אנו מודים Kaz Kazaosa ו Akiko Shiratsuchi על עצתם.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת טריים ענבים אגר צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ&quot;ל מים ל -4.4 גרם של אגר, ומחממים את התערובת בתנור מיקרוגל כדי לפזר אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 מ&quot;ל של מיץ ענבים טריים, 5 מ&quot;ל של חומצה אצטית, ו 5 מ&quot;ל של אתנול לפתרון אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 1.5 מ&quot;ל של הפתרון עם פיפטה על כל שקופית זכוכית, ולאפשר לו לחזק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 6 ס&quot;מ צלחות agarose צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 50 מ&quot;ל מים ל 0.5 גרם של agarose, לחמם את התערובת בתנור מיקרוגל כדי להמיס agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 2.5 מ&quot;ל של תמיסת agarose על צלחת 6 ס&quot;מ עם פיפטה. </li></ol></li></ol> 2. שלב 16 אוסף העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף זבובים למבוגרים, ולהוסיף 200 נקבות ו 200 גברים לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים צלחת של אגר ענבים טריים על שמרים לתוך צינור 50 מ&quot;ל, ולסגור עם ספוג ספוגעמ &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זבובים ב 16 מעלות צלזיוס באור למשך 2-3 ימים. שנה את הצלחת פעם ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הזבובים בחושך על 25 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את צלחת הישן אחד חדש ללא שמרים. אפשר זבובים להטיל ביצים עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הצלחת דגירה על 16 מעלות צלזיוס במשך 26 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף העוברים מן הצלחת עם מברשת צבע לתוך 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברי פעמיים עם 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הסיסית, להוסיף 1.2 מ&quot;ל של תמיסת hypochlorite נתרן (2.2 - 3.4% Cl) לעוברים במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברי 4 פעמים עם 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עוברים על 6 ס&quot;מ צלחות agarose צלחת. לאסוף שלב 16 עוברי תחת מיקרוסקופ כפי שתואר על ידי רוברטס 20 . איסוף כ 50 עוברי ב 1.5-מ&quot;ל Treff מיקרו צינור הבדיקה עם micropipette. </li></ol> 3. PrepaRation של תאים עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עוברי פעמיים עם 150 μL של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize עוברים 30 פעמים ב 1.5 מ&quot;ל צינור בדיקה מיקרו מערבל גלולה בנוכחות μL 200 של collagenase (0.25% (w / v)) ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר תאים עובריים ידי pipetting 10 פעמים, ולהזיז את ההשעיה התא לצינור 1.5 מ&quot;ל. דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות באמבט מים. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 800 μL של PBS ההשעיה התא, צנטריפוגות ב 1400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 200 μL של טריפסין (0.25% (w / v)) ב PBS לתאים. לפזר תאים עובריים ידי pipetting 50 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנן את ההשעיה התא עם מסננת 70 מיקרומטר Cell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפסיק פעילות trypsin, להוסיף 40 חום μL- חום מעובה בסרום שור עוית ​​ההשעיה תא מסוננים. הוסף 800 μL של PBS ו צנטריפוגות ב 1,400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernataNt, להשעות תאים זירז 200 μL של PBS, צנטריפוגות ב 1400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, ו להשעות תאים זירז 30 μL של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר ההשעיה תא מוכן על aminopropyl triethoxysilane מצופה שקופיות זכוכית, ולחכות 10 - 15 דקות עד התאים לצרף את השקופיות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון הנותר על שקופיות זכוכית עם פיפטה. הר 60 - 70 μL של PBS המכיל 4% (w / V) PFA (paraformaldehyde) על תאים 10 - 15 דקות עבור קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון קיבוע, ומכניסים שקופיות זכוכית לתוך PBS במשך יותר מ 1 דקות. </li></ol> 4. מכתים של Hemocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining עם נוגדן אנטי Croquemort <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקורית להשרות שקופיות זכוכית מתנול במשך 10 דקות, ב PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 במשך 10 דקות, ולאחר מכן ב- PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של 5% (V / V) בסרום חזיר שלם PBS containiNg 0.2% (v / v) Triton X-100 על תאים לחסימה. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מן שקופיות זכוכית, ועל הר 20 μL של antiserum אנטי Croquemort 19, 21 (0.1% (v / v)) ב PBS המכיל 0.2% (v / v) טריטון X-100 על תאים. דגירה שקופיות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג שקופיות זכוכית PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של פוספטז אלקליין שכותרתו נגד עכברוש IgG (0.5% (v / v)) ב PBS המכיל 0.2% (v / v) טריטון X-100 ו 5% (v / v) בסרום חזיר שלם על תאים בחדר טמפרטורה עבור 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית במאגר המכיל 100 מ&quot;מ Tris-HCl, pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תמיסת המצע phosphatase המכיל 0.23 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​5-bromo-4כלור-3-אינדוליל-פוספט (BCIP), 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​nitro כחול tetrazolium (NBT), 100 מ&quot;מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 על תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ עבור מכתים נכונה. כאשר אותות סגולים חזקים מופיעים גרגירים של hemocytes, להסיר את הפתרון המצע, ו להשרות שקופיות זכוכית במאגר המורכב 10 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8.5 ו 1 מ&quot;מ EDTA. מכתים כ 5 - 10 דקות מומלץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining עם נוגדן אנטי GFP (אפשרות נוספת מכתים של hemocytes) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Serial להשרות שקופיות זכוכית מתנול במשך 10 דקות, PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 במשך 10 דקות, ו PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של 5% (V / V) בסרום חזיר שלם PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 על תאים לחסימה. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון על שקופיות זכוכית, ואת הר 20 μL של נוגדנים נגד נוגדנים GFP (1% (V / V)) / PBS געל 0.2% (v / v) טריטון X-100 על תאים. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג שקופיות זכוכית PBS במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של הפוספטאז אלקליין שכותרתו נגד עכבר IgG (0.5% (V / V)) ב PBS המכיל 0.2% (V / V) טריטון X-100 ו 5% (V / V) סרום חזיר שלם על תאים בחדר טמפרטורה עבור 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית PBS המכיל 0.2% (V / V) Triton X-100 במשך 10 דקות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית במאגר המורכב 100 מ&quot;מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הפתרון phosphatase המצע המכיל 0.23 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BCIP, 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​NBT, 100 מ&quot;מ טריס HCl, pH 9.5, 100 מ&quot;מ NaCl, ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 על תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ עבור מכתים נכונה. כאשר אותות סגולים מופיעים hemocytes שלם, להסיר את הפתרון המצע ולספוג שקופיות במאגר המורכבשל 10 מ&quot;מ Tris-HCl, pH8.5 ו 1 מ&quot;מ EDTA. מכתים כ 10 - 15 דקות מומלץ. </li></ol></li></ol> 5. כתם תאים אפופטוטיים על ידי TUNEL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות זכוכית PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם PBS חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חיץ איזון (ראה חומרים לוח) על תאים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון משקופיות זכוכית, ואת הר 20 μL של פתרון TdT המכיל 5 μL של טרנזיט deoxynucleotidyl מסוף ו 15 μL של תגובה למאגר על תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון משקופיות זכוכית, ולספוג שקופיות במאגר המורכב של 0.5 מ&quot;ל STOP / לשטוף חיץ ו 17 מ&quot;ל של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים שקופיות PBS במשך 5 דקות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 20 μL של אנטי Digoxigenin-peroxidase על תאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות זכוכית PBS במשך 5 דקות 4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות שקופיות זכוכית תמיסת המצע peroxidase בהיקף של 30 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ טריס HCl, pH7.5 מכיליםGa מלא spatula מיקרו של 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrichloride (DAB), ו 0.002% (v / v) H 2 O 2 במשך 30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.9 עד תאים אפופטוטיים מוכתמים חום. השריה שקופיות זכוכית במים כדי לעצור את התגובה peroxidase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף תאים עם מים לתצפית. </li></ol> 6. למדוד את רמת phagocytosis של תאים אפופטוטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון דגימות תחת מיקרוסקופ אור על מנת להעריך את רמת phagocytosis. Count Crocemort חיובי תאים או תאים GFP חיובי כמו hemocytes, תאים TUNEL חיובי כמו תאים אפופטוטיים, ותאים חיוביים כפול כמו hemocytes phagocytosing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד phagocytic מוגדר כמספר תאים חיוביים כפול למספר הכולל של תאים חיוביים Croquemort או תאים חיוביים GFP. מומלץ כי יותר מ 300 hemocytes הם נצפו. </li></ol>

<ol>
	<li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+critical+control+points.">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116 (2), 205-219 (2004).</li><li>Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+development.">Cell death in development.</a> Cell. 96 (2), 245-254 (1999).</li><li>Savill, J., Fadok, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corpse+clearance+defines+the+meaning+of+cell+death.">Corpse clearance defines the meaning of cell death.</a> Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).</li><li>Ravichandran, K. S., Lorenz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells:+signals+for+a+good+meal.">Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal.</a> Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).</li><li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beginnings+of+a+good+apoptotic+meal:+the+find-me+and+eat-me+signaling+pathways.">Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways.</a> Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).</li><li>Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+removal+of+cells+that+have+become+unwanted:+implications+for+animal+development+and+tissue+homeostasis.">Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis.</a> Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).</li><li>Reddien, P. W., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+engulfment+process+of+programmed+cell+death+in+caenorhabditis+elegans.">The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).</li><li>Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+programmed+cell+deaths+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).</li><li>Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+the+engulfment+of+cell+corpses+during+programmed+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans.">Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).</li><li>Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CED-12/ELMO,+a+novel+member+of+the+CrkII/Dock180/Rac+pathway,+is+required+for+phagocytosis+and+cell+migration.">CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration.</a> Cell. 107 (1), 27-41 (2001).</li><li>Hsu, T. Y., Wu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engulfment+of+apoptotic+cells+in+C.+elegans+is+mediated+by+integrin+alpha/SRC+signaling.">Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling.</a> Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+factor+that+links+apoptotic+cells+to+phagocytes.">Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.</a> Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).</li><li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster.">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).</li><li>Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+during+Drosophila+embryogenesis.">Programmed cell death during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 117 (1), 29-43 (1993).</li><li>Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+croquemort+in+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).</li><li>Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+innate+immunity+in+Drosophila+by+endogenous+chromosomal+DNA+that+escaped+apoptotic+degradation.">Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation.</a> Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).</li><li>Manaka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Draper-mediated+and+phosphatidylserine-independent+phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+Drosophila+hemocytes/macrophages.">Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages.</a> J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).</li><li>Kuraishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretaporter,+a+Drosophila+protein+serving+as+a+ligand+for+Draper+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+cells.">Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells.</a> Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).</li><li>Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Croquemort,+a+novel+Drosophila+hemocyte/macrophage+receptor+that+recognizes+apoptotic+cells.">Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells.</a> Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).</li><li>Kuraishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+calreticulin+as+a+marker+for+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila.">Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).</li><li>Nagaosa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila+embryos.">Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos.</a> J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).</li><li>Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alphaPS3/betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+and+bacteria+in+Drosophila.">Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila.</a> J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).</li><li>Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NPxY+motif+in+Draper-mediated+apoptotic+cell+clearance+in+Drosophila.">Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila.</a> Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).</li><li>Bruckner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+Pathway+for+Phagocyte+Priming+upon+Encounter+with+Apoptotic+Cells.">Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells.</a> J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).</li><li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+disease+and+impaired+uptake+of+apoptotic+cells+in+MFG-E8-deficient+mice.">Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice.</a> Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

