי התגובה ומכניסים אותם למחבט של הסינתיסייזר.
התחל את סינתזת הפפטיד בשלב מלא כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר הסינתזה הושלמה, ליופילים את הרף בן לילה. עכשיו לחשוף את הפפטיד מן השף ולבצע הגנה עמוקה של שרשראות הצד.
כדי לעשות זאת לשלב את בשרף מיובש בצינור 12 מיליליטר ו לקרר אותו לאפס מעלות צלזיוס על קרח. ראשית, מוסיפים 150 מיקרוליטרים של תערובת נבלות, ולאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של 95% חומצה טריפלואורואצטית לכל 100 מיליגרם של שרף. השאירו את התערובת רועדת בעדינות במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר.
עכשיו, לסנן את התערובת דרך פריט זכוכית. לאסוף את הסינון בצינורות, בנפרד מלא אתר diethyl קר כקרח במיליליטר אחד של תערובת מחשוף לכל שמונה עד 10 מיליליטר של אתר diethyl. הפפטיד מזרז כמוצק לבן.
לאחר שטיפה וצנטריפוגה של הצינורות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לייבש את הפפטידים. כדי לטהר את המבשר ליניארי עם כרומטוגרפיה הכנה למחצה להוסיף כ 70 מיליגרם של פפטיד גולמי צינור 15 מיליליטר. לאחר מכן ממיסים את הפפטיד הגולמי ב-0.1% TFA ובאצטוניטריל אחד לאחד למים.
הפרד את תערובת הפפטיד באמצעות שיפוע של אפס עד 50%Eluent B במשך 120 דקות בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה. אסוף את השברים בצינורות בודדים כפי שהם מופיעים והכן שברים נבחרים עבור ספקטרומטריית מסה וניתוח HPLC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לייבש את השברים ולשלב את שברי העמית.
התחל את היווצרות סלקטיבית של איגרות חוב disulfide על ידי ביצוע החמצון הראשון. כדי לעשות זאת, להמיס 15 מיליגרם של פפטיד ליניארי מיובש בהקפאה ב 105 מיליליטר של תערובת מים isopropanol. השאירו את התערובת תוך ערבוב באוויר בתנאים בסיסיים במשך 12 עד 48 שעות.
הליך החמצון צעד אחר צעד הוא קריטי מאוד. פקדי תגובה נלקחים בכל שלושת שלבי החמצון כדי להבטיח היווצרות עשירה בדיסולפידים בודדים. החמצון השלישי הוא המכריע ביותר, כי ערבוב disulfide יכול להתרחש כאשר זמן התגובה האופטימלי הוא חריגה.
עכשיו תבצע את החמצון השני. ממיסים 15 מיליגרם של פפטיד מיובש בהקפאה ב 105 מיליליטר של מים isopropanol, תערובת אחת חומצה הידרוכלורית טוחה. הוסף 158 מיקרוליטרים של תותב יוד טוחן 0.1 במתנול לפתרון.
מערבבים את התגובה בטמפרטורת החדר עד שהחמצון הושלם. ואז לעצור את התגובה על ידי הוספת 79 microliters של חומצה אסקורבית טוחן אחד במים. לבסוף לבצע את החמצון השלישי.
ממיסים 15 מיליגרם של פפטיד מיובש בהקפאה ב 5.5 מיליליטר של TFA המכיל תערובת נבלות. לזרז את הפפטיד לתוך צינורות המכילים אתר diethyl קר במיליליטר אחד של פתרון תגובה לכל שמונה עד עשרה מיליליטר של אתר diethyl. כדי לבצע טיהור פפטיד ב 15 מיליגרם של המוצר הגולמי מיובש בהקפאה לצינור 15 מיליליטר.
ממיסים את המוצר הגולמי בנפח של לולאת מדגם HPLC באמצעות תערובת של 0.1%TFA ואחד לאחד אצטוניטריל למים. לאחר מערבולת עד פירוק מלא, צנטריפוגה הפתרון מדקה אחת ב 3400 פעמים G.Draw את התערובת 3.6 מיליליטר במזרק 5 מיליליטר ולהזריק את המדגם ללא כל בועות אוויר לתוך לולאת ההזרקה. הפעל את ההזרקה למערכת HPLC.
לטהר את תערובת פפטיד באמצעות שיפוע של אפס עד 50% Eluent B מעל 120 דקות בקצב זרימה של 10 מיליליטר לדקה. לאסוף את השברים בצינורות בודדים כפי שהם מופיעים. לאחר השלמת הריצה, הכן שברים נבחרים לניתוח MS ו- HPLC כמתואר בטקסט.
לייבש את כל השברים ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע HPLC אנליטי, העבר דגימות של שברי הפפטיד או פקדי התגובה לתוך בקבוקון HPLC והמס אותו בתערובת של 0.1%TFA באחד לאחד Acetonitrile למים. מקם את בקבוקון HPLC לתוך הדוגם האוטומטי של ערכת HPLC השלב ההפוך האנליטי להזרקת 250 מיקרוליטרים של כל דגימה.
השתמש במערכת אלוט הדרגתית של 0.1%TFA במים כמו Eluent A ב 0.1% TFA ב Acetonitrile כמו Eluent B.Analyze הפפטיד באמצעות שיפוע של 10%-40% אלואנט B מעל 30 דקות בקצב זרימה של 1.0 מיליליטר לדקה. כדי לבצע ניתוח חומצות אמינו, להעביר 100 מיקרוגרם של פפטיד טהור צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולהמיס את האבקה ב 200 microliters של שישה HCL טוחנת. לאחר העברת הפתרון לאמפולה זכוכית, לסגור את האמפולה על ידי חימום הצוואר עם להבה מבער bunsen.
לאחר מכן מניחים צינור זכוכית מחזיק את האמפולה בבלוק חימום במשך 24 שעות ב 110 מעלות צלזיוס להידרוליזה. לאחר 24 שעות, לפתוח את האמפולה ולהעביר את הפתרון לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר. צנטריפוגה הפתרון במשך שש שעות ב שישים מעלות צלזיוס ו 210 פעמים G ברכז ואקום סיבובי.
לאחר מכן ממיסים את המוצר שעבר הידרוליז ב-192 מיקרוליטרים של מאגר הדילול שנדגם ומעבירים את הפתרון למסנן מיקרו צנטריפוגלי. לאחר צנטריפוגה המדגם במשך דקה אחת ב 2300 פעמים G, להעביר 100 microliters של הסינון לתוך צינור מדגם ניתוח חומצת אמינו. מניחים את הצינור לתוך מנתח חומצות אמינו ולהתחיל את הניתוח.
במהלך פרוטוקול הפחתה זה בעבר, חיוני לקחת מספר בקרות תגובה על מנת להשיג פעמיים או ארבע פעמים קאפה mido מתילציה מינים אשר חיוניים לניתוח disulfide הבאים באמצעות ספקטרומטריית מסה. ראשית להמיס 600 מיקרוגרם של פפטיד טהור ב 1.2 מיליליטר של 0.05 מאגר ציטראט טוחן המכיל TCEP. הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר לוקח כמה 100 דגימות בקרת תגובה microliter החל אפס עד 30 דקות.
מערבבים את הדגימות בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עם 300 microliters של מאגר אלקלציה כדי לעצור את התגובה ולבצע מתילציה קרבוניל של קבוצות תיול חינם. לעצור את התגובה לאחר חמש דקות על ידי הוספת 100 microliters של 10% TFA ומים ולאחסן את הדגימות על קרח יבש. כעת בצע HPLC על הדוגמאות כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
העבר כמות קטנה של כל שבר שנאסף לצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר לניתוח MS / MS של הצורות מחומצן. ממיסים את הפפטיד הנותר ב-0.1% TFA במים ומוסיפים נפח מתאים על פני פתרון TCEP של 100 מילימולרים כדי לקבל ריכוז TCEP סופי של 10 מילימולרים. בשלב זה, אלקילציה ציסטאין סלקטיבית ניתן לבדוק באמצעות רצף פפטיד.
עם שני הפפטידים באמצע, נחישות של דפוס גשר disulfide אפשרי. ניתוח NMR של isomers שונים מתבצעת כדי לחשוף את מבני פפטיד בודדים. 20 המבנים בעלי האנרגיות הנמוכות ביותר, כמו גם הקישוריות הדיסולפידית של האיסומרים השונים מוצגים.
יש לציין כי נדרש שילוב של פיצול HPLC MS/MS בשלבים הפוכים וניתוח NMR לזיהוי חד משמעי של קישוריות הדיסולפיד. ההשוואה של ערך סטייה ריבועית השורש הבהיר כי פפטיד נוקשה בעיקר מוביל מבנה NMR נפתר טוב יותר. וידאו זה צריך לתת לך דוגמה כיצד לסנתז באופן סלקטיבי פפטידים עם דפוס הקשר הרצוי disulfide.
זה גם מראה את האפשרות לבדוק את הקישוריות disulfide הנכון באמצעות ספקטרומטריית מסה רכה ולקבל מבנה תלת מימדי באמצעות ספקטרוסקופיה NMR. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום סינתזת הפפטיד לחקור את החשיבות של דפוסי קשר דיסולפידיים למבנה התלת מימדי וכתוצאה מכך את הפעילות של isomers פפטיד כזה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ASAS פעילות על מנת לקבל תובנה על יחסי פעילות מבנה של isomers פפטיד שונים ביעד הביולוגי הספציפי.
למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך הסינתזה וניתוח של conotoxins, זה יכול להיות מיושם גם על פפטידים גשר disulfide אחרים וחלבונים כגון fenzens, רעלנים בעלי חיים עשירים דיסולפיד ומולקולות אחרות המכילות ציסטאין מרובים.
