Name: gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
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我々は法の開発につながる議論アンヌ=マリー·ディオン·コートに感謝します。 JKとRBはFQNRT博士学者、M.-MGはバニエCIHR学者であり、J.-YMはFRSQ上級研究員である。この作品は、自然科学と工学研究評議会からJYへの資金によってサポートされていました。 M.

1。組換えバキュロウイルスの作製バキュロウイルスは、主に、わずかな修正を加えた製造業者のプロトコルに従って、Invitrogen社のBac-to-Bacバキュロウイルス発現系を用いて生成されます。 <ol><li>修正するpFastBac1ベクター（Gibco社、生命）は、GSTおよびHis-タグ（ 図2）を含む作成されました。をpET-52bの（+）ベクター（Novagen）のマルチクローニングサイト（MCS）は、10xHisタグを含有するpFastBac1-ストレプト-10xHisを生成するようにするpFastBac1ベクターのMCSに挿入した。をpET-52bの（+）MCS配列が5 &#39;端および3にHindIII制限部位&#39;端におけるBglII制限部位を付加する、XbaIおよびBlpIを制限部位の間に増幅されたPCRであった。 PCR産物は、次いで、BamHIおよびBglII制限配列の相溶性を使用して、pFastBac1のBamHIおよびHindIIIの制限部位間にクローニングした。目的は、の発現を可能にするpFastBac1を生成することであったのでストレプトアビジンと10xHisタグを用いる組換えタンパク質、ペット-52B（+）のBamHI制限部位がMCSの配列が使用されませんでした。また、XbaI制限部位が既にするpFastBac1のMCSとをpET-52bのMCSに挿入し、これらの（+）内のサイト間で生じる制限部位の重複を避けるために使用されなかった。プレシジョンプロテアーゼ認識部位（LeuGluValLeuPheGln / GlyPro）とのGSTコード配列を、次いで、pFastBac1の - ストレプトマイシン-10xHisに挿入した。をpGEX-6P-2（GEヘルスケア）からGST cDNA配列は、PCR、それぞれ5にNcoIおよびKpnI制限部位を含むプライマー &#39;および3&#39;の末端を増幅した。 NcoI部位は、開始コドンの追加だけでなく、GSTにアラニンを可能にします。 PCR産物を、次いで、ストレプトアビジン-タグの欠失をもたらす、NcoIおよびKpnI制限部位の間にpFastBac1の - ストレプトマイシン-10xHisにクローニングした。このようにして得られた新たな融合ベクターは、pFastBac1の-GST-10xHis命名された。 </li><li> PRをコードするcDNAクローンを作成GST（N末端）およびHisタグ（C末端）の間をpFastBac-GST-10xHisベクターへの関心のotein。 C末端Hisタグとの融合を可能にするためのcDNAの終止コドンを除去するように注意してください。 </li><li> Eを変換（ステップ1.2）で得られた組換えたpFastBacとの大腸菌 DH10Bacコンピバクミドを生成する。コロニーがBluo-galおよびIPTG（10μg/ mlのテトラサイクリン、50μg/ mlのカナマイシン、7μg/ mlのゲンタマイシン、100μg/ mlのBluoを含有選択プレート上で30℃、37℃、数時間で一晩成長させるギャル、40μg/ mlのIPTG）。 </li><li>白の表現型を確認するために、選択プレート上で（ステップ1.3から）2個の白色コロニーを選択し、restreak。 </li><li>ステップ1.4から2白いコロニーをLBの2ミリリットル10μg/ mlのテトラサイクリンを含む、50μg/ mlのカナマイシン、10μg/ mlのゲンタマイシンを接種し、それらを37℃で撹拌（250回転）の下で一晩増殖させ</li><li>バクミドDNAを精製するために、ステップ1.5からの細菌をペレット溶液を300μlの私は細胞を再懸濁し、溶液IIを300μl（キアゲンからマキシプレップキット）を追加します。 、室温で5分間インキュベートし、3MのKOAcのpH 5.5を300μlを加え、氷上で10分間インキュベートする。 4°C、10分間最大速度でサンプルを遠心分離する。上清にイソプロパノールを800μl加え、氷上で10分間インキュベートする。 4℃で15分間サンプルを遠心分離し、70％エタノール500μlでペレットを洗浄する。ペレットを乾燥させトリス-EDTA pH8.0の40μlの滅菌条件下でそれを懸濁します。バクミドDNAは、4℃で保存する必要があります</li><li>製造業者のプロトコルに記載のようにバキュロウイルスを生成する。バキュロウイルスは、光から保護して4℃で保存することができる。 </li></ol> 2。組換えタンパク質発現<ol><li>精製のための最も効率的なバキュロウイルスを選択すると、タンパク質発現のピークに到達する何時監視するために、ミニ感染アッセイaを実行するSは、以下のとおりのSf9の2×10 7に感染バキュロウイルスの133μL（1/150）と（10％FBSおよび1％P / Sで補完）グレースメディアに27℃で培養した細胞を感染させた。 0、24、48で1.5ミリリットルのアリコートを収集し、72時間後に感染。細胞をペレット化し、抗タグ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより目的のタンパク質の発現レベルを分析する。 </li><li>ウイルスとメディアの間で1/150の割合で、メディアの500ミリリットル1ml当たり1.0×10 6 Sf9細胞を含むスピナーを感染させるためにステップ2.1から最も効率的なバキュロウイルスを使用してください。感染細胞は27℃で、懸濁液中で増殖し、最大のタンパク質発現（上記ステップ2.1で決定される）に達したときに細胞を回収しましょう​​。ペレット化した細胞は、さらに使用するまで-80℃で保存することができる。 </li></ol> 3。可溶性細胞溶解物の調製以下のインキュベーションステップは全て、軽度の回転下で4℃で行われる。 <ol><li>溶解SGST結合バッファー（150mMのNaCl、1mMのEDTA、0.05％トリトン-X-100、1mMの250mMのNaClの終濃度についてのPBS1XでDTT、およびプロテアーゼ阻害剤の約20 mlの目的タンパク質を発現するF9細胞カクテル（Roche）を氷水浴中で、ダウンスホモジナイザーでソリューション20Xをダウンス、超音波処理3X 30秒ごと（70％出力）し、再び20Xをダウンス。 </li><li> （省略可能）。 1mMのMgCl 2を有する全細胞溶解物をインキュベートし、DNAまたはRNAの混入を除去するために4℃で30分間7ヌクレアーゼ（2.5 U / ml）をベンゾナーゼ。 </li><li> 4℃で30分間18,000 rpmで遠心分離上清を保管してください。 </li><li> （省略可能）。遠心分離機明確な可溶性溶解を得るために4℃、18,000 rpmで30分間、再び上清。目詰まりを回避するために、0.2または0.45μmのフィルターで上澄みを渡します。 </li></ol> 4。 GSTビーズ上のタンパク質の結合<ol><li> GSTビーズを1mlの可溶性細胞溶解物をインキュベートする（で2回予備洗浄GST 10mlを穏やかに回転させながら4℃で1時間、緩衝液）に結合する。 </li></ol> コメント：インキュベーション時間は、タンパク質の安定性及び結合効率に応じて最適化する必要がある。 <ol start="2"><li>クイック700 rpmでスピンし、非結合タンパク質を含む上清を除去し（これは、さらなる分析のために保持することができる）。 GST洗浄緩衝液（350mMのNaClを有する最終的なGST結合緩衝液）を用いてGST-結合タンパク質（ 図3B、レーン1）洗浄する。 </li><li>手順を繰り返し4.2倍。最後の洗浄では、できるだけ多くの上清を除去します。 </li><li>熱ショックタンパク質8の非特異的結合を回避するために、4℃で1時間（10ミリリットルGST結合緩衝液中）、5mMのATPおよび15mMのMgCl 2を有するビーズをインキュベートする。 GST洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。 </li></ol> 5。 GSTのプレシジョン切断<ol><li> GSTビーズを遠心し、上清を除去し、P5のBUFとのGSTビーズを洗浄FER（50mMのpH7.0でのNaHPO 4、500mMのNaCl、10％グリセロール、0.05％トリトン-X-100、5mMイミダゾール）。 </li><li> 4℃で一晩に3時間からP5バッファにプレシジョン酵素で、GST-ビーズをインキュベート（100μLの分画に、GSTビーズを分割し、P5の緩衝液100μlに希釈した酵素の4-8単位（2-4μl）を追加します）。 </li></ol> コメント：プレシジョン工程のインキュベーション時間は、分子量ならびにタンパク質の安定性に応じて最適化する必要がある。分解が観察される場合には、このインキュベーション時間は一晩、2時間の最小値の代わりにまで減少させることができる。 <ol start="3"><li>クイックスピンし、上清を集める。 P5の100μlのを追加した後、この手順を2回繰り返す ビーズにバッファリングし、全ての画分（ 図3B、レーン2）プール。 </li></ol> コメント：残りのビーズは切断効率の分析のために使用することができる（ 図3B </strongの&gt;、レーン3）。通常、タンパク質の70〜80％が切断される。 6。タンパク質結合TALON金属アフィニティー樹脂に<ol><li> 1ミリリットルの3画分に、上からの溶出を分割し、回転下で1時間、100μlのタロン金属アフィニティー樹脂乾燥ビーズ（P5緩衝液で2回予洗）と、それぞれインキュベートする。 </li></ol> コメント：いくつかの画分に溶出を割ると、結合/洗浄の効率を向上させます。 <ol start="2"><li> P30バッファー（30 mMイミダゾールの最終濃度でP5バッファー）で樹脂5分を洗ってください。 </li><li>ステップ6.2倍を繰り返して、単一のチューブ内でビーズをプールする。最後の洗浄の前に、できるだけ多くの上清を除去します。 </li></ol> コメント：これはTALONバインドのサンプル（ 図3B、レーン4）に対応している。 7。精製タンパク質の溶出<ol><li> P5で回転下で5分間蛋白結合するTALON樹脂をインキュベート00緩衝液（500 mMイミダゾールの最終濃度を有するバッファーP5）。バッファ1:1 V / Vのビーズとの比率を使用してください（あなたは乾燥ビーズを200μlを取っていた場合、あなたはP500を200μlを追加する必要があります）。 2回にこの手順を繰り返し、別々にそれぞれの溶出画分を保つ（; 図3B、レーン5-7という名前の溶出1（E1）、溶出2（E2）および溶出3（E3））。 </li></ol> コメント：残りのビーズを溶出効率（ 図3B、レーン8）の分析のために使用することができる。典型的に、タンパク質の60〜80％が合計で溶出する。 <ol start="2"><li>クマシーブルー（ 図3B）、または可視化のためのSYPROタンパク質染色でSDS-PAGEおよび染色の標準BSA濃度で各分画の約20〜40μLをロードすることによって、あなたの精製タンパク質の量と質を分析します。 </li></ol> コメント：目的のタンパク質もthroを検出することが可能抗GSTおよび抗His抗体（ 図3C）を使用して精製操作ughout。 8。精製タンパク質の貯蔵<ol><li> 4℃で、適切な保存緩衝液に対して精製タンパク質（ 例えば、20mMトリス酢酸塩pH8.0で、200mMののKAc、10％グリセロール、1mMのEDTA、0.5mMのDTT）で透析これは、透析中に精製されたタンパク質の沈殿のために確認することが重要です。私たちは通常、攪拌回転下で4℃で1時間、2X透析。 </li><li>精製したタンパク質（10-20μL）の小分けを作り、30分間ドライアイス上で凍結する。 -80℃で一定分量を保存し、多くの融解/凍結サイクルを避ける。 </li></ol>

<ol>
	<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li><li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL.">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li><li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis,+using+three+different+expression+systems.">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li><li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports.">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li><li>Kuhn, S., Zipfel, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculovirus+expression+vector+pBSV-8His+directs+secretion+of+histidine-tagged+proteins.">The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins.</a> Gene. 162, 225-229 (1995).</li><li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination.">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li><li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2++in+the+hydrolysis+mechanism.">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li><li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA.">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li><li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum.">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li><li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+vector+system:+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression.">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li></ol>

ここで紹介する、GST-Hisの精製プロトコルは、組換えタンパク質の大きさの広い範囲の精製に適している：我々は成功して李 RAD51（41kDa）、piBRCA2（120kDa）、PALB2（130kDa）、および不安定な高分子量のタンパク質の精製リーシュマニア幼児 ： 李 BRCA2（125kDa）6,9。また、このプロトコルを使用して精製したタンパク質は、6生化学的に活性であった。この方法の...

組換えタンパク質の精製は、生化学の基本的な質問に対処することが重要である。イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ​​排除クロマトグラフィーのようなタンパク質精製の従来の方法は、それぞれ、例えば、その等電点、電荷またはサイズなどの標的タンパク質の物理的性質に依存する。後者のタンパク質特性が大幅に従来のタンパク質精製方法でタンパク質を汚染する可能性を増大させる種々のタンパク質が共有されています。この問題は、時間がかかり、複数の精製カラムの使用により回避することができる。同時に、後者のクロマトグラフィー法は、高価な実験装置を要求する。ほとんどの場合、タグは、目的のタンパク質に固有であるように、アフィニティータグ精製が強く、標的特異性を増加させる。最近の研究では、違反またはHA-アフィニティー精製が広く用いられている。 既存rec視聴とは対照的に単一のタグが使用されるombinantタンパク質精製プロトコルは、2つのタグのユニークな組み合わせを確立した。我々の方法は、所望のタンパク質の量と純度との間の最適な比率のために、目的のタンパク質のC末端にN-末端およびHisタグにおけるGST-タグの融合を含む。 GSTはグルタチオンセファロースビーズでの精製のための非常に効率的で、長いタグ（29 kDa）の、ある。さらに、GSTを使用すると、本手法1の費用対効果を保証します。 （わずか2つのアミノ酸の付加、その結果、認識配列LeuGluValLeuPheGln / GlyProで）プレシジョン酵素GSTを切断する可能性は多くの利点を有し、例えば、この戦略は、アロステリック障害のために、生理学的タンパク質の機能の変化を回避する。他のタンパク質に融合した小端Hisタグは、切断されたGSTを洗い流し、ならびにタンパク質および他の分解によるタンパク質の純度を高めるために第二の精製工程において機能する<html>汚染物質。彼の精製工程カラム（TALON樹脂）にGSTの切り替えとさらに、プロトコルは、透析工程を必要としない。このような精製プロセスにおける一般的な汚染物質は、熱ショックタンパク質（HSP）である。 MgCl 2およびATPとのインキュベーション工程の追加は、これらの汚染物質を除去する（ 図1）を可能にする。 高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、関心対象の精製されたタンパク質を高収率で生成するために高価な器具類に依存する一般的な技術である。我々はここで紹介するバッチ精製プロトコールは、対照的に、手動で、高価な楽器のセットアップを必要としません。タンパク質の高収量は、プロトコルをスケールアップして行くことができます。これと同時に、バッチ精製プロトコルで、溶出体積はFPLCまたはHPLCで指定されていないタンパク質濃度を向上させるために調整することができる。 ntent &quot;&gt;また、バッ​​チGST-Hisの精製プロトコルで、〜10〜300 kDaの範囲のサイズを有するタンパク質を精製することができる。最大の利点の一つは、一つは、同時にいくつかのタンパク質を精製することができるという事実によって与えられる。例えば、野生型及びその変異タンパク質の両方が提示されたプロトコルの成功は、単独で目的のタンパク質の発現レベルおよび溶解度に依存する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.Coli &lt;/em&gt;DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I and II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 infected cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission enzyme</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace&#039;s infected medium supplemented</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum characterized</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (Penicillin-Streptomycin)</td><td>Gibco (Life)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose resin</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco (Life)</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal GST-antibody</td><td>Production in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 6X-His-antibody</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his purification: a two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins

インビトロにおけるタンパク質の生化学的特徴付けのための酵素学における重要なアッセイは、関心対象の精製されたタンパク質の高濃度を必要とする。タンパク質精製プロトコルは、効率性、単純性、および費用対効果1を結合する必要があります。ここでは、N-末端グルタチオンセファロースタグ（GST）2,3両融合されるC-末端10xHisタグ4に基づいて、組換えタンパク質のための新たな小規模アフィニティー精製システムとしてGST-Hisの方法を記載目的のタンパク質に。後者の構築物は、タンパク質発現のために5感染したSf9細胞の感染のために、バキュロウイルスを生成するために使用される。 GSTは、浄化効率を確保するのに役立つかなり長いタグ（29 kDa）のである。しかしながら、タンパク質の生理学的特性に影響を与えるかもしれない。従って、それは、その後、プレシジョン酵素6を用いてタンパク質から切断される。最大の純度を保証し、切断されたGSTを除去するために、我々比較的小さいHisタグに基づいて、第二のアフィニティー精製工程を追加した。重要なことには、我々の技術が劣化したタンパク質を除去し、従って、完全長タンパク質を豊かにするための効率的なツールであるタンパク質の両端に隣接する2つの異なるタグに基づいている。ここで紹介する方法は、FPLC等の高価な楽器のセットアップを必要としない。さらに、我々は、夾雑核酸廃止する熱ショックタンパク質不純物およびヌクレアーゼ処理を除去するためにMgCl 2およびATPの洗浄を組み込んだ。要約すると、隣接する2つの異なるタグの組合せN-およびC-末端とタグのいずれかを切断する能力が、興味のある高度に精製された全長タンパク質の回収で評価する。

GST-Hisの精製プロトコールの効率を例証するために、我々はRec14、S.精製 32.9 kDaでpombeのタンパク質。 Rec14 cDNAは、N-およびC-末端GST-およびHis-タグの付加を可能にする我々の修飾するpFastBac1ベクターであった（ 図1A）にクローニングした。組換えバキュロウイルスを調製し、次いで、タンパク質発現のためにSF9に感染した細胞に感染させた。可溶性細胞溶解物をGSTビー?...

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GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

本プロトコルでは、一意に切断可能なGST-タグおよび小Hisタグを組み合わせることにより組換えタンパク質の精製を可能にする非常に効率的で費用対効果の高い小規模タンパク質精製方法を実証する。

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

gst-his-purification-two-step-affinity-purification-protocol-yielding

Research

JoVE Journal

Biology

41.6K ビュー.  Hôtel-Dieu de Québec. 本プロトコルでは、一意に切断可能なGST-タグおよび小Hisタグを組み合わせることにより組換えタンパク質の精製を可能にする非常に効率的で費用対効果の高い小規模タンパク質精製方法を実証する。 

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Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

生化学

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, the calcium (Ca2+)-permeable cation channel, transient receptor potential (TRP), binds tightly to the scaffold protein, inactivation-no-after-potential D (INAD), and forms a large signaling protein complex with eye-specific protein kinase C (ePKC) and phospholipase C&#946;/No receptor potential A (PLC&#946;/NORPA). However, the biochemical properties of the Drosophila TRP channel remain unclear. Based on the assembling mechanism of INAD protein complex, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous TRP channel. First, the purified histidine (His)-tagged NORPA 863-1095 fragment was bound to Ni-beads and used as bait to pull down the endogenous INAD protein complex from Drosophila head homogenates. Then, excessive purified glutathione S-transferase (GST)-tagged TRP 1261-1275 fragment was added to the Ni-beads to compete with the TRP channel. Finally, the TRP channel in the supernatant was separated from the excessive TRP 1261-1275 peptide by size-exclusion chromatography. This method makes it possible to study the gating mechanism of the Drosophila TRP channel from both biochemical and structural angles. The electrophysiology properties of purified Drosophila TRP channels can also be measured in the future.

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Based on the assembling mechanism of the INAD protein complex, in this protocol, a modified affinity purification plus competition strategy was developed to purify the endogenous Drosophila TRP channel.

内因性 ショウジョウバエ 一過性受容器電位チャネルの精製

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

溶質キャリアトランスポーターの発現および精製戦略

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

著者スポットライト:コドン最適化遺伝子を用いたヒト溶質キャリアトランスポーターの発現と精製 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident STIM1 regulates the activity of PM Orai1 channels in a process known as store operated calcium (Ca2+) entry which is the principal Ca2+ signaling process that drives the immune response. STIM1 undergoes post-translational N-glycosylation at two luminal Asn sites within the Ca2+ sensing domain of the molecule. However, the biochemical, biophysical, and structure biological effects of N-glycosylated STIM1 were poorly understood until recently due to an inability to readily obtain high levels of homogeneous N-glycosylated protein. Here, we describe the implementation of an in vitro chemical approach which attaches glucose moieties to specific protein sites applicable to understanding the underlying effects of N-glycosylation on protein structure and mechanism. Using solution nuclear magnetic resonance spectroscopy we assess both efficiency of the modification as well as the structural consequences of the glucose attachment with a single sample. This approach can readily be adapted to study the myriad glycosylated proteins found in nature.

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Biochemical and structural analyses of glycosylated proteins require relatively large amounts of homogeneous samples. Here, we present an efficient chemical method for site-specific glycosylation of recombinant proteins purified from bacteria by targeting reactive Cys thiols.

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

免疫・感染学

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

生物学

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

要約

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SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

哺乳類 Bestrophin イオンチャネルの発現と精製

内因性ショウジョウバエ一過性受容器電位チャネルの精製

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

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