<html> אנו כאן תיאר assay phagocytosis באמצעות עוברים תסיסנית . על ידי שימוש בתאים עובריים מפוזרים למדוד phagocytosis כמותית, hemocytes, phagocytes מקצועי תסיסנית , הם immunostained עבור סמן hemocyte Croquemort או srpHemo מונע GFP, תאים אפופטוטיים מזוהים על ידי TUNEL בפרוטוקול זה. רמת phagocytosis מתבטא כמו אי?...

אצל בעלי חיים metazoan, למשל נמטודות Caenorhabditis elegans , זבוב הפירות תסיסנית melanogaster , ועכברים ובני אדם, מספר רב של תאים עוברים אפופטוזיס במהלך הפיתוח כדי לעצב את גופם בבגרות כדי לשמור על הומאוסטזיס 1 , 2 . תאים אפופטוטיים יש להסיר במהירות כי הם גורמים לדלקת ברקמות הסובבות על ידי שחרור חומרים תאיים immunogenic אם לא הוסר לחלוטין 3 . על מנת להקל על הסרה מהירה, תאים אפופטוטיים מציגים את מה שמכונה &quot;אותות האכילה&quot; המוכרים על ידי קולטני ההטיה של פגוציטים, ומוסרים על ידי phagocytosis 3 , 4 , 5 , 6 . לפיכך, phagocytosis משחק תפקיד מכריע תחזוקה של הומאוסטזיס מארח, ומכאן, הבהרת המולקא<html> מנגנוני lar שבבסיס phagocytosis של תאים אפופטוטיים הוא בעל חשיבות. המנגנונים האחראים על phagocytosis של תאים אפופטוטיים נראה שימור evolutionally בין המינים של נמטודות, זבובים, ועכברים 7 . כמה מבחני phagocytosis זמינים כעת כדי להעריך את ההטיה של תאים אפופטוטיים אלה בעלי חיים מודל. ב C. elegans , 131 תאים סומטיים עוברים מוות התא מתוכנת במהלך הפיתוח, גופות תאים הם phagocytosed על ידי תאים סמוכים, אשר פגוציטס לא מקצועי 8 . לפיכך, ספירת מספר גופות תאים שנותרו ב C. elegans מציין את רמת phagocytosis ב vivo . על ידי חיפוש מוטציות nematode המציגות מספר גדל של תאים מתים, מספר גנים הדרושים phagocytosis זוהו ו מאופיינים גנטית 9 , 10 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Ex vivo phagocytosis מבחני עם phagocytes התרבות הראשית, בדרך כלל מקרופאגים, מנוצלים לעתים קרובות בעכברים. תאים אפופטוטיים מוכנים באמצעות שורות תאים כגון תאי Jurkat, והם מעורבים עם phagocytes הראשי. לאחר הדגירה במשך מספר שעות, את המספר הכולל של phagocytes ו phagocytes משתלט נספרים על מנת להעריך את רמת phagocytosis. כמו שינוי מתוחכם של שיטה זו, קבוצה של Nagata פיתחה assay vago vago vagocytosis לשעבר עם תאים להביע ICP עמיד ICP (מעכבת של DNase המופעל Caspase), שבו תאים אפופטוטיים לא עוברים פיצוץ DNA אפופטוטיים, אבל DNA הוא עדיין מתוחכם כאשר תאים הם phagocytosed. כאשר תאים אלה משמשים מטרות אפופטוטיים assay phagocytosis, רק ה- DNA של תאים אפופטוטיים אפוף הוא מקוטע, ומוכתמת על ידי TDT בתיווך DUTP סוף סוף תיוג (TUNEL). לכן, את leveL של תא אפופטוטי תא נמדדת על ידי ספירת אותות TUNEL בתערובת של phagocytes ותאים אפופטוטיים 13 . ב ד melanogaster , phagocytes מקצועי בשם hemocytes, מקרופאגים תסיסנית , אחראים phagocytosis של תאים אפופטוטיים 14 , 15 . בנוסף מבחני phagocytosis מבחנה עם שורות תאים התרבות, ב vivo מבחני phagocytosis עם עוברי תסיסנית מלאים זמינים. עוברים תסיסנית הם כלי רב עוצמה לבחינת רמת התא אפופטוטיים תא כי תאים רבים עוברים אפופטוזיס והם phagocytosed על ידי hemocytes במהלך התפתחות עובריים 14 , 15 , 16 . דוגמה של vivo phagocytosis assay היא השיטה שפותחה על ידי הקבוצה של פרנק. בשיטה שלהם, hemocytes הם דההנגוע על ידי immunostaining של peroxidasin, סמן hemocyte, תאים אפופטוטיים מוכתמים באמצעות צבע גרעיני, 7-אמינו actinomycin D בכל עוברי תסיסנית , ומספר תאים חיוביים כפולים נספר כאות של phagocytosis 17 . דוגמה נוספת של assay phagocytosis על עוברים מבוסס על הרעיון של השיטה של ​​Nagata המתואר לעיל; עם זאת, in vivo phagocytosis מוערך באמצעות העוברים של dCAD (דרוזופילה caspase-מופעל DNase) זבובים מוטנטיים 18, 19. אלה מבחני phagocytosis vivo שימושיים עבור התבוננות ישירה phagocytosis באתרו . עם זאת, קשיים קשורים עם למעט כל הטיה אפשרית בשלב של ספירת תאים phagocytosing כי קשה לראות את כל phagocytes ותאים אפופטוטיים בעוברים שלמים בשל עובי שלה. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מפתחיםEd assay phagocytosis חדש בעוברים תסיסנית . בשיטה שלנו, על מנת לספור בקלות hemocytes phagocytosing, עוברים שלמים הם homogenized להכין תאים עובריים מפוזרים. Phagocytes מזוהים על ידי immunostaining של סמן phagocyte, ותאים אפופטוטיים מזוהים על ידי TUNEL עם תאים אלה עובריים מפוזרים. השימוש בתאים מפוזרים עובריים מאפשר לנו למדוד ברמות phagocytosis vivo כאילו בצענו assay phagocytosis במבחנה ב שדווקא מכמת את רמת phagocytosis. כל genotypes של זבובים ניתן להשתמש assay זה אם הם מתפתחים לשלב 16 של עוברי 20 , שלב התפתחותי שבו אפופטוזיה התא אישור על ידי phagocytosis הוא בשפע ביותר. שיטה זו יש את היתרון של הערכת רמת phagocytosis כמותית, ולכן, עשוי לתרום זיהוי של מולקולות חדשות המעורבים phagocytosis של תאים אפופטוטיים in vivo .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>whole swine serum</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>55993</td>
			<td>For bloking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treff micro test tube(easy fit)&#160; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 4625. 9. 01</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pellet mixer&#160; 1.5 mL</td>
			<td>TreffLab</td>
			<td>96. 7339. 9. 03</td>
			<td>For&#160; homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0130</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td>
			<td>27250-018</td>
			<td>For preparation of embryonic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td>
			<td>KPL</td>
			<td>475-1612</td>
			<td>secondary antibody for 
			stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro- 
			3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383221001</td>
			<td>BCIP, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11383213001</td>
			<td>NBT, For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Croquemort antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Anti-GFP 
			from mouse IgG1&#954; (clones 7.1 and 13.1)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>For staining of hemocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6520</td>
			<td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S7100</td>
			<td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine 
			tetrahydrichloride</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>11009-41</td>
			<td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Table of Fly Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>drpr&#916;5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itgbn2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described in Br&#252;ckner et al., Dev. Cell., 7, 73-84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-drpr-IR</td>
			<td>VDRC</td>
			<td>4833</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Itgbn-IR</td>
			<td>NIG-fly</td>
			<td>1762R-1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

המנגנונים המולקולריים שבבסיס phagocytosis של תאים אפופטוטיים צריך להיות בהבהרה בפירוט רב יותר בשל תפקידה של מחלות דלקתיות ומחלות דלקתיות. פיתחנו שיטה ניסיונית לחקור phagocytosis כמותית באמצעות זבוב פירות תסיסנית , שבו רשת הגן השליטה התגובות התגלות הוא שימור evolutionally מ יונקים. על מנת לאתר במדויק ולספור phagocytes בולע ו un -ulfing באמצעות חיות שלמות, עוברי תסיסנית היו homogenized להשיג תאים מפוזרים, כולל phagocytes ותאים אפופטוטיים. השימוש בתאי מפוזר עובריים מאפשרת לנו למדוד in vivo רמות phagocytosis כאילו ביצענו assay phagocytosis במבחנה שבה אפשר להתבונן כל פגוציטים ותאי אפופטוטיים עוברים שלם ומדויק לכמת את רמת phagocytosis. אישרנו כי שיטה זו משחזרת את אלה של מחקרים קודמיםאשר זיהו את הגנים הנדרשים עבור phagocytosis של תאים אפופטוטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח של תאים מתים כדי להיות מנותח, וכאשר בשילוב עם הגנטיקה החזקה של תסיסנית , יגלה את התגובות phagocytic מורכבים המורכבת של הגירה, הכרה, בליעה, והשפלה של תאים אפופטוטיים על ידי phagocytes.

על מנת לבחון את phagocytosis של תאים אפופטוטיים, עוברים תסיסנית של שלב 16 ההתפתחותי נאספו והוכנו כמו תאים מפוזרים. Hemocytes, מקרופאגים תסיסנית , היו מוכתמים על ידי immunocytochemistry עבור סמן hemocyte &quot;Croquemort&quot; 17 , 22 באמצעות נוגד...

Watch this Scientific Journal Video about Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos at JoVE.com

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

phagocytosis-assay-for-apoptotic-cells-in-drosophila-embryos

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

9.8K Views.  Kanazawa University.  אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים. 

Video: Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

בעקבות Cell-גורל ב

כמותי

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay