Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

אנו מודים אן מארי דיון-Cote לדיונים שהובילו לפיתוחה של השיטה. JK וRB הם חוקרים דוקטורט FQNRT, מ-MG הוא חוקר Vanier CIHR, וג&#39;-YM הוא חוקר בכיר FRSQ. עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר לJY. מ &#39;

1. ייצור רקומביננטי baculovirus Baculoviruses מופקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus Bac-to-Bac של Invitrogen בעיקר על פי הפרוטוקול של היצרן עם שינויים קלים בלבד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וקטור pFastBac1 שונה (Gibco, חיים) נוצר המכיל GST ו תגים (איור 2). אתר MultiCloning (MCS) של וקטור PET-52b (+) (Novagen), המכיל 10xHis תג, היה מוכנס לתוך MCS של וקטור pFastBac1 ליצור pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis. רצף MCS PET-52b (+) היה PCR המוגבר בין אתרי הגבלת XbaI וBlpI, הוספת אתר BglII הגבלה ב5 &#39;בגפיים ובאתר הגבלת HindIII ב3&#39; בגפיים. מוצר ה-PCR שוכפל לאחר מכן בין BamHI ואתר הגבלת HindIII של pFastBac1, באמצעות ההתאמה של רצפי הגבלת BamHI וBglII. מאחר שהמטרה הייתה ליצור pFastBac1 המאפשר הביטוי שלחלבון רקומביננטי עם streptavidin ו10xHis תגים, אתר הגבלת BamHI של PET-52b (+) רצף MCS לא היה בשימוש. כמו כן, אתר הגבלת XbaI לא היה בשימוש, כדי למנוע את היתירות של אתרי הגבלה המתרחשים בין האתרים שכבר בMCS של pFastBac1 ואלה הוכנסו עם MCS של PET-52b (+). רצף קידוד GST עם אתר PreScission פרוטאז ההכרה (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) היה אז מוכנס לתוך pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis. רצף GST cDNA מpGEX-6P-2 (GE Healthcare) היה מוגבר PCR עם פריימרים המכילים אתרי הגבלת NcoI וKpnI ב5 &#39;ו 3&#39; גפיים, בהתאמה. אתר NcoI מאפשר תוספת של קודון התחלה אלא גם אלאנין לGST. מוצר ה-PCR היה אז משובט לתוך pFastBac1 סטרפטוקוקוס-10xHis בין אתרי הגבלת NcoI וKpnI, וכתוצאה מהמחיקה של Streptavidin התג. וקטור ההיתוך החדש ובכך הושג נקרא pFastBac1-GST-10xHis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone קידוד cDNA ליחסי הציבורotein עניין לתוך וקטור pFastBac-GST-10xHis בין GST (N-מסוף) והתג שלו (בטרמינל C-). להיות זהיר כדי להסיר את קודון עצירת cDNA כדי לאפשר האיחוי עם התג שלו בטרמינל C-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את ה coli DH10Bac עם pFastBac רקומביננטי (המתקבל בשלב 1.2) על מנת ליצור את bacmid. לאפשר מושבות לגדול בין לילה על 37 מעלות צלזיוס וכמה שעות ב30 ° C על צלחות סלקציה המכילות Bluo-gal וIPTG (10 מיקרוגרם / מיליליטר tetracyclin, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 7 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 100 מיקרוגרם / מיליליטר Bluo- גל, 40 מיקרוגרם / מיליליטר IPTG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק וrestreak 2 מושבות הלבנות (משלב 1.3) על צלחות בחירה כדי לאשר את הפנוטיפ הלבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 2 מיליליטר של LB המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר tetracyclin, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin עם שתי מושבות הלבנות משלב 1.4 ולתת להם לגדול בין לילה תחת תסיסה (250 סל&quot;ד) ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטהר את ה-DNA bacmid, גלולה החיידקים מצעד 1.5,resuspend התאים 300 μl של פתרון שאני ולהוסיף 300 μl של הפתרון השני (ערכת Maxiprep מQiagen). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, להוסיף 300 μl של 3 M KOAc pH 5.5 ודגירה של 10 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות ב 4 ° C, מהירות מקסימלית עבור 10 דקות. הוספת 800 μl של isopropanol לsupernatants ודגירה של 10 דקות על קרח. צנטריפוגה הדגימות ל15 דקות ב 4 ° C ולשטוף את הכדור עם 500 μl של 70% אתנול. תן את הכדור יבש וresuspend אותו בתנאים סטריליים ב40 μl של טריס-EDTA pH 8.0. ה-DNA bacmid יש לאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור baculoviruses כפי שתואר בפרוטוקול של היצרן. ניתן לאחסן Baculoviruses ב 4 ° C המוגנים מפני אור. </li></ol> 2. ביטוי חלבון רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לבחור את baculovirus יעיל ביותר לטיהור וכדי לפקח על מה שפעם הוא הגיע לשיא של ביטוי חלבון, לבצע assay מיני זיהוםים כדלקמן: להדביק 2 x 10 7 של Sf9 נגועים תאים בתרבית ב27 מעלות צלזיוס בתקשורת של גרייס (השלימה עם 10% FBS ו -1% P / S) עם 133 μl (1/150) של baculovirus. לאסוף aliquots של 1.5 מיליליטר ב 0, 24, 48, ו72 שעות לאחר פגיעה. גלולה התאים ולנתח את רמת הביטוי של החלבון של עניין על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדנים נגד תג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש baculovirus יעיל ביותר משלב 2.1 להדביק טווה מכילה 1.0 x 10 6 תאי Sf9 לכל מיליליטר ב500 מיליליטר של תקשורת עם יחס של 1/150 בין הווירוס ואמצעי תקשורת. בואו התאים הנגועים לגדול בתרחיף ב27 מעלות צלזיוס ולאסוף את התאים כאשר ביטוי החלבון המרבי (כפי שנקבע בשלב 2.1 לעיל) הוא הגיע. ניתן לאחסן את תאי pelleted ב-80 ° C עד שימוש נוסף. </li></ol> 3. הכנת lysate תא מסיס את כל שלבי הדגירה הבאות מתבצעים על 4 מעלות צלזיוס בסיבוב קל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse Sתאי F9 לבטא חלבון עניין שלך ב~ 20 מיליליטר של חיץ מחייב GST (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Triton-X-100, מעכבי פרוטאז 1 מ&quot;מ DTT בPBS1X לריכוז סופי של NaCl של 250 מ&quot;מ, ו קוקטייל (Roche). באמבט מי קרח, dounce הפתרון 20x עם homogenizer dounce, sonicate 3x 30 שניות כל אחד (פלט 70%), וDounce שוב 20x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי). דגירה הכולל lysate התא עם 1 מ&quot;מ MgCl 2 וBenzonase 7 nuclease (2.5 U / ml) ל30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר DNA או RNA זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 18,000 סל&quot;ד במשך 30 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי). צנטריפוגה supernatant שוב ל30 דקות ב 18,000 סל&quot;ד ב 4 ° C כדי לקבל lysate מסיס ברור. להעביר את supernatant דרך פילטר 0.2 או 0.45 מיקרומטר כדי למנוע סתימה. </li></ol> 4. כריכה של חלבון על חרוזים GST <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה lysate התא מסיס עם 1 מיליליטר של חרוזים GST (prewashed שתי פעמים עם10 מיליליטר של GST מחייב חיץ) במשך שעה 1 ב 4 ° C בסיבוב עדין. </li></ol> הערה: זמן הדגירה צריך להיות מותאם בהתאם ליציבות של החלבון והיעילות מחייבת. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב מהיר ב700 סל&quot;ד ולהסיר supernatant המכיל חלבונים מאוגדים (זה יכול להיות כל הזמן לניתוח נוסף). שטוף את החלבונים הנכנס GST (איור 3B, מסלול 1) עם חיץ הכביסה GST (GST חיץ מחייב עם 350 סופי מ&quot;מ NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.2 2x. בשטיפה האחרונה, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את החרוזים עם 5 מ&quot;מ ה-ATP ו15 מ&quot;מ MgCl 2 (ב 10 מיליליטר חיץ מחייב GST) במשך שעה 1 ב 4 ° C כדי למנוע ספציפי מחייב של חלבוני חום הלם 8. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ הכביסה GST. </li></ol> 5. PreScission מחשוף של GST <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוזים GST, להסיר את supernatant ולשטוף את חרוזי GST עם buf P5fer (50 4 pH מ&quot;מ NaHPO 7.0, 500 mM NaCl, גליצרול 10%, 0.05% Triton-X-100, 5 imidazole מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה GST-החרוזים עם אנזים PreScission במאגר P5 מ3 שעות ללילה בשעה 4 ° C. (מחלקים את חרוזים GST בשברים של 100 μl ולהוסיף 4-8 יחידות (2-4 μl) של אנזים המדולל בשל חיץ P5 100 μl). </li></ol> הערה: זמן הדגירה של צעד PreScission צריך להיות מותאם לפי המשקל המולקולרי, כמו גם את היציבות של החלבון. אם השפלה הוא ציין, זמן דגירה זה יכול להיות ירידה למינימום של 2 שעות במקום למשך הלילה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מהיר ולאסוף את supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים לאחר הוספה של P5 100 μl חיץ לחרוזים וברכה כל השברים (איור 3B, מסלול 2). </li></ol> הערה: חרוזים הנותרים יכולים לשמש לניתוח יעילות מחשוף (איור 3B </strong&gt;, מסלול 3). בדרך כלל, 70-80% מהחלבון הוא ביקע. 6. לTALON מתכת זיקה שרף מחייב חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את elution מלמעלה ל3 שברים של 1 מיליליטר ודגירה כל אחד עם 100 חרוזים μl שרף זיקת מתכת טאלון יבשים (prewashed שתי פעמים עם חיץ P5) במשך שעה 1 בסיבוב. </li></ol> הערה: חלוקת elution בכמה שברים מגבירה את יעילות מחייב / שוטף. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את דקות שרף 5 עם חיץ P30 (חיץ P5 עם ריכוז סופי של 30 imidazole מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6.2 2x וברכת חרוזים בצינור יחיד. לפני השטיפה האחרונה, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר. </li></ol> תגובה: זה מתאים למדגם TALON המאוגד (איור 3B, מסלול 4). 7. Elution של החלבון המטוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שרף TALON חלבון קשורה למשך 5 דקות ברוטציה עם P500 חיץ (חיץ P5 עם ריכוז סופי של 500 imidazole מ&quot;מ). השתמש יחס בין החיץ וחרוזים של 1:1 v / נ (לדוגמא, אם אתה לקח 200 μl של חרוזים יבשים, תצטרך להוסיף 200 μl של P500). חזור על פעולה זו פעמיים ולשמור על כל שבריר eluted בנפרד (בשם elution 1 (E1), elution 2 (E2) וelution 3 (E3); איור 3B, נתיבי 5-7). </li></ol> הערה: חרוזים הנותרים יכולים לשמש לניתוח יעילות elution (איור 3B, ליין 8). בדרך כלל, 60-80% מהחלבון eluted בסך הכל. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הכמות ואיכות של החלבון מטוהר על ידי טעינה כ 20-40 μl של כל חלק עם ריכוז BSA סטנדרטי על SDS-PAGE וכתם עם Coomassie כחול (איור 3 ב) או כתם חלבון SYPRO לשם ויזואליזציה. </li></ol> תגובה: החלבון של עניין יכול גם להתגלות throughout הליך הטיהור באמצעות אנטי GST ונוגדנים נגדו (איור 3 ג). 8. אחסון של החלבון המטוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze החלבון מטוהר נגד חיץ אחסון מתאים (למשל 20 מ&quot;מ טריס אצטט pH 8.0, 200 מ&quot;מ כץ, 10% גליצרול, 1 mM EDTA, 0.5 מ&quot;מ DTT) ב 4 ° C. חשוב לבדוק למשקעים של החלבונים המטוהרים במהלך הדיאליזה. בדרך כלל אנחנו dialyze 2x עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס תחת סיבוב תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך aliquots הקטנים של החלבונים המטוהרים (10-20 μl) ולהקפיא בקרח יבש ל30 דקות. אחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס ולמנוע הפשרה / הקפאת מחזורים רבים. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

GST-פרוטוקול הטיהור שהוצג כאן מתאים לטיהור של מגוון רחב של גדלים של חלבונים רקומביננטיים: אנחנו מטוהרים בהצלחה לי RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), וחלבון לא יציב משקל מולקולרי גבוה של infantum שושנת יריחו: Li-BRCA2 (125kDa) 6,9. יתר על כן, החלבונים מטוהרים עם פרוטוקול זה ה?...

הטיהור של חלבונים רקומביננטי היא חיונית כדי לענות על שאלות בסיסיות בביוכימיה. דרכים מקובלות של טיהור חלבונים כמו כרומטוגרפיה חילוף יונים והרחקת גודל כרומטוגרפיה להסתמך על תכונות פיסיקליות של חלבון המטרה, כגון נקודה איזואלקטרית ותשלום או גודל, בהתאמה. מאפייני החלבון האחרונים משותפים למגוון של חלבונים, אשר מגדיל באופן משמעותי את הסיכוי לזיהום חלבונים באסטרטגיות טיהור חלבונים קונבנציונליות. בעיה זו עלולה לעקוף עם השימוש בעמודות טיהור מרובות, אשר זה זמן רב. במקביל, שיטות כרומטוגרפיה האחרונות דורשות התקנה ניסיונית יקרה. טיהור זיקת תג מגביר משמעותית יעד ספציפי, כמו ברוב המקרים התג יהיה ייחודי לחלבון של עניין. במחקרים שנערך לאחרונה, טיהור דגל או HA-זיקה כבר בשימוש נרחב. בניגוד לrec הקייםפרוטוקולי טיהור חלבוני ombinant הבמשמשים תגים בודדים, הקמנו את השילוב הייחודי של שני תגים. השיטה שלנו כרוכה ההיתוך של GST-תג בN-הסופית והתג שלו בC-הסופית של החלבון של עניין, ליחס אופטימלי בין הכמות וטוהר של החלבון הרצוי. GST הוא תג ארוך (29 KDA), שהוא יעיל ביותר לטיהור בחרוזי Sepharose גלוטתיון. יתר על כן, באמצעות GST מבטיח עלות אפקטיביות של שיטת 1 שלנו. האפשרות לבקע את GST עם אנזים PreScission (עם רצף הכרת LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, וכתוצאה מכך התוספת של רק שתי חומצות אמינו) יש יתרונות רבים, למשל, אסטרטגיה זו תמנע שינויים של פונקציות החלבון הפיזיולוגיות בשל הפרעה allosteric. התג שלו הקטן התמזגו הגפיים חלבון האחרים משמש בשלב טיהור שני כדי להגדיל את טוהר חלבון על ידי שטיפה את GST ביקע, כמו גם חלבונים ואחרים מושפלים<html> מזהמים. בנוסף, הפרוטוקול אינו מחייב צעד דיאליזה בעת מעבר מGST לעמודה שלו לטיהור צעד (שרף TALON). מזהמים נפוצים בתהליכי טיהור כאלה הם החלבונים Heat Shock (HSP). התוספת של שלב דגירה עם MgCl 2 ו-ATP מאפשרת הסרת המזהמים אלה (איור 1). חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) וביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) הן טכניקות נפוצות שתלויה במכשור יקר לייצר תשואה גבוהה של החלבון מטוהר של עניין. פרוטוקול הטיהור אצווה אנו מציגים כאן, לעומת זאת, הוא ידני ואינו דורש התקנת אינסטרומנטלי יקרה. ניתן להגיע לתשואה גבוהה של חלבון על ידי דרוג את הפרוטוקול. במקביל, עם פרוטוקול הטיהור אצווה, elution הנפח יכול להיות מותאם על מנת לשפר את ריכוז חלבון, שאינו נתון עם FPLC או HPLC. ntent &quot;&gt; כמו כן, עם GST-פרוטוקול הטיהור אצווה, חלבונים עם גודל טווח של ~ 10-300 kDa יכולים להיות מטוהרים. אחד היתרונות הגדולים ביותר הוא שניתן על ידי העובדה שאחד יכול לטהר כמה חלבונים באותו הזמן , למשל, שניהם wild-type ו המוטציה בחלבון שלה. ההצלחה של הפרוטוקול המובא אך ורק תלוי ברמת הביטוי והמסיסות של החלבון של עניין.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.Coli &lt;/em&gt;DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

מבחני מפתח בהאינזימולוגיה לאפיון ביוכימי של חלבונים במבחנה מחייבים ריכוז גבוה של החלבונים המטוהרים של עניין. פרוטוקולי טיהור חלבון צריכים לשלב יעילות, פשטות ויעילות עלות 1. כאן, אנו מתארים את שיטת GST-כמערכת חדשה בקנה מידה קטן טיהור זיקה לחלבונים רקומביננטיים, המבוססת על תג N-מסוף גלוטתיון Sepharose (GST) 2,3 ותג 10xHis טרמינל C-4, אשר שניהם התמזגו לחלבון של עניין. המבנה השני משמש להפקת baculoviruses, לזיהום של תאים נגועים Sf9 לביטוי חלבון 5. GST הוא תג ארוך למדי (29 KDA) המשמש כדי להבטיח את יעילות טיהור. עם זאת, זה יכול להשפיע על תכונות פיסיולוגיות של החלבון. לפיכך, הוא ביקע לאחר מכן את החלבון באמצעות אנזים PreScission 6. על מנת להבטיח את טוהר מרבי וכדי להסיר את GST ביקע, אנחנוהוסיף צעד טיהור הזיקה שני המבוסס על התג שלו קטן יחסית. חשוב מכך, הטכניקה שלנו מבוססת על שני תגים שונים איגוף שני קצוות של החלבון, אשר הוא כלי יעיל כדי להסיר חלבונים מושפלים, ולכן מעשיר את החלבונים באורך מלא. השיטה שהוצגה כאן אינה דורשת התקנת אינסטרומנטלי יקרה, כגון FPLC. בנוסף, אנו משולבים MgCl 2 ושוטף ATP כדי להסיר זיהומים חלבון הלם חום וטיפול nuclease לבטל לזהם חומצות גרעין. לסיכום, השילוב של שני תגים שונים איגוף N-וה-C-מסוף ואת היכולת לבקע את אחד מהתגים, ערבויות ההתאוששות של חלבון נקי במיוחד ואורך מלא של עניין.

כדי להמחיש את היעילות של GST-פרוטוקול הטיהור, אנחנו מטוהרים Rec14, ס חלבון pombe של 32.9 kDa. Rec14 cDNA שובט בוקטור pFastBac1 שונה שלנו ומאפשר תוספות של GST-ו תגים בN-ו-C-Termini, בהתאמה (איור 1 א). baculovirus רקומביננטי הוכן לאחר מכן ונהג להדביק תאים נגועים SF9 לביטוי חלבון. Lysates התא ...

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

41.6K Views.  Hôtel-Dieu de Québec.  בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן. 

Video: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Biochemistry

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

אסטרטגיות לביטוי וטיהור מובילי מובילי מומסים

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

מחבר זרקור: ביטוי וטיהור של מובילי נשאי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים של קודון 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Immunology and Infection

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific