Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

Biz yönteminin gelişmesine yol açan tartışmalar için Anne-Marie Dion-Cote teşekkür ederim. JK ve RB FQNRT doktora alimler vardır, M.-MG Vanier CIHR âlimi, ve J.-YM bir FRSQ kıdemli araştırmacıdır. Bu çalışma, Fen Bilimleri ve JY Mühendislik Araştırma Konseyi fonları tarafından desteklenmiştir. M.

1.. Rekombinan bakulovirüslerin üretimi Bakulovirüsler esas olarak sadece hafif bir değişiklik ile, üreticinin protokolüne uygun olarak Invitrogen&#39;in Bac-to-Bac Baculovirus Expression System kullanılarak üretilir: <ol><li> Bir modifiye pFastBac1 vektörü (Gibco, yaşam) GST ve O&#39;nun etiketleri (Şekil 2) içeren oluşturuldu. PET-52b (+) vektörü (Novagen) multiklonlama bölgesine (MCS), bir 10xHis-etiketi ihtiva eden, pFastBac1-Strep-10xHis oluşturmak için bir pFastBac1 vektörünün MCS sokulmuştur. PET-52b (+) MCS dizisi 5 &#39;ucunda bir BglII kısıtlama sitesi&#39; ucu ve 3 &#39;bölgesinde bir Hind III sınırlandırma sitesi&#39; ucuna eklenmesi, Xbal ve HBLP kısıtlayıcı siteleri arasında amplifiye PCR oldu. PCR ürünü daha sonra BamHI ve BglII kısıtlama dizilerin uyumluluk kullanılarak BamHI ve Hindlll kısıtlama pFastBac1 sitesi arasında klonlandı. Amaç ifade sağlayan bir pFastBac1 oluşturmak için olduğu içinve streptavidin-10xHis etiketleri ile rekombinant protein, pET-52b (+) BamHI kısıtlama alanı MCS sekansı kullanılmadı. Ayrıca, Xbal kısıtlama alanı zaten pFastBac1 bir MCS ve pET-52b MCS ile eklenen, bu (+) &#39;de siteler arasında meydana gelen kısıtlama sitelerinin fazlalık önlemek için kullanılmamıştır. PreScisson Proteaz tanıma sitesi (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) ile GST kodlayıcı sekans daha sonra pFastBac1-Strep-10xHis içine sokulmuştur. PGEX-6P-2 (GE Healthcare) için GST cDNA sekansı PCR sırasıyla 5 de, Ncol ve Kpnl sınırlandırma bölgelerini içeren bir primer &#39;ve 3&#39; ekstremite ile büyütülmüştür. Ncol mevkisi bir başlangıç ​​kodonu ve buna ek olarak değil, aynı zamanda bir GST Alanin sağlar. PCR ürünü daha sonra streptavidin-etiketinin silinmesi ile sonuçlanan, Ncol ve Kpnl kısıtlama siteleri arasında pFastBac1-Strep-10xHis klonlanmıştır. Bu şekilde elde edilen yeni bir füzyon vektörü pFastBac1-GST-10xHis seçildi. </li><li> Pr için cDNA kodlama CloneGST (N-terminal) ve His-etiketi (C-ucu) arasındaki pFastBac-GST-10xHis vektörü içine ilgi otein. C-terminal His-tag ile füzyon izin vermek için cDNA durdurma kodonunu ortadan kaldırmak için dikkat edin. </li><li> E. Transform (Adım 1.2 &#39;de elde edilmiştir) rekombinant pFastBac ile coli DH10Bac bacmid üretir. Koloniler Bluo-gal ve IPTG (10 ug / ml tetrasiklin, 50 ug / ml kanamisin, 7 ug / ml gentamisin, 100 ug / ml Bluo-ihtiva-eden seçme plakaları üzerinde 30 ° C &#39;de 37 ° C ve birkaç saat gece boyunca büyümeye izin verin Gal, 40 ug / ml IPTG). </li><li> Seçim ve beyaz fenotip onaylamak için seçme plakaları üzerinde (adım 1.3) 2 beyaz koloniler restreak. </li><li> 10 ug / ml tetrasiklin, 50 ug / ml kanamisin, 10 ug / ml gentamisin aşama 1.4 &#39;dan iki beyaz koloniler ile ve bunların 37 ° C de bir gece boyunca çalkalama altında (250 rpm) büyümesine izin ihtiva eden LB içinde 2 ml inoküle </li><li> Bacmid DNA&#39;yı saflaştırmak amacıyla, aşama 1.5 bakterileri peletçözeltisi 300 ul I hücreleri tekrar süspansiyon ve çözelti II 300 ul (Qiagen&#39;den Maksiprep kit) ekleyin. , Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe 3 M KOAc, pH 5.5 içinde 300 ul ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. 