Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
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Damos las gracias a Anne-Marie Dion-Cote para los debates que conducen al desarrollo del método. JK y RB son FQNRT académicos de doctorado, M.-MG es un erudito Vanier CIHR, y J.-YM es un investigador senior FRSQ. Este trabajo fue apoyado por fondos de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de JY. M.

1. Producción de baculovirus recombinante Los baculovirus son generados utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen principalmente de acuerdo con el protocolo del fabricante con modificaciones sólo leves: <ol><li> A pFastBac1 vector modificado (Gibco, la vida) fue creado que contiene el GST y Sus etiquetas (Figura 2). El sitio de clonación múltiple (MCS) de un pET-52b (+) vector (Novagen), que contiene una 10xHis-tag, se insertó en el MCS de un vector pFastBac1 generar pFastBac1-Strep-10xHis. La secuencia de MCS pET-52b (+) fue amplificado por PCR entre los sitios de restricción XbaI y BLPI, la adición de un sitio de restricción BglII en el extremo 5 &#39;y un sitio de restricción HindIII en el extremo 3&#39;. El producto de PCR se clonó entonces entre BamHI y el sitio de restricción HindIII de pFastBac1, usando la compatibilidad de las secuencias de restricción BamHI y BglII. Puesto que el objetivo era generar un pFastBac1 permite la expresión deproteína recombinante con estreptavidina y 10xHis-tags, el sitio de restricción BamHI de pET-52b (+) no se utilizó la secuencia de MCS. Además, el sitio de restricción XbaI no se utilizó para evitar la redundancia de los sitios de restricción que se producen entre los sitios que ya están en el MCS de pFastBac1 y estos insertado con el MCS de pET-52b (+). A continuación, se inserta la secuencia de codificación GST con el sitio PreScission proteasa reconocimiento (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) en pFastBac1-Strep-10xHis. La secuencia de ADNc de GST a partir de pGEX-6P-2 (GE Healthcare) se amplificó por PCR con cebadores que contienen sitios de restricción NcoI y KpnI en los extremos 5 &#39;y 3&#39; extremidades, respectivamente. El sitio NcoI permite la adición de un codón de inicio sino también una alanina a la GST. El producto de PCR fue clonado en pFastBac1-Strep-10xHis entre los sitios de restricción NcoI y KpnI, dando lugar a la supresión de la estreptavidina-tag. El nuevo vector de fusión así obtenido se denominó pFastBac1-GST-10xHis. </li><li> Clonar el ADNc que codifica para la prOtein de interés en el vector pFastBac-GST-10xHis entre la GST (N-terminal) y la etiqueta de His (C-terminal). Tenga cuidado de eliminar el codón de parada de ADNc para permitir la fusión con el extremo C-terminal de His-tag. </li><li> Transformar E. coli DH10Bac con el pFastBac recombinante (obtenida en la etapa 1.2) para generar el bácmido. Permitir colonias para crecer durante la noche a 37 ° C y varias horas a 30 ° C en placas de selección que contienen Bluo-gal e IPTG (10 mg / ml de tetraciclina, 50 mg / ml de kanamicina, 7 mg / ml de gentamicina, 100 mg / ml de Bluo- Gal, 40 g / ml de IPTG). </li><li> Pick and restreak 2 colonias blancas (del Paso 1.3) en placas de selección para confirmar el fenotipo blanco. </li><li> Inocular 2 ml de LB que contienen 10 mg / ml de tetraciclina, 50 mg / ml de kanamicina, 10 mg / ml de gentamicina con las dos colonias blancas de la etapa 1.4 y dejarlos crecer durante la noche bajo agitación (250 rpm) a 37 ° C. </li><li> Con el fin de purificar el ADN bácmido, sedimentar las bacterias de la etapa 1.5,resuspender las células en 300 l de solución I y añadir 300 l de solución II (kit de Qiagen maxiprep). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente, añadir 300 l de 3 M KOAc pH 5,5 y se incuba durante 10 minutos en hielo. Centrifugar las muestras a 4 º C, la velocidad máxima durante 10 min. Añadir 800 l de isopropanol a los sobrenadantes y se incuba durante 10 minutos en hielo. Centrifugar las muestras durante 15 min a 4 ° C y lavar el precipitado con 500 l de etanol al 70%. Deje que el pellet seco y resuspender en condiciones estériles en 40 l de Tris-EDTA pH 8,0. El ADN bácmido debe almacenarse a 4 ° C. </li><li> Generar baculovirus como se describe en el protocolo del fabricante. Los baculovirus se pueden almacenar a 4 º C protegidas de la luz. </li></ol> 2. Expresión de proteínas recombinantes <ol><li> Con el fin de elegir el baculovirus más eficiente para la purificación y para vigilar a qué hora se alcanza el pico de expresión de la proteína, lleve a cabo un ensayo de mini-infección de unas sigue: Infect 2 x 10 7 Sf9 de células infectadas se cultivaron a 27 ° C en medio de Grace (complementado con 10% de FBS y 1% P / S) con 133 l (1/150) de baculovirus. Recoger alícuotas de 1,5 ml a 0, 24, 48, y 72 horas después de la infección. Sedimentar las células y analizar el nivel de expresión de la proteína de interés mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-etiqueta. </li><li> Utilice el baculovirus más eficiente desde el paso 2.1 para infectar una ruleta que contiene 1,0 x 10 6 células Sf9 por ml en 500 ml de los medios de comunicación con una proporción de 1/150 entre el virus y los medios de comunicación. Deje que las células infectadas crecen en suspensión a 27 º C y cosechan las células cuando se alcanza la máxima expresión de proteínas (según lo determinado en el paso 2.1). Las células sedimentadas se pueden almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 3. Preparación de lisado celular soluble Todas las siguientes etapas de incubación se llevan a cabo a 4 ° C en rotación suave. <ol><li> Lyse Scélulas F9 que expresan su proteína de interés en ~ 20 ml de tampón de unión de GST (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, 1 mM de DTT en PBS1X para una concentración final de NaCl de 250 mM, y el inhibidor de la proteasa cóctel (Roche). En un baño de agua helada, Dounce la solución 20x con un homogeneizador Dounce, sonicar 3x 30 segundos cada uno (salida 70%), y de nuevo Dounce 20x. </li><li> (Opcional). Incubar el lisado total de células con 1 mM de MgCl 2 y Benzonase nucleasa 7 (2,5 U / ml) durante 30 min a 4 ° C para eliminar la contaminación de ADN o ARN. </li><li> Centrifugar a 18000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Mantenga el sobrenadante. </li><li> (Opcional). Centrifugar el sobrenadante de nuevo durante 30 min a 18.000 rpm a 4 ° C para obtener un lisado soluble clara. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 o 0,45 micras para evitar obstrucciones. </li></ol> 4. Unión de la proteína en los granos de GST <ol><li> Incubar el lisado soluble de células con 1 ml de perlas de GST (previamente lavada dos veces con10 ml de tampón de unión de GST) durante 1 hora a 4 ° C en rotación suave. </li></ol> Comentario: El tiempo de incubación debe ser optimizado de acuerdo a la estabilidad de la proteína y la eficacia de unión. <ol start="2"><li> Un paseo rápido a 700 rpm y eliminar el sobrenadante que contiene las proteínas no unidas (esto se pueden mantener para su posterior análisis). Lavar las proteínas GST unida (Figura 3B, pista 1) con tampón de lavado de GST (GST tampón de unión con 350 mM de NaCl final de). </li><li> Repita el paso 4.2 2x. En el último lavado, eliminar la mayor cantidad sobrenadante como sea posible. </li><li> Incubar las perlas con 5 mM de ATP y 15 mM de MgCl 2 (en tampón de unión 10 ml de GST) durante 1 hora a 4 ° C para evitar la unión no específica de proteínas de choque térmico 8. Lavar las perlas tres veces con tampón de lavado de GST. </li></ol> 5. PreScission escisión del GST <ol><li> Centrifugar las perlas de GST, separar el sobrenadante y lavar las perlas de GST con P5 bufFer (50 mM NaHPO 4 pH 7,0, NaCl 500 mM, 10% de glicerol, 0,05% de Triton-X-100, imidazol 5 mM). </li><li> Incubar las GST-cuentas con enzima PreScission en tampón P5 de 3 horas a la noche a 4 ° C. (Divida las perlas de GST en fracciones de 100 l y agregue 4-8 unidades (2-4 mu l) de la enzima diluida en 100 l de tampón P5). </li></ol> Comentario: El tiempo de incubación de la etapa de PreScission debe ser optimizado de acuerdo con el peso molecular, así como la estabilidad de la proteína. Si se observa la degradación, este tiempo de incubación se puede disminuir a un mínimo de 2 horas en lugar de durante la noche. <ol start="3"><li> Un paseo rápido y recoger el sobrenadante. Repita este paso dos veces después de la adición de 100 l de P5 amortiguar hasta el talón y aunar todas las fracciones (Figura 3B, carril 2). </li></ol> Comentario: Las perlas restantes pueden ser utilizados para el análisis de la eficacia de escisión (Figura 3B </strong&gt;, carril 3). Por lo general, 70-80% de la proteína se escinde. 6. A TALON metal Affinity Resin La unión a proteínas- <ol><li> Divida la elución desde arriba en 3 fracciones de 1 ml e incubar cada uno con 100 perlas secas de resina de afinidad de metal Talon mu l (prelavadas dos veces con tampón de P5) durante 1 hora bajo rotación. </li></ol> Comentario: La división de la elución en varias fracciones aumenta la eficiencia de unión / lavados. <ol start="2"><li> Lavar la resina 5 min con tampón de P30 (tampón P5 con una concentración final de imidazol 30 mM). </li><li> Repita el paso 6.2 2x y agrupar las cuentas en un solo tubo. Antes de que el último lavado, eliminar la mayor cantidad sobrenadante como sea posible. </li></ol> Comentario: Esto corresponde a la TALON unido de la muestra (Figura 3B, carril 4). 7. La elución de la proteína purificada <ol><li> Se incuba la proteína unida a resina TALON durante 5 min en rotación con P500 tampón (tampón P5 con una concentración final de imidazol 500 mM). Utilice una relación entre la memoria y cuentas de 1:1 v / v (Por ejemplo, si usted ha tomado 200 l de granos secos, usted tendrá que añadir 200 l de P500). Repita este paso dos veces y mantener cada fracción eluida por separado (llamado elución 1 (E1), elución 2 (E2) y la elución 3 (E3); Figura 3B, carriles 5-7). </li></ol> Comentario: Las perlas restantes pueden ser utilizados para el análisis de la eficiencia de elución (Figura 3B, pista 8). Típicamente, un 60-80% de la proteína se eluye en total. <ol start="2"><li> Analizar la cantidad y la calidad de su proteína purificada por la carga de aproximadamente 20-40 l de cada fracción con una concentración patrón de BSA en un SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie (Figura 3B) o SYPRO tinción de proteínas para la visualización. </li></ol> Comentario: La proteína de interés se puede detectar también excelentes referenciasughout el procedimiento de purificación utilizando anti-GST y anticuerpos anti-His (Figura 3C). 8. El almacenamiento de la proteína purificada <ol><li> Se dializa la proteína purificada contra un tampón de almacenamiento apropiado (por ejemplo 20 mM de Tris Acetato pH 8,0, 200 mM de KAc, 10% de glicerol, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) a 4 ° C. Es importante comprobar la precipitación de la proteína purificada durante la diálisis. Por lo general, diálisis a 2x durante 1 hora a 4 ° C bajo rotación agitación. </li><li> Hacer pequeñas alícuotas de la proteína purificada (10-20 l) y la congelación en hielo seco durante 30 min. Almacene las alícuotas a -80 ° C y evitar muchos ciclos de descongelación / congelación. </li></ol>

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El GST-Su protocolo de purificación que aquí se presenta es adecuado para la purificación de una amplia gama de tamaños de proteínas recombinantes: Se purificaron con éxito Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120 kDa), PALB2 (130kDa), y una proteína de alto peso molecular inestable peso de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Por otra parte, las proteínas purificadas con este protocolo eran bioquímicamente activa 6. El éxito de este método depende únicamente de la expres...

La purificación de proteínas recombinantes es crucial para hacer frente a cuestiones fundamentales de la bioquímica. Formas convencionales de purificación de proteínas, como la cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaños se basan en las propiedades físicas de la proteína diana, como su punto isoeléctrico y la carga o el tamaño, respectivamente. Las características de proteínas últimos son compartidos por una variedad de proteínas, lo que aumenta considerablemente la probabilidad de proteínas contaminantes en las estrategias de purificación de proteínas convencionales. Este problema puede ser evitado con el uso de múltiples columnas de purificación, lo que consume tiempo. Al mismo tiempo, los métodos de cromatografía de éstos exigen configuración experimental caro. La purificación por afinidad-etiqueta aumenta fuertemente objetivo-especificidad, como en la mayoría de los casos la etiqueta será único para la proteína de interés. En estudios recientes, la purificación de la bandera-o HA-afinidad se ha usado ampliamente. En contraste con rec existenteprotocolos de purificación de proteínas ombinant en la que se utilizan etiquetas individuales, se estableció la combinación única de dos etiquetas. Nuestro método implica la fusión de una etiqueta de GST en el extremo N-terminal y una etiqueta de His en el extremo C-terminal de la proteína de interés, para una relación óptima entre la cantidad y la pureza de la proteína deseada. El GST es un largo etiqueta (29 kDa), que es altamente eficiente para la purificación sobre glutatión Sepharose bolas. Por otra parte, el uso de GST garantiza la rentabilidad de nuestro método 1. La posibilidad de escindir la GST con la enzima PreScission (con secuencia de reconocimiento de LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, lo que resulta en la adición de sólo dos aminoácidos) tiene muchas ventajas, por ejemplo, esta estrategia evita alteraciones de las funciones de las proteínas fisiológicas debido al impedimento alostérico. La pequeña etiqueta de His fusionada a la otra extremidad de proteína sirve en una segunda etapa de purificación para aumentar la pureza de proteína mediante el lavado de la GST escindido, así como las proteínas degradadas y otra<html> contaminantes. Además, el protocolo no requiere una etapa de diálisis cuando se cambia de la GST para columnas de paso de la Su-purificación (resina TALON). Contaminantes comunes en este tipo de procesos de purificación son proteínas de choque térmico (HSP). La adición de una etapa de incubación con MgCl 2 y ATP permite la eliminación de estos contaminantes (Figura 1). Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) son técnicas comunes que dependen de instrumentación costosa de generar un alto rendimiento de la proteína purificada de interés. El protocolo de purificación de lotes se presenta aquí, en contraste, es manual y no requiere una configuración de instrumento caro. Un alto rendimiento de proteína se puede llegar por la ampliación del protocolo. Al mismo tiempo, con el protocolo de purificación de lotes, el volumen de elución se puede ajustar con el fin de mejorar la concentración de proteína, que no se da con FPLC o HPLC. ntent &quot;&gt; También, con el GST-Su protocolo de purificación por lotes, las proteínas con un tamaño de rango de ~ 10-300 kDa pueden purificarse. Una de las mayores ventajas es dada por el hecho de que uno puede purificar varias proteínas al mismo tiempo , por ejemplo, tanto una de tipo salvaje y su proteína mutante. El éxito del protocolo presentado depende únicamente en el nivel de expresión y la solubilidad de la proteína de interés.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.Coli &lt;/em&gt;DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

