עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי K08 NS061039-01A2, התכנית לנוירולוגיה מחקר וגילוי, ואלפרד טאובמן מכון המחקר הרפואי א באוניברסיטת מישיגן. עבודה זו השתמשה במורפולוגיה וניתוח תמונת הליבה של מחקר מישיגן הסוכרת ומרכז הדרכה, שמומן על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט 5P90 DK-20572 מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות. המחברים מבקשים להודות לרובינסון וסינגלטון גורדון סמית (אוניברסיטת יוטה) לתרומתם הנדיבה של דגימות עור אנושיות כדי לתמוך בפיתוח הראשוני של טכניקת אימונוהיסטוכימיה הסמן הביולוגי nociceptive.

חלק א &#39;: אימונוהיסטוכימיה הכנה של צלחת 96 היטב ומניעה של ביופסיות עור Punch מכתים רקע נאספות מבני אדם וטופחו במשך 12-24 שעות בפתרון מקבע (paraformaldehyde 2% עם פתרון 0.75 מ &#39;L-ליזין (pH 7.4) ונתרן 0.05 מ&quot;מ periodate) על 4 מעלות צלזיוס כפי שתואר לעיל 8. דוגמאות אז cryoprotected בופר פוספט (PBS) עם גליצרול 20% על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1, מוטבע בתקשורת הרכבה טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר), ולאחר מכן מחולקת למקטעים עבים 50 מיקרומטר על cryostat. הפרוטוקול המתואר להלן מיועד לחלקי עור 8, את המספר המרבי של חלקי עור אפשר לעבור אימונוהיסטוכימיה החופשית צף באחד 96 גם צלחת. יום 1: 1. מניעת immunoreactivity הלא ספציפי בשכבה הקרנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 96 גם צלחת תווית כפי שמוצג באיור 1. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של תמונה-IT FX איתותים (Image-IT), יעילות לחסימת מכתים רקע 11,12, לכל אחד גם בשורת 1 של 96 גם הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של 1X PBS היטב לתוך כל אחד בשורת 2 ו -3 של 96 גם הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת שני סעיפים 50 מיקרומטר לכל מטופל: סעיף אחד מהביופסיה נלקחת בDL, סעיף אחד מהביופסיה נלקחת בPT. לולאת inoculating (LeLoop) משמשת להעברת חלקים מאחד למשנהו לשטוף כדי למנוע נזק מורפולוגי. בעדינות להעביר כל סעיף 50 מיקרומטר, באמצעות לולאת inoculating, לאדם גם בשורה 1, המכיל תמונה-IT. דגירה סעיפים בתמונה-IT עבור 30 דקות ב RT על כיסא נדנדה שטוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את חלקי פעמיים עם 1X PBS (שורות 2 ו -3) במשך 10 דקות ב RT. מניחים צלחת גם על כיסא נדנדה שטוחה בין שטיפות. </li></ol> 2. הכנה של 5% פתרון חסימת BSA ו1% פתרון שטיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפי ביופסיה הם דוגרים בתמונה-IT, להכין 5% חסימת solution (5% פתרון BSA, 0.3% TX-100, 0.1 מ &#39;PBS-BSA וורטקס עד מתמוסס לחלוטין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של פתרון חסימת BSA 5% לבאר כל השורה 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאת inoculating, להעביר חלקים לתוך בארות בודדות של פתרון 5% BSA חסימה. דגירה סעיפים בפתרון חסימת BSA 5% עבור 1-2 שעות ב RT על כיסא נדנדה שטוחה. </li></ol> 3. הכנה של 1% פתרון BSA שטיפה ודילול של נוגדנים ראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפים הם דוגרים בפתרון 5% BSA חסימה, להכין 1% שטיפת פתרון (BSA 1%, 0.3% פתרון TX-100, 0.1 מ &#39;PBS-BSA וורטקס עד מתמוסס לחלוטין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפים הם דוגרים בפתרון 5% BSA חסימה, לדלל נוגדנים עיקריים ב1% שטיפת פתרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך שמונה סעיפים (μl 8 X 150 = 1,200 μl) יש צורך בסכום כולל של 1,200 μl. את הנוגדנים הראשוניים מורכבים ב1,500 μl (כ -20% בנפח נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים של הנוגדנים העיקריים: PGP, 1:500; TRK,1:500 ב1% BSA שטיפת פתרון. </li></ol></li></ol> 4. דגירה של ביופסיות מחולק בנוגדן ראשוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של נוגדנים עיקריים מדוללים לתוך הבארות הייעודיות של 96 גם הצלחת (שורה 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלקים מ5% חסימת פתרון (שורה 4) לתוך בארות הנוגדן הראשוניות הייעודיות (שורה 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת 96 היטב עם parafilm ורדיד אלומיניום, כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 96 גם צלחת O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה שטוחה. </li></ol> יום 2: 5. יש לשטוף את ביופסיות בפתרון שטיפת BSA 1% <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של פתרון שטיפת BSA 1% לכל אחד גם בשורה 6, 7, ו -8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם שטיפת פתרון BSA 1% (6 שורות, 7, ו -8) במשך שעה 1 בכל פעם על RT. לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום ומניחים על נדנדה שטוחה בין שטיפות. </li></ol> 6. דילול של נוגדנים משני &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפים מודגרת בשטיפה האחרונה של פתרון שטיפת BSA 1% (שורה 8), לדלל נוגדנים משני בפתרון שטיפת BSA 1%: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך שמונה סעיפים (μl 8 X 150 = 1,200 μl) יש צורך בסכום כולל של 1,200 μl. את הנוגדנים משני בנויים ב1,500 μl (כ -20% בנפח נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים של נוגדנים משני: לPGP (אלקסה פלואוריד 488 חמור נגד הארנב, 1:250), לTRK (אלקסה פלואוריד 647 חמורים נגד עיזים, 1:250) בפתרון BSA 1% שטיפה. </li></ol></li></ol> 7. דגירה של ביופסיות מחולק בנוגדנים משני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של נוגדנים משני מדוללים לתוך בארותיהם המיועדות של צלחת 96 היטב (שורה 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלקים מחסימת פתרון 1% BSA (שורה 8) לנוגדנים משני היטב (שורה 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת 96 היטב עם parafilm ורדיד אלומיניום, כדי למנוע התייבשות וחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים במיועד המשני הנוגדנים O/ N ב 4 ° C על כיסא נדנדה שטוחה. </li></ol> 8. יש לשטוף את ביופסיות בפתרון שטיפת BSA 1% <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של 1% BSA פתרון שטיפה היטב לתוך כל אחד בשורת 10, 11, ו -12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם שטיפת פתרון BSA 1% (10 שורות, 11, ו -12) עבור שעה 1 בכל פעם על RT. לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום ומניחים על כיסא נדנדה שטוחה בין שטיפות. </li></ol> 9. הכנת שקופיות מיקרוסקופ וביופסיות מחולק הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד סעיפי ביופסיה הם דוגרים בשטיפה האחרונה של שטיפת פתרון BSA 1% (שורה 12), להכין שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 50 μl של פתרון BSA 1% שטיפה בשקופית אחת בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חלקים מפתרון שטיפת BSA 1% (שורה 12), ולמקם אותו בירידה של 50 μl פתרון שטיפת BSA 1% בשקופית מיקרוסקופ הייעודי. אחרי אופטימיזציה עמדתו של הסעיף, להסיר פתרון BSA 1% עודף שטיפה עם טפטפת זכוכית כדורית, נקיטת אמצעי זהירותכדי להימנע ממגע הדגימה. </li></ol> הערה: ודא שסעיף אינו מקופל; הדגימה צריכה להיות שטוחה על פני השטח של שקופית מיקרוסקופ. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 טיפה של להאריך antifade זהב הרכבה מגיב עם DAPI ליד הביופסיה בשקופית מיקרוסקופ. קח coverslip זכוכית מיקרוסקופ מ&quot;מ 22x22 ומניח בעדינות אותו על ביופסיה וירידה של להאריך מגיב antifade זהב עם ירידת DAPI. חזור על פעולה עבור כל מקטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות מיקרוסקופ יבשה O / N ב RT בחושך. </li></ol> הערה: הוצא את כל בועות אוויר באמצעות קצה פיפטה. למחות עודף להאריך מגיב antifade זהב. חלק ב &#39;: ההדמיה Confocal 10. ההדמיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותות הקרינה תמונה באמצעות לייזר 500 FluoView אולימפוס סריקת מיקרוסקופ confocal עם נפט טבילה (1.3 NA) אובייקטיבית וזום שתי פעמים עם תוכנת 5.0 גרסת FluoView 40X. </p&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אלקסה פלואוריד 488 ו אלקסה פלואוריד 647 לרגש HeNe 543 ננומטר לייזר הירוק והאדום HeNe לייזר 633 ננומטר, בהתאמה. אות אלקסה פלואוריד 488 מיוצגת על ידי מראה ירוק עד שולחן (LUT) ופלואוריד אלקסה 647 על ידי LUT אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פתחי confocal לכל גלאי ב400 מיקרומטר כדי לשפר את האותות. סריקות רציפות צריכים להילקח ברזולוציה של 1,024 x 1,024 למקסם את הפרדת אות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד תלת ממדי Z-סדרה באמצעות 1.2 מיקרומטר מרווחי z צעד (מבוסס על יחידת הסריקה האופטימלית מחושבת על ידי תוכנת FluoView) עם מיצוע קלמן (שתי מסגרות). </li></ol> חלק ג&#39;: ויזואליזציה ואנימציה תלת ממדיות 11. ויזואליזציה (3D) תלת ממדים ואנימציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי FluoView פתוחים בתוכנת x64 Imaris (גרסה 7.3, Bitplane AG) כדי להמחיש את הסטים של תמונות 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם להציג לפי צורך כדי לשפר את הניגודיות של אות מסוימת בעצבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור surface לדמיין גבול עורי, אפידרמיס. השתמש בכלי קונטור בתיקו מצב לשרטט את הגבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצאת משטח שקוף למחצה עד לגבול כדי לראות את אותות הניאון בסיסיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת תמונות סטילס של אותות ניאון 3D כדי ליצור תמונות Snapshot של סרט 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתכונת האנימציה ליצור סרט 3D. את התמונות ניתן לסובב 360 מעלות מספר פעמים כדי להראות לכל אות בנפרד וממוזג (איורים 2, 3 ו -4). הגדר אנימציה כדי ליצור סרטים בהיקף של 200 מסגרות אנימציה ב15 מסגרות לשנייה. שמור כל סרט כקובץ AVI גלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוס את סרט AVI הסופי עם תוכנת VirtualDub (גרסת 1.9.4). </li></ol>

<ol>
	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies.">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li><li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor/p38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes.">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li><li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies.">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li><li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation.">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li><li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies.">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+among+pain,+sensory+loss,+and+small+nerve+fibers+in+diabetes.">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies.">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li><li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים להכריז.

מדידה של IENFD כבר בשימוש נרחב על מנת לקבוע את מידת נוירופתיה היקפית 13,14. נכון לעכשיו, הפרוטוקול הנפוץ ביותר מודד רק את הצפיפות של סיבי עצב שחודרים את קרום המרתף של האפידרמיס, זה לא לוקח בחשבון הסתעפות ו / או שינויים מורפולוגיים של העצבים axonal. בנוסף, ניתוח IENFD נוכחי ל...

נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ עבור רופאים לכמת צפיפות סיבי עצב intraepidermal, (IENFD) מביופסיות אגרוף עור, שניתן להשתמש בם כדי לאבחן neuropathies קטן סיבים 3, 6-8. ביופסיות שנלקחו מהרגל דיסטלי (DL), 10 ס&quot;מ מעל malleolus לרוחב, וירך הפרוקסימלי (PT), 20 ס&quot;מ מתחת לעמוד השדרה הכסל הקדמי 9. כל IENF מסומנים באמצעות מוצר גן חלבון 9.5 (PGP), סמן 10-12 מחבת עצבית. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD נקבע על ידי צביעת PGP עם brightfield מיקרוסקופיה 6. בנוסף, מספר קבוצות מחקר השתמשו בפרוטוקולי Immunofluorescent לPGP אימונוהיסטוכימיה 7-9. נוירופתיה סיבים קטנה היא נפוצה הקשורים כאב נוירופתי. על מנת להבין את תפקידו של IENF החיוני לעיבוד כאב נוסף, פיתחנו טכניקה לIENF הכוללת שיתוף תווית עם סיבים שיוצרים כאב. Nociceptive IENF, במיוחד Aδ וסיבי C, ניתן ללמוד דרך שיתוף התיוג של IENF עם PGP וסמן nociceptive, tropomyosin-קולטן קינאז (TRK) 5. TRK הוא זיקה הגבוהה לקולטן לגורם גדילה עצבי שחיוני להתפתחות של Nociception. את סיבי עצב nociceptive חיובי TRK הם סיבים שpeptidergic המפורש חומר P (SP) וקלציטונין גנים הקשורים פפטיד (CGRP). בעבר, Lauria ועמיתיו ליישם את הטכניקה כפולת התיוג ללמוד PN, IENF PGP חיובי שיתוף תיוג עם סמן nociceptive 10. במחקר הקודם שלנו, הוכיח כי IENF TRK-חיובי, אך לא IENF שלילי TRK, שהוגברו במודל חיה של נוירופתיה סוכרתית כואבת 5. טכניקת שיתוף תיוג זה מספקת את היכולת להשוות כימות של IENFD nociceptive לסך IENFD והיכולת ללמוד שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. היכולת לדמיין IENF nociceptive וcompaמחדש כימות של IENFD המוחלטת לIENFD nociceptive יכולה לספק ראיות אובייקטיביות לקיומו של כאב, ואולי תובנה חומרת כאב קשור PN. טכניקה זו היא גם לעור של מודלים של בעלי חיים. בהשוואה למחקרים קודמים, בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לניתוח תמונת 3D, יצירת ההזדמנות להימנע מטעויות שעלולות להתרחש בניתוח תמונת 2D.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

ביופסיה של העור משמשת בדרך כלל כדי לכמת את צפיפות סיבי עצב intraepidermal (IENFD) לאבחון של 1,2 פולינאורופתיה ההיקפי. נכון לעכשיו, הוא מנהג נפוץ כדי לאסוף 3 מ&quot;מ ביופסיות עור מהרגל דיסטלי (DL) והירך הפרוקסימלי (PT) להערכת polyneuropathies אורך תלויה 3. עם זאת, בשל אופי multidirectional של IENFs, זה מאתגר לבחון חופף מבנים עצביים דרך הניתוח של הדמיה דו ממדית (2D). לחלופין, הדמיה תלת ממדית (3D) יכולה לספק פתרון טוב יותר לדילמה זו. בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מציגים שיטות ליישום 3D הדמיה ללמוד נוירופתיה הכואבת (PN). על מנת לזהות IENFs, דגימות עור מעובדות לניתוח immunofluorescent של מוצר חלבון גן 9.5 (PGP), סמן עצבי מחבת. נכון לעכשיו, הוא מנהג סטנדרטי לאבחון neuropathies סיבים הקטנים באמצעות IENFD להרתיענכרה על ידי אימונוהיסטוכימיה PGP באמצעות מיקרוסקופיה brightfield 4. במחקר הנוכחי, אנחנו מוחלים ניתוח כפול immunofluorescent לזהות IENFD הכולל, באמצעות PGP, וIENF nociceptive, באמצעות השימוש בנוגדנים המזהים tropomyosin קולט-קינאז, זיקה גבוהה לקולטן (TRK) לגורם גדילה עצבי 5. היתרונות של IENF שיתוף מכתים עם PGP וTRK A נוגדני יתרונות המחקר של PN ידי בבירור מכתים סיבי PGP חיוביים, nociceptive. ניתן לכמת אותות ניאון אלה כדי לקבוע שינויי IENFD ומורפולוגי nociceptive של IENF קשורים PN. את תמונות הניאון נרכשות על ידי מיקרוסקופיה confocal ומעובד לניתוח 3D. 3D הדמיה מספקת יכולות סיבוב נוסף כדי לנתח שינויים מורפולוגיים הקשורים PN. יחדיו, ניאון שיתוף מכתים, ההדמיה confocal, וניתוח 3D באופן ברור לטובת המחקר של PN.

אנחנו מוחלים פרוטוקול הנוכחי כדי ללמוד את המורפולוגיה של IENF בביופסיות עור וPT DL מחולים עם PN. העור, משלושה נושאים, שנאסף באוניברסיטת יוטה להפגין pathomorphology קשור PN. הנושאים כוללים: מקרה 1: גבר בן 51 עם היסטוריה של PN של סוכרת מהסוג 2 (משך: 14 חודשים; ניקוד כאב: 51); מקרה 2: גבר בן 56 עם ...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies at JoVE.com

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K Views.  University of Michigan. על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.

Video: Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Objective Nociceptive Assessment in Ventilated ICU Patients: A Feasibility Study Using Pupillometry and the Nociceptive Flexion Reflex

The concept of objective nociceptive assessment and optimal pain management have gained increasing attention. Despite the known negative short- and long-term consequences of unresolved pain or excessive analgosedation, adequate nociceptive monitoring remains challenging in non-communicative, critically ill adults. In the intensive care unit (ICU), routine nociceptive evaluation is carried out by the attending nurse using the Behavior Pain Scale (BPS) in mechanically ventilated patients. This assessment is limited by medication use (e.g., neuromuscular blocking agents) and the inherent subjective character of nociceptive evaluation by third parties.
Here, we describe the use of two nociceptive reflex testing devices as tools for objective pain evaluation: the pupillary dilation reflex (PDR) and nociception flexion reflex (NFR). These measurement tools are non-invasive and well tolerated, providing clinicians and researchers with objective information regarding two different nociceptive processing pathways: (1)&#160;the pain-related autonomic reactivity&#160;and (2) the ascending component of the somatosensory system. The use of PDR and NFR measurements are currently limited to specialized pain clinics and research institutions because of impressions that these are technically demanding or time-consuming procedures, or even because of a lack of knowledge regarding their existence.
By focusing on the two abovementioned nociceptive reflex assessments, this study evaluated their feasibility as a physiological pain measurement method in daily practice. Pursuing novel technologies for evaluating the analgesia level in unconscious patients may further improve individual pharmacological treatment and patient related outcome measures. Therefore, future research must include large well-designed clinical trials in a real-life environment.

Pain assessment in anesthetized patients who cannot communicate with the outside world in any way remains challenging despite the development of innovative objective pain evaluation tools. In this project, the pupillary dilation reflex and the nociception flexion reflex are assessed in critically ill, mechanically ventilated adult patients.

הערכה אובייקטיבית Nociceptive בחולים נמרץ מאוורר: בדיקת התכנות באמצעות Pupillometry ואת רפלקס כיפוף Nociceptive

The concept of objective nociceptive assessment and optimal pain management have gained increasing attention. Despite the known negative short- and ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

הדפסה תלת-ממדית של סטייה אבי העורקים מורכבים

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל במודל נמק הינדלימב מורין

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

אנדודונטיה מודרכת: תכנון תלת מימדי והכנת חללי גישה אנדודונטיים בעזרת תבנית

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...