4 ° C, 10 dakika boyunca yüksek hızda örnekleri santrifüj. Yüzer için izopropanol 800 ul eklenir ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj örnekleri ve% 70 etanol içinde 500 ul ile pelet yıkayın. Pelet kuruması ve Tris-EDTA pH 8.0, 40 ul steril koşullar altında yeniden süspanse edin. Bacmid DNA, 4 ° C &#39;de muhafaza edilmelidir </li><li> Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi baculovirüsler oluşturmak. Bakulovirüsler ışıksız bir ortamda 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 2. Rekombinant Protein Expression <ol><li> Arıtma için en verimli bakülovirüsü seçmek ve protein ifade zirve ulaşıldığında ne zaman izlemek için bir mini-enfeksiyon deneyi a gerçekleştirmeks aşağıdaki gibidir: 2 Sf9 x 10 7 bakulovirüsün 133 ul (1/150) ile (% 10 FBS ve% 1 P / S ile tamamlanır) Grace ortam içinde 27 ° C &#39;de kültür hücreleri enfekte Infect. 0, 24, 48, 1.5 ml&#39;lik alikotları toplamak ve 72 saat post-enfeksiyon. Pelet hücreleri ve anti-tag antikoru kullanılarak western blotting ile, ilgi konusu proteinin ekspresyonu düzeyini analiz. </li><li> Virüs ve ortam arasında 1/150 oranı ile bir ortamın 500 ml, ml başına 1.0 x 10 6 Sf9 hücrelerini içeren bir değer değiştirici enfekte etmek için aşama 2.1 &#39;den en verimli bakulovirüs kullanın. Enfekte olan hücreler, 27 ° C &#39;de süspansiyon içinde büyümeye ve en yüksek protein ekspresyon (yukarıdaki aşama 2.1&#39; de tespit edildiği üzere) ulaşıldığında hücreleri hasat olsun. Tanelenmiş hücreler daha fazla kullanıma kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Çözünür hücre lisatı hazırlanması Aşağıdaki kuluçka adımlarının tüm hafif dönme altında 4 ° C&#39;de gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Lyse SGST bağlayıcı tampon (150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 0.05 Triton-X-100, 1 mM 250 mM NaCI nihai konsantrasyon için PBS1X de DTT ve proteaz inhibitör ~ 20 ml ilgi proteini eksprese eden hücreler f9 kokteyli (Roche). bir buzlu su banyosu içinde, bir Dounce homojenleştirici, sonikasyon 3x 30 saniye her biri (% 70 üretim) ile çözeltinin Dounce 20x ve 20x yeniden Dounce. </li><li> (İsteğe bağlı). DNA ya da RNA kontaminasyonu çıkarmak için 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1 mM MgCI2 ve 7 nükleaz (2.5 U / ml) benzonaz toplam hücre lizatı inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 18,000 rpm&#39;de santrifüje Süpernatant tutun. </li><li> (İsteğe bağlı). Santrifüj süpernatan tekrar 4 ° C&#39;de 18,000 rpm&#39;de 30 dakika boyunca berrak lizat çözünür alır. Tıkanmasını önlemek için, 0.2 ya da 0.45 um&#39;lik bir filtreden süpernatantı geçirir. </li></ol> 4. GST Boncuk Protein bağlanması <ol><li> GST boncuk 1 ml Çözünür hücre lisatı inkübe (iki kez yıkanmışGST 10 mi yumuşak döndürülerek 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca tamponu) bağlayıcı. </li></ol> Yorum: Kuluçka süresi, proteinin stabilite ve bağlanma verimliliği göre optimize edilmesi gerekmektedir. <ol start="2"><li> Hızlı 700 rpm&#39;de spin ve ilişkisiz proteinleri içeren süpernatant kaldırmak (bu daha fazla analiz için muhafaza edilebilir). GST Yıkama tamponu ile GST-bağlı protein (Şekil 3B, şerit 1) yıkayın (GST 350 mM NaCl finali ile bağlama tamponu). </li><li> Adımı tekrarlayın 4.2 2x. Son yıkamadan olarak, mümkün olduğu kadar supernatant çıkarın. </li><li> Isı-şok proteinleri 8 arasında spesifik olmayan bağlanmanın olmaması için 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca (10 mi GST bağlama tamponu içinde) 5 mM ATP ve 15 mM MgCl2 ile boncuk inkübe edin. GST yıkama tamponu ile boncuk üç kez yıkayın. </li></ol> 5. GST PreScisson Dilinim <ol><li> GST boncuk santrifüj, süpernatant kaldırmak ve P5 buf ile GST boncuk yıkayınfer (50 mM NaHPO 4 pH 7.0, 500 mM NaCl,% 10 gliserol,% 0.05 Triton-X-100, 5 mM imidazol). </li><li> 3 saat için gece boyunca 4 ° C den P5 tamponu PreScisson enzimi ile GST-boncuk inkübe (100 ul fraksiyon olarak GST boncuk bölün ve P5 tampon 100 ul seyreltilmiş enzim, 4-8 adet (2-4 ul) ekleyin.) </li></ol> Yorum: PreScisson aşamasının Kuluçka süresi molekül ağırlığı hem de protein kararlılığına göre optimize edilmesi gerekmektedir. Bozunma görülmektedir, bu, bir gece boyunca inkübasyon süresi, 2 saat içinde en az yerine göre azaltılabilir. <ol start="3"><li> Hızlı spin ve süpernatant toplamak. P5 100 ul ekleyerek sonra bu adımı iki kez tekrarlayın boncuklara tampon ve tüm kısımlar (Şekil 3B, şerit 2) havuz. </li></ol> Yorum: Kalan boncuklar bölünme etkinliğinin analizi için kullanılabilir (Şekil 3B </strong&gt;, şerit 3). Genellikle, proteinin% 70-80 bölünmektedir. 6. Protein bağlayıcı TALON Metal Afinite Reçine&#39;ye <ol><li> 1 ml&#39;lik fraksiyonlar halinde 3 yukarıdan elüsyon bölün ve döndürme altında 1 saat boyunca (P5 tamponu ile iki kez yıkanmış) 100 ul Talon metal afinite reçinesi ile kuru boncuk her inkübe edin. </li></ol> Yorum: Bir çok paylarda elüsyon bölme bağlayıcı / yıkama verimliliği artırır. <ol start="2"><li> P30 tamponu (30 mM imidazol, son konsantrasyon ile P5 tamponu) ile reçine 5 dakika yıkanır. </li><li> Adımı 6.2 2x tekrarlayın ve tek bir tüp içinde boncuk havuzu. Son yıkamadan önce, mümkün olduğu kadar supernatant çıkarın. </li></ol> Yorum: Bu TALON bağlı numune (Şekil 3B, şerit 4) karşılık gelmektedir. 7. Saflaştırılmış Protein elüsyonu <ol><li> P5 ile birlikte dönüş altında 5 dakika için protein bağlı TALON reçine inkübe00 tampon maddesi (500 mM imidazol, son konsantrasyon ile P5 tamponu). Tampon ve 01:01 h / h arasında boncuklar arasında bir oranı kullanarak (Eğer kuru boncuk 200 ul almıştı Örneğin, siz P500 200 ul eklemek gerekir). Bu adımı iki kez tekrarlayın ve ayrı ayrı her akıtılan kısmını tutmak (; Şekil 3B, 5-7 kuşak), yıkama 1 (E1) adında yıkama 2 (E2 ve elüsyon 3 (E3)). </li></ol> Yorum: Kalan boncuk elüsyon verimi (Şekil 3B, şerit 8) analizi için kullanılabilir. Tipik haliyle, proteinin% 60-80 toplam akıtılır. <ol start="2"><li> Coomassie mavisi (Şekil 3B) veya görüntüleme için SYPRO protein boyası ile bir SDS-PAGE ve leke üzerinde standart BSA konsantrasyonu her fraksiyonun yaklaşık 20-40 ul yükleme göre saflaştırılmış protein miktarını ve kalitesini analiz edin. </li></ol> Yorum: İlgilenilen proteini aynı zamanda bir uçtan bir uca tespit edilebiliranti-GST ve anti-His antikorları (Şekil 3C) kullanılarak saflaştırma prosedürü hayatları boyunca. 8. Saflaştırılmış proteinin depolanması <ol><li> 4 ° C sıcaklıkta, uygun bir saklama tamponu ile saflaştırılmış proteinin (örneğin 20 mM Tris asetat pH 8.0, 200 mM KAc,% 10 gliserol, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT) Dialyze Bu, diyaliz sırasında, saflaştırılmış proteinin çökeltilmesi için kontrol etmek önemlidir. Genellikle çalkalama döndürme altında 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca 2x dialyze. </li><li> Saflaştırılmış protein (10-20 ul) az miktar yapın ve 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde dondurma. -80 ° C&#39;de alikotları saklamak ve birçok çözülme / donma döngüleri kaçının. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

Burada sunulan GST-His rekombinant proteinlerin saflaştırma protokolü boyutları geniş bir aralığının saflaştırılması için uygundur: başarıyla Li Rad51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) ve dengesiz yüksek molekül ağırlıklı protein saflaştırılmış Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Ayrıca, bu protokol ile saflaştırılmış proteinler 6 biyokimyasal aktif edildi. Bu yöntemin başarısı, sadece arzu edilen protein ekspresyon, çözünür...

Rekombinant proteinlerin saflaştırılması biyokimya temel soruları için önemlidir. Iyon değişim kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi gibi protein saflaştırma geleneksel yollar olduğu, örneğin izoelektrik noktası ve ücret ya da boyutu gibi hedef proteinin fiziksel özelliklerine dayanır. Bu ikinci protein özellikleri önemli ölçüde geleneksel protein saflaştırma stratejilerinde kirletici proteinleri şansını arttırır proteinlerin çeşitli tarafından paylaşılır. Bu sorun, zaman alıcı, birden çok arıtma sütun kullanımı ile engellenebilecektir. Aynı zamanda, ikinci kromatografi yöntemler pahalı deney düzeneği gerektirir. Olguların çoğunda etiket ilgi protein benzersiz olacak gibi afinite etiketi arıtma güçlü, hedef-özgüllük artar. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, Flag-ya da HA-afinite saflaştırma yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut rec aksineTek etiketleri kullanıldığı ombinant protein saflaştırma protokolleri, iki etiketlerin benzersiz bir bileşimini kurulmuştur. Önerilen yöntem, miktar ve istenen proteinin saflığı arasında optimum bir oranı için, ilgi konusu proteinin C-terminalinde N-terminalinde bir His-tag, bir GST-füzyon etiketinin içerir. GST glutatiyon Sefaroz taneleri üzerinde saflaştırma için yüksek verimli bir uzun etiketi (29 kDa) &#39;dir. Ayrıca, KDV kullanarak bizim yöntem 1 maliyet etkinliğini garanti. (Sadece iki amino asit ilavesi ile sonuçlanan tanıma sekansı LeuGluValLeuPheGln / GlyPro ile) PreScisson enzimi ile GST kapalı yarmak için bir olasılık, bir çok avantajı vardır, örneğin, bu strateji allosterik bir engel nedeniyle fizyolojik protein fonksiyonlarının değişiklikler önler. Diğer protein ucuna kaynaşmış His-tag, küçük bölünmüş GST yıkandıktan, hem de bozulmuş proteinlerin ve diğer protein saflığını daha da arttırmak için ikinci bir arıtma adımında karşılık vermektedir<html> kirleticiler. His-saflaştırma adımı kolonu (TALON reçinesi) için GST geçiş Ek olarak, iletişim kuralı, bir diyaliz adımı gerektirmez. Bu tür saflaştırma işlemlerinde yaygın kirletici maddeler ısı şok proteinlerinin (HSP) &#39;dir. MgCI2 ve ATP ile bir kuluçkalama adımının eklenmesi bu kirleticilerin çıkarılması (Şekil 1) sağlar. Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek verim elde etmek için pahalı enstrümantasyon bağlıdır sıradan yöntemlerdir. Burada mevcut toplu arıtma protokolü, aksine, manuel ve pahalı bir enstrümantal kurulum gerektirmez. Protein yüksek verim protokolünü ölçeklendirme ulaşılabilir. Aynı zamanda, toplu arıtma protokolü ile, elüsyon hacmi FPLC ve HPLC ile verilmezse protein konsantrasyonu arttırmak için ayarlanabilir. ntent &quot;&gt; Aynı zamanda, toplu GST-His arıtma protokolü ile, ~ 10-300 kDa bir boyut aralığı ile proteinler saflaştırılabilir. en büyük avantajlarından biri, aynı anda birkaç proteinleri saflaştırmak gerçeği ile verilir Örneğin, bir vahşi tip ve mutant protein hem de. sunulan protokol başarı sadece, ilgi konusu proteinin ekspresyon seviyesi ve çözünürlüğüne bağlıdır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.Coli &lt;/em&gt;DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

In vitro protein biyokimyasal karakterizasyonu için in Enzymology anahtar tahliller, ilgi konusu saflaştırılmış proteinin yüksek konsantrasyonlarını gerektirmektedir. Protein saflaştırma protokolleri etkinlik, basitlik ve maliyet etkinliğini 1. birleştirmek gerekir. Burada, bir N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST) ve her ikisi de 2,3-kaynaşmış, bir C-terminal 10xHis etiketi 4 dayanan rekombinant protein için yeni bir küçük ölçekli bir afinite arıtma sistemi gibi GST-His yöntemi tarif ilgilenilen proteine. İkinci yapı, protein ekspresyonu için Sf9 5 enfekte olmuş hücrelerin enfeksiyonu için, baculovirüsler oluşturmak için kullanılır. KDV arıtma verimliliği sağlamak için hizmet veren, oldukça uzun bir etiket (29 kDa) &#39;dir. Bununla birlikte, proteinin fizyolojik özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, bu daha sonra 6 PreScisson enzim kullanılarak protein kesilir. , En fazla saflık sağlamak ve bölünmüş GST çıkarmak için, biznispeten küçük bir His-Tag göre ikinci bir afinite saflaştırma adımı ilave edildi. Önemli olarak, bizim teknik bu nedenle, bozulmuş proteinlerin çıkması ve etkili bir araçtır, proteinin, iki ucunu yan iki farklı etiketler dayanan, tam uzunluklu proteinlerin zenginleştirir. Burada sunulan yöntem, FPLC gibi pahalı bir enstrümantal kurulum, gerektirmez. Ayrıca, ısı şoku proteini kirleri ve nükleik asitler kontamine kaldırmaya nukleaz tedavisi kaldırmak için MgCl2 ve ATP yıkar dahil. Özet olarak, yandan kuşatan iki farklı etiketler kombinasyonu N-ve C-terminal ve etiketler biri kapalı parçalama yeteneği, ilgi konusu bir yüksek derecede arıtılmış ve tam-boy proteinin kurtarma garanti eder.

GST-His saflaştırma protokolü etkinliğini göstermek amacıyla, Rec14, bir S. arıtıldı 32.9 kDa protein pombe. Rec14 cDNA, sırasıyla N-ve C-termini, (Şekil 1A) GST-ve His-etiketi ekleme olanak veren bir modifiye pFastBac1 vektörü içinde klonlandı. Rekombinant bakulovirüs hazırlanabilir ve protein ifadesi için SF9 enfekte hücreleri enfekte etmek için kullanıldı. Çözünür hücre lizatları GST taneleri ile kuluçkalandı ve bağlanmış proteinleri PreScisson prot...

Watch this Scientific Journal Video about GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins at JoVE.com

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir.

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

41.6K Görüntüleme.  Hôtel-Dieu de Québec.  Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir. 

Video: GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Biyokimya

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular processes. The conserved MEEVD pentapeptide at the C-terminus of Hsp90 is responsible for the interaction with the tetratricopeptide repeat (TPR) motif of co-chaperones. FK506-binding protein (FKBP) 51 and FKBP52 are two similar TPR-motif co-chaperones involved in steroid hormone-dependent diseases with different functions. Therefore, identifying molecules specifically blocking interactions between Hsp90 and FKBP51 or FKBP52 provides a promising therapeutic potential for several human diseases. Here, we describe the protocol for an amplified luminescent proximity homogenous assay to probe interactions between Hsp90 and its partner co-chaperones FKBP51 and FKBP52. First, we have purified the TPR motif-containing proteins FKBP51 and FKBP52 in glutathione S-transferase (GST)-tagged form. Using the glutathione-linked donor beads with GST-fused TPR-motif proteins and the acceptor beads coupled with a 10-mer C-terminal peptide of Hsp90, we have probed protein-protein interactions in a homogeneous environment. We have used this assay to screen small molecules to disrupt Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions and identified potent and selective Hsp90-FKBP51 interaction inhibitors.

This protocol presents a technique for probing protein-protein interactions using glutathione-linked donor beads with GST-fused TPR-motif co-chaperones and acceptor beads coupled with an Hsp90-derived peptide. We have used this technique to screen small molecules to disrupt Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions and identified potent and selective Hsp90-FKBP51 interaction inhibitors.

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

<meta charset="utf8"></head><body>His etiketli FEN1 proteininin verimli bir şekilde saflaştırılması için FPLC'nin optimize edilmesi

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: His Etiketli FEN1 Proteini için Afinite Kromatografisini Optimize Etme

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Biyoloji

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for isolation of protein complexes under physiological conditions. Fusion proteins containing two copies of Strep-tag II, designated twin-Strep-tag or SIII-tag, have the advantage of higher affinity for Strep-Tactin compared to those containing only a single Strep-tag, thus allowing more efficient protein purification. However, this advantage is offset by the fact that elution of twin-Strep-tagged proteins with biotin may be incomplete, leading to low protein recovery. The recovery can be dramatically improved by using denaturing elution with sodium dodecyl sulfate (SDS), but this leads to sample contamination with Strep-Tactin released from the resin, making the assay incompatible with downstream proteomic analysis. To overcome this limitation, we have developed a method whereby resin-coupled tetramer of Strep-Tactin is first stabilized by covalent cross-linking with Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) and the resulting cross-linked resin is then used to purify target protein complexes in a single batch purification step. Efficient elution with SDS ensures good protein recovery, while the absence of contaminating Strep-Tactin allows downstream protein analysis by mass spectrometry. As a proof of concept, we describe here a protocol for purification of SIII-tagged viral protein VPg-Pro from nuclei of virus-infected N. benthamiana plants using the Strep-Tactin polymethacrylate resin cross-linked with BS3. The same protocol can be used to purify any twin-Strep-tagged protein of interest and characterize its physiological binding partners.

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

A method is described for efficient purification of twin-Strep-tagged fusion proteins and their specific complexes on modified streptavidin (Strep-Tactin) resin covalently cross-linked with Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). The method has the advantages of fast speed, good target protein recovery and high purity, and is compatible with subsequent analysis by mass spectrometry.

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması