אנו מודים Kaz Kazaosa ו Akiko Shiratsuchi על עצתם.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת טריים ענבים אגר צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ&quot;ל מים ל -4.4 גרם של אגר, ומחממים את התערובת בתנור מיקרוגל כדי לפזר אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 מ&quot;ל של מיץ ענבים טריים, 5 מ&quot;ל של חומצה אצטית, ו 5 מ&quot;ל של אתנול לפתרון אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 1.5 מ&quot;ל של הפתרון עם פיפטה על כל שקופית זכוכית, ולאפשר לו לחזק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 6 ס&quot;מ צלחות agarose צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 50 מ&quot;ל מים ל 0.5 גרם של agarose, לחמם את התערובת בתנור מיקרוגל כדי להמיס agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 2.5 מ&quot;ל של תמיסת agarose על צלחת 6 ס&quot;מ עם פיפטה. </li></ol></li></ol> 2. שלב 16 אוסף העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף זבובים למבוגרים, ולהוסיף 200 נקבות ו 200 גברים לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים צלחת של אגר ענבים טריים על שמרים לתוך צינור 50 מ&quot;ל, ולסגור עם ספוג ספוגעמ &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זבובים ב 16 מעלות צלזיוס באור למשך 2-3 ימים. שנה את הצלחת פעם ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הזבובים בחושך על 25 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את צלחת הישן אחד חדש ללא שמרים. אפשר זבובים להטיל ביצים עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הצלחת דגירה על 16 מעלות צלזיוס במשך 26 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף העוברים מן הצלחת עם מברשת צבע לתוך 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברי פעמיים עם 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הסיסית, להוסיף 1.2 מ&quot;ל של תמיסת hypochlorite נתרן (2.2 - 3.4% Cl) לעוברים במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברי 4 פעמים עם 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עוברים על 6 ס&quot;מ צלחות agarose צלחת. לאסוף שלב 16 עוברי תחת מיקרוסקופ כפי שתואר על ידי רוברטס 20 . איסוף כ 50 עוברי ב 1.5-מ&quot;ל Treff מיקרו צינור הבדיקה עם micropipette. </li></ol> 3. PrepaRation של תאים עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברי פעמיים עם 150 μL של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize עוברים 30 פעמים ב 1.5 מ&quot;ל צינור בדיקה מיקרו מערבל גלולה בנוכחות μL 200 של collagenase (0.25% (w / v)) ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר תאים עובריים ידי pipetting 10 פעמים, ולהזיז את ההשעיה התא לצינור 1.5 מ&quot;ל. דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות באמבט מים. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 800 μL של PBS ההשעיה התא, צנטריפוגות ב 1400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 200 μL של טריפסין (0.25% (w / v)) ב PBS לתאים. לפזר תאים עובריים ידי pipetting 50 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנן את ההשעיה התא עם מסננת 70 מיקרומטר Cell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפסיק פעילות trypsin, להוסיף 40 חום μL- חום מעובה בסרום שור עוית ​​ההשעיה תא מסוננים. הוסף 800 μL של PBS ו צנטריפוגות ב 1,400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernataNt, להשעות תאים זירז 200 μL של PBS, צנטריפוגות ב 1400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, ו להשעות תאים זירז 30 μL של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר ההשעיה תא מוכן על aminopropyl triethoxysilane מצופה שקופיות זכוכית, ולחכות 10 - 15 דקות עד התאים לצרף את השקופיות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון הנותר על שקופיות זכוכית עם פיפטה. הר 60 - 70 μL של PBS המכיל 4% (w / V) PFA (paraformaldehyde) על תאים 10 - 15 דקות עבור קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון קיבוע, ומכניסים שקופיות זכוכית לתוך PBS במשך יותר מ 1 דקות. </li></ol> 4. מכתים של Hemocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining עם נוגדן אנטי Croquemort <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקורית להשרות שקופיות זכוכית מתנול במשך 10 דקות, ב PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 במשך 10 דקות, ולאחר מכן ב- PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של 5% (V / V) בסרום חזיר שלם PBS containiNg 0.2% (v / v) Triton X-100 על תאים לחסימה. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מן שקופיות זכוכית, ועל הר 20 μL של antiserum אנטי Croquemort 19, 21 (0.1% (v / v)) ב PBS המכיל 0.2% (v / v) טריטון X-100 על תאים. דגירה שקופיות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג שקופיות זכוכית PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של פוספטז אלקליין שכותרתו נגד עכברוש IgG (0.5% (v / v)) ב PBS המכיל 0.2% (v / v) טריטון X-100 ו 5% (v / v) בסרום חזיר שלם על תאים בחדר טמפרטורה עבור 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית במאגר המכיל 100 מ&quot;מ Tris-HCl, pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תמיסת המצע phosphatase המכיל 0.23 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​5-bromo-4כלור-3-אינדוליל-פוספט (BCIP), 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​nitro כחול tetrazolium (NBT), 100 מ&quot;מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 על תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ עבור מכתים נכונה. כאשר אותות סגולים חזקים מופיעים גרגירים של hemocytes, להסיר את הפתרון המצע, ו להשרות שקופיות זכוכית במאגר המורכב 10 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8.5 ו 1 מ&quot;מ EDTA. מכתים כ 5 - 10 דקות מומלץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining עם נוגדן אנטי GFP (אפשרות נוספת מכתים של hemocytes) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Serial להשרות שקופיות זכוכית מתנול במשך 10 דקות, PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 במשך 10 דקות, ו PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של 5% (V / V) בסרום חזיר שלם PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 על תאים לחסימה. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון על שקופיות זכוכית, ואת הר 20 μL של נוגדנים נגד נוגדנים GFP (1% (V / V)) / PBS געל 0.2% (v / v) טריטון X-100 על תאים. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג שקופיות זכוכית PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של הפוספטאז אלקליין שכותרתו נגד עכבר IgG (0.5% (V / V)) ב PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 ו 5% (V / V) סרום חזיר שלם על תאים בחדר טמפרטורה עבור 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית במאגר המורכב 100 מ&quot;מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הפתרון phosphatase המצע המכיל 0.23 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BCIP, 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​NBT, 100 מ&quot;מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 על תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ עבור מכתים נכונה. כאשר אותות סגולים מופיעים hemocytes שלם, להסיר את הפתרון המצע ולספוג שקופיות במאגר המורכבשל 10 מ&quot;מ Tris-HCl, pH8.5 ו 1 מ&quot;מ EDTA. מכתים כ 10 - 15 דקות מומלץ. </li></ol></li></ol> 5. כתם תאים אפופטוטיים על ידי TUNEL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות זכוכית PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם PBS חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חיץ איזון (ראה חומרים לוח) על תאים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון משקופיות זכוכית, ואת הר 20 μL של פתרון TdT המכיל 5 μL של טרנזיט deoxynucleotidyl מסוף ו 15 μL של תגובה למאגר על תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון משקופיות זכוכית, ולספוג שקופיות במאגר המורכב של 0.5 מ&quot;ל STOP / לשטוף חיץ ו 17 מ&quot;ל של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים שקופיות PBS במשך 5 דקות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של אנטי Digoxigenin-peroxidase על תאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות זכוכית PBS במשך 5 דקות 4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית תמיסת המצע peroxidase בהיקף של 30 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ טריס HCl, pH7.5 מכיליםGa מלא spatula מיקרו של 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB), ו 0.002% (v / v) H 2 O 2 במשך 30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.9 עד תאים אפופטוטיים מוכתמים חום. השריה שקופיות זכוכית במים כדי לעצור את התגובה peroxidase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף תאים עם מים לתצפית. </li></ol> 6. למדוד את רמת phagocytosis של תאים אפופטוטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון דגימות תחת מיקרוסקופ אור על מנת להעריך את רמת phagocytosis. Count Crocemort חיובי תאים או תאים GFP חיובי כמו hemocytes, תאים TUNEL חיובי כמו תאים אפופטוטיים, ותאים חיוביים כפול כמו hemocytes phagocytosing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד phagocytic מוגדר כמספר תאים חיוביים כפול למספר הכולל של תאים חיוביים Croquemort או תאים חיוביים GFP. מומלץ כי יותר מ 300 hemocytes הם נצפו. </li></ol>

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116 (2), 205-219 (2004).</li><li>Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+development.">Cell death in development.</a> Cell. 96 (2), 245-254 (1999).</li><li>Savill, J., Fadok, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corpse+clearance+defines+the+meaning+of+cell+death.">Corpse clearance defines the meaning of cell death.</a> Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).</li><li>Ravichandran, K. S., Lorenz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells:+signals+for+a+good+meal.">Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal.</a> Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beginnings+of+a+good+apoptotic+meal:+the+find-me+and+eat-me+signaling+pathways.">Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways.</a> Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).</li><li>Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+removal+of+cells+that+have+become+unwanted:+implications+for+animal+development+and+tissue+homeostasis.">Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis.</a> Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).</li><li>Reddien, P. W., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+engulfment+process+of+programmed+cell+death+in+caenorhabditis+elegans.">The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).</li><li>Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+programmed+cell+deaths+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).</li><li>Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+the+engulfment+of+cell+corpses+during+programmed+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).</li><li>Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CED-12/ELMO,+a+novel+member+of+the+CrkII/Dock180/Rac+pathway,+is+required+for+phagocytosis+and+cell+migration.">CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration.</a> Cell. 107 (1), 27-41 (2001).</li><li>Hsu, T. Y., Wu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells+in+C.+elegans+is+mediated+by+integrin+alpha/SRC+signaling.">Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling.</a> Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+factor+that+links+apoptotic+cells+to+phagocytes.">Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.</a> Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).</li><li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster.">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).</li><li>Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+during+Drosophila+embryogenesis.">Programmed cell death during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 117 (1), 29-43 (1993).</li><li>Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+croquemort+in+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).</li><li>Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+innate+immunity+in+Drosophila+by+endogenous+chromosomal+DNA+that+escaped+apoptotic+degradation.">Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation.</a> Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).</li><li>Manaka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draper-mediated+and+phosphatidylserine-independent+phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+Drosophila+hemocytes/macrophages.">Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages.</a> J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).</li><li>Kuraishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretaporter,+a+Drosophila+protein+serving+as+a+ligand+for+Draper+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+cells.">Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells.</a> Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).</li><li>Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Croquemort,+a+novel+Drosophila+hemocyte/macrophage+receptor+that+recognizes+apoptotic+cells.">Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells.</a> Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).</li><li>Kuraishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+calreticulin+as+a+marker+for+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).</li><li>Nagaosa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila+embryos.">Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos.</a> J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).</li><li>Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alphaPS3/betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+and+bacteria+in+Drosophila.">Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila.</a> J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).</li><li>Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NPxY+motif+in+Draper-mediated+apoptotic+cell+clearance+in+Drosophila.">Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila.</a> Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).</li><li>Bruckner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Pathway+for+Phagocyte+Priming+upon+Encounter+with+Apoptotic+Cells.">Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells.</a> J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+disease+and+impaired+uptake+of+apoptotic+cells+in+MFG-E8-deficient+mice.">Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice.</a> Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

<html> אנו כאן תיאר assay phagocytosis באמצעות עוברים תסיסנית . על ידי שימוש בתאים עובריים מפוזרים למדוד phagocytosis כמותית, hemocytes, phagocytes מקצועי תסיסנית , הם immunostained עבור סמן hemocyte Croquemort או srpHemo מונע GFP, תאים אפופטוטיים מזוהים על ידי TUNEL בפרוטוקול זה. רמת phagocytosis מתבטא כמו אי?...

אצל בעלי חיים metazoan, למשל נמטודות Caenorhabditis elegans , זבוב הפירות תסיסנית melanogaster , ועכברים ובני אדם, מספר רב של תאים עוברים אפופטוזיס במהלך הפיתוח כדי לעצב את גופם בבגרות כדי לשמור על הומאוסטזיס 1 , 2 . תאים אפופטוטיים יש להסיר במהירות כי הם גורמים לדלקת ברקמות הסובבות על ידי שחרור חומרים תאיים immunogenic אם לא הוסר לחלוטין 3 . על מנת להקל על הסרה מהירה, תאים אפופטוטיים מציגים את מה שמכונה &quot;אותות האכילה&quot; המוכרים על ידי קולטני ההטיה של פגוציטים, ומוסרים על ידי phagocytosis 3 , 4 , 5 , 6 . לפיכך, phagocytosis משחק תפקיד מכריע תחזוקה של הומאוסטזיס מארח, ומכאן, הבהרת המולקא<html> מנגנוני lar שבבסיס phagocytosis של תאים אפופטוטיים הוא בעל חשיבות. המנגנונים האחראים על phagocytosis של תאים אפופטוטיים נראה שימור evolutionally בין המינים של נמטודות, זבובים, ועכברים 7 . כמה מבחני phagocytosis זמינים כעת כדי להעריך את ההטיה של תאים אפופטוטיים אלה בעלי חיים מודל. ב C. elegans , 131 תאים סומטיים עוברים מוות התא מתוכנת במהלך הפיתוח, גופות תאים הם phagocytosed על ידי תאים סמוכים, אשר פגוציטס לא מקצועי 8 . לפיכך, ספירת מספר גופות תאים שנותרו ב C. elegans מציין את רמת phagocytosis ב vivo . על ידי חיפוש מוטציות nematode המציגות מספר גדל של תאים מתים, מספר גנים הדרושים phagocytosis זוהו ו מאופיינים גנטית 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Ex vivo phagocytosis מבחני עם phagocytes התרבות הראשית, בדרך כלל מקרופאגים, מנוצלים לעתים קרובות בעכברים. תאים אפופטוטיים מוכנים באמצעות שורות תאים כגון תאי Jurkat, והם מעורבים עם phagocytes הראשי. לאחר הדגירה במשך מספר שעות, את המספר הכולל של phagocytes ו phagocytes משתלט נספרים על מנת להעריך את רמת phagocytosis. כמו שינוי מתוחכם של שיטה זו, קבוצה של Nagata פיתחה assay vago vago vagocytosis לשעבר עם תאים להביע ICP עמיד ICP (מעכבת של DNase המופעל Caspase), שבו תאים אפופטוטיים לא עוברים פיצוץ DNA אפופטוטיים, אבל DNA הוא עדיין מתוחכם כאשר תאים הם phagocytosed. כאשר תאים אלה משמשים מטרות אפופטוטיים assay phagocytosis, רק ה- DNA של תאים אפופטוטיים אפוף הוא מקוטע, ומוכתמת על ידי TDT בתיווך DUTP סוף סוף תיוג (TUNEL). לכן, את leveL של תא אפופטוטי תא נמדדת על ידי ספירת אותות TUNEL בתערובת של phagocytes ותאים אפופטוטיים 13 . ב ד melanogaster , phagocytes מקצועי בשם hemocytes, מקרופאגים תסיסנית , אחראים phagocytosis של תאים אפופטוטיים 14 , 15 . בנוסף מבחני phagocytosis מבחנה עם שורות תאים התרבות, ב vivo מבחני phagocytosis עם עוברי תסיסנית מלאים זמינים. עוברים תסיסנית הם כלי רב עוצמה לבחינת רמת התא אפופטוטיים תא כי תאים רבים עוברים אפופטוזיס והם phagocytosed על ידי hemocytes במהלך התפתחות עובריים 14 , 15 , 16 . דוגמה של vivo phagocytosis assay היא השיטה שפותחה על ידי הקבוצה של פרנק. בשיטה שלהם, hemocytes הם דההנגוע על ידי immunostaining של peroxidasin, סמן hemocyte, תאים אפופטוטיים מוכתמים באמצעות צבע גרעיני, 7-אמינו actinomycin D בכל עוברי תסיסנית , ומספר תאים חיוביים כפולים נספר כאות של phagocytosis 17 . דוגמה נוספת של assay phagocytosis על עוברים מבוסס על הרעיון של השיטה של ​​Nagata המתואר לעיל; עם זאת, in vivo phagocytosis מוערך באמצעות העוברים של dCAD (דרוזופילה caspase-מופעל DNase) זבובים מוטנטיים 18, 19. אלה מבחני phagocytosis vivo שימושיים עבור התבוננות ישירה phagocytosis באתרו . עם זאת, קשיים קשורים עם למעט כל הטיה אפשרית בשלב של ספירת תאים phagocytosing כי קשה לראות את כל phagocytes ותאים אפופטוטיים בעוברים שלמים בשל עובי שלה. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מפתחיםEd assay phagocytosis חדש בעוברים תסיסנית . בשיטה שלנו, על מנת לספור בקלות hemocytes phagocytosing, עוברים שלמים הם homogenized להכין תאים עובריים מפוזרים. Phagocytes מזוהים על ידי immunostaining של סמן phagocyte, ותאים אפופטוטיים מזוהים על ידי TUNEL עם תאים אלה עובריים מפוזרים. השימוש בתאים מפוזרים עובריים מאפשר לנו למדוד ברמות phagocytosis vivo כאילו בצענו assay phagocytosis במבחנה ב שדווקא מכמת את רמת phagocytosis. כל genotypes של זבובים ניתן להשתמש assay זה אם הם מתפתחים לשלב 16 של עוברי 20 , שלב התפתחותי שבו אפופטוזיה התא אישור על ידי phagocytosis הוא בשפע ביותר. שיטה זו יש את היתרון של הערכת רמת phagocytosis כמותית, ולכן, עשוי לתרום זיהוי של מולקולות חדשות המעורבים phagocytosis של תאים אפופטוטיים in vivo .

<table><tbody><tr><td>whole swine serum</td><td>MP Biomedicals</td><td>55993</td><td>For bloking</td></tr><tr><td>Treff micro test tube(easy fit)&amp;nbsp; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 4625. 9. 01</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>pellet mixer&amp;nbsp; 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 7339. 9. 03</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>27250-018</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td><td>KPL</td><td>475-1612</td><td>secondary antibody for&lt;br/&gt; stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-&lt;br/&gt; 3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11383221001</td><td>BCIP, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>nitro blue tetrazolium</td><td>Roche</td><td>11383213001</td><td>NBT, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Anti-Croquemort antibody</td><td></td><td></td><td>described previously in Manaka &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Anti-GFP&lt;br/&gt; from mouse IgG1&amp;kappa; (clones 7.1 and 13.1)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6520</td><td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine&lt;br/&gt; tetrahydrichloride</td><td>nacalai tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Fly Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock center&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock ID&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Control flies, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>drpr&lt;sup&gt;&amp;Delta;5&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>drpr mutant, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>Itgbn&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Itgbn mutant, described in Devenport &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Development, 131, 5405-5415</td></tr><tr><td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td><td></td><td></td><td>described in Br&amp;uuml;ckner &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Dev. Cell., 7, 73-84</td></tr><tr><td>UAS-drpr-IR</td><td>VDRC</td><td>4833</td><td>-</td></tr><tr><td>UAS-Itgbn-IR</td><td>NIG-fly</td><td>1762R-1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

המנגנונים המולקולריים שבבסיס phagocytosis של תאים אפופטוטיים צריך להיות בהבהרה בפירוט רב יותר בשל תפקידה של מחלות דלקתיות ומחלות דלקתיות. פיתחנו שיטה ניסיונית לחקור phagocytosis כמותית באמצעות זבוב פירות תסיסנית , שבו רשת הגן השליטה התגובות התגלות הוא שימור evolutionally מ יונקים. על מנת לאתר במדויק ולספור phagocytes בולע ו un -ulfing באמצעות חיות שלמות, עוברי תסיסנית היו homogenized להשיג תאים מפוזרים, כולל phagocytes ותאים אפופטוטיים. השימוש בתאי מפוזר עובריים מאפשרת לנו למדוד in vivo רמות phagocytosis כאילו ביצענו assay phagocytosis במבחנה שבה אפשר להתבונן כל פגוציטים ותאי אפופטוטיים עוברים שלם ומדויק לכמת את רמת phagocytosis. אישרנו כי שיטה זו משחזרת את אלה של מחקרים קודמיםאשר זיהו את הגנים הנדרשים עבור phagocytosis של תאים אפופטוטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח של תאים מתים כדי להיות מנותח, וכאשר בשילוב עם הגנטיקה החזקה של תסיסנית , יגלה את התגובות phagocytic מורכבים המורכבת של הגירה, הכרה, בליעה, והשפלה של תאים אפופטוטיים על ידי phagocytes.

על מנת לבחון את phagocytosis של תאים אפופטוטיים, עוברים תסיסנית של שלב 16 ההתפתחותי נאספו והוכנו כמו תאים מפוזרים. Hemocytes, מקרופאגים תסיסנית , היו מוכתמים על ידי immunocytochemistry עבור סמן hemocyte &quot;Croquemort&quot; 17 , 22 באמצעות נוגד...

Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

phagocytosis-assay-for-apoptotic-cells-in-drosophila-embryos

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

9.8K Views.  Kanazawa University.  אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים. 

Video: Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Neuroscience

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Biology

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

הערכת היכולת הייחודית ביותר לגיל מיוחד למבוגרים דרוזופילה מלאנוטציטים באמצעות שיטת בVivo פגוציטוזה

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

An In Vivo Assay to Quantify Bacterial Phagocytosis in Adult Drosophila Flies

Source: Nazario-Toole, A. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59543">Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an in vivo assay designed to measure bacterial phagocytosis in adult Drosophila flies. Following the injection of fluorescently labeled bacteria into the abdomen of adult flies, hemocytes associated with the dorsal vessel engage in phagocytosis. The introduction of trypan blue dye serves to quench the fluorescence emitted by extracellular, non-phagocytosed bacteria. This quenching process enhances the identification of phagocytosed bacteria when observed under a fluorescence microscope.

בדיקת In Vivo לכימות פגוציטוזה חיידקית בזבובי דרוזופילה בוגרים

1. Prepare Fluorescein particles for injection

	Reconstitute 10 mg of commercially available, heat-killed bacteria particles labeled with fluorescein ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

The Phagocytosis Assay: An Immunostaining Technique to Visualize Apoptotic Cell Engulfment in the Embryonic Cells of Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. <a href="https://app.jove.com/v/56352">Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining technique to visualize apoptotic cell engulfment in the homogenized embryonic cells of Drosophila melanogaster. This method provides insights into cellular physiology by determining the extent of apoptotic cell engulfment.

בדיקת פגוציטוזיס: טכניקה של צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים של Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining ...

Biological Techniques

Assay Techniques

Cell-based assays

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

Source: Taruc, K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58149">Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

בדיקת אפרוציטוזה של תאים קבועים: שיטה לחקר ספיגה אפרוציטית של תאים אפופטוטיים על ידי מקרופאגים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Source: Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video