Ensayos de clave en enzimología para la caracterización bioquímica de las proteínas in vitro requieren altas concentraciones de la proteína purificada de interés. Protocolos de purificación de proteínas deben combinar eficiencia, simplicidad y rentabilidad 1. Aquí, describimos la GST-Su método como un nuevo sistema de purificación por afinidad a pequeña escala para proteínas recombinantes, sobre la base de un N-terminal de la etiqueta glutatión Sepharose (GST) 2,3 y una etiqueta 10xHis C-terminal 4, que tanto se fusionan a la proteína de interés. La última construcción se utiliza para generar baculovirus, para la infección de las células Sf9 infectadas para la expresión de proteínas 5. GST es una etiqueta bastante largo (29 kDa), que sirve para asegurar la eficacia de la purificación. Sin embargo, podría influir en las propiedades fisiológicas de la proteína. Por lo tanto, en que posteriormente se escinde la proteína usando la enzima PreScission 6. Con el fin de garantizar la máxima pureza y para eliminar el GST escindido, nosañadido una segunda etapa de purificación de afinidad basada en la comparativamente pequeña etiqueta de His. Es importante destacar que, nuestra técnica se basa en dos etiquetas diferentes que flanquean los dos extremos de la proteína, que es una herramienta eficaz para eliminar las proteínas degradadas y, por lo tanto, enriquece proteínas de longitud completa. El método que aquí se presenta no requiere una configuración fundamental caros, tales como FPLC. Además, incorporamos MgCl 2 y lavados ATP para eliminar las impurezas de la proteína de choque de calor y tratamiento con nucleasa de abolir ácidos nucleicos contaminantes. En resumen, la combinación de dos etiquetas diferentes que flanquean el N-y C-terminal y la capacidad de escindir una de las etiquetas, garantiza la recuperación de una proteína altamente purificada y de longitud completa de interés.

Con el fin de ilustrar la eficiencia de la GST-Su protocolo de purificación, purificamos Rec14, un S. pombe proteína de 32,9 kDa. El cDNA fue clonado Rec14 en nuestro vector pFastBac1 modificado que permite la adición de GST-y sus etiquetas en el extremo N-y C-terminales, respectivamente (Figura 1 A). El baculovirus recombinante se prepararon entonces y se utilizan para infectar células SF9 infectadas para la expresión de proteínas. Los lisados ​​celulares solubles se incubaron con pe...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

En el presente protocolo, se demuestra un método de purificación de proteínas a pequeña escala altamente eficiente y rentable, que permite la purificación de proteínas recombinantes, combinando de forma única una etiqueta de GST escindible y una pequeña cola de His.

GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

41.6K vistas.  Hôtel-Dieu de Québec.  En el presente protocolo, se demuestra un método de purificación de proteínas a pequeña escala altamente eficiente y rentable, que permite la purificación de proteínas recombinantes, combinando de forma única una etiqueta de GST escindible y una pequeña cola de His. 

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Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Investigación

Bioquímica

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Estrategias para expresar y purificar transportadores portadores de solutos

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Autor destacado: Expresión y purificación de transportadores portadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Dirigida a tioles de la cisteína para in Vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Inmunología e Infección

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

La purificación de Hsp104, una proteína Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Biología

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificación de proteínas ortogonales Facilitado por un marcador de afinidad biespecíficos pequeños

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

Resumen

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Capítulos en este video

Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

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Dirigida a tioles de la cisteína para in Vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes

La purificación de Hsp104, una proteína Disaggregase

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