وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08-01A2 NS061039، وبرنامج الأمراض العصبية بحوث واكتشاف، وألف توبمان معهد ألفريد بحوث الطبية في جامعة ميشيغان. يستخدم هذا العمل مورفولوجية وصورة التحليل الأساسي للميشيغان أبحاث السكري ومركز التدريب، بتمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 5P90 DK-20572 من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. فإن الكتاب أود أن أشكر روبنسون سينغلتون وغوردون سميث (جامعة يوتا) للتبرع السخي من عينات الجلد البشري لدعم التطوير الأولي للمسبب العلامات البيولوجية تقنية المناعية.

جزء A: المناعية يتم جمع وإعداد لوحة 96 جيدا والوقاية من خلفية تلطيخ لكمة خزعات الجلد من البشر والمحتضنة لمدة 12-24 ساعة في حل تثبيتي (2٪ بارافورمالدهيد مع 0.75 M حل L-يسين (الرقم الهيدروجيني 7.4) و 0.05 ملي الصوديوم بريودات) في 4 درجات مئوية كما هو موضح سابقا 8. ثم يتم cryoprotected عينات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع الجلسرين 20٪ في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع، جزءا لا يتجزأ في وسائل الإعلام تصاعد درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر)، ثم مقطوع إلى 50 ميكرون أبواب سميكة على ناظم البرد. تم تصميم البروتوكول هو موضح أدناه للحصول على 8 أقسام الجلد، والحد الأقصى لعدد أقسام الجلد ممكن للخضوع المناعية التعويم الحر في لوحة واحدة 96-جيدا. DAY 1: 1. الوقاية من مناعية غير محددة في الطبقة القرنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسمية وحة 96 جيدا كما هو مبين في الشكل 1. </lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من صورة FX-IT الإشارات (صورة-IT)، وفعالة من أجل الحيلولة دون تلوين الخلفية 11،12، في كل بئر في الصف 1 من لوحة 96 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من 1X PBS في كل بئر في الصف 2 و 3 من لوحة 96 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على اثنين من 50 ميكرومتر المقاطع لكل مريض: مقطع واحد من الخزعة التي اتخذت في DL، مقطع واحد من الخزعة التي اتخذت في PT. يستخدم حلقة بتلقيح (LeLoop) لنقل مقاطع من واحد شطف إلى التالي لتجنب الضرر المورفولوجية. نقل بلطف كل قسم ميكرومتر 50، وذلك باستخدام حلقة بتلقيح، إلى الفرد بشكل جيد من الصف 1، تحتوي على صورة-IT. احتضان المقاطع في صورة-IT لمدة 30 دقيقة في RT على الكرسي الهزاز مسطحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع مرتين مع 1X PBS (الصفوف 2 و 3) لمدة 10 دقيقة في RT. وضع لوحة جيدا على الكرسي الهزاز شقة بين يشطف. </li></ol> 2. إعداد 5٪ BSA عرقلة الحل و1٪ من محلول الشطف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما تحتضن أقسام خزعة في صورة-IT، وإعداد 5٪ عرقلة المحاليلنشوئها (5٪ BSA، 0.3٪ TX-100، 0.1 M الحل PBS-دوامة حتى يذوب تماما BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من 5٪ BSA عرقلة الحل في كل بئر من الصف 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حلقة بتلقيح، ونقل المقاطع إلى الآبار الفردية من 5٪ BSA عرقلة الحل. احتضان المقاطع في 5٪ BSA عرقلة الحل لمدة 1-2 ساعة على RT على الكرسي الهزاز مسطحة. </li></ol> 3. إعداد 1٪ BSA الشطف الحل والتخفيف من الأجسام المضادة الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما تحتضن المقاطع في 5٪ BSA عرقلة الحل، وإعداد 1٪ محلول الشطف (1٪ BSA، 0.3٪ TX-100، 0.1 M الحل PBS-دوامة حتى يذوب تماما BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما تحتضن المقاطع في 5٪ BSA عرقلة الحل، وتمييع الأجسام المضادة الأولية في 1٪ الشطف حل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمدة ثمانية أقسام (8 × 150 = 1،200 ميكرولتر ميكرولتر) هناك حاجة إلى ما مجموعه 1،200 ميكرولتر. مصنوعة من الأجسام المضادة الأولية تصل في 1،500 ميكرولتر (حوالي حجم إضافي 20٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية: PGP، 1:500؛ تورك A،1:500 في 1٪ BSA الشطف حل. </li></ol></li></ol> 4. حضانة خزعات مقطوع في الأجسام المضادة الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في الآبار المعينة من لوحة 96 جيدا (الصف 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أقسام من 5٪ عرقلة الحل (الصف 4) في الآبار الأجسام المضادة الأولية المعينة (الصف 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة 96 جيدا مع parafilm ورقائق الألومنيوم لتجنب جفاف والتعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة 96 جيدا O / N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز مسطحة. </li></ol> يوم 2: 5. شطف خزعات في 1٪ BSA الشطف الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من 1٪ BSA حل الشطف في كل بئر في الصف 6، 7، و 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف أقسام ثلاث مرات مع 1٪ BSA حل الشطف (الصفوف 6 و 7 و 8) لمدة 1 ساعة في كل مرة في RT. تغطية لوحة جيدا بورق الألمنيوم ومكان على الروك شقة بين يشطف. </li></ol> 6. التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية &lt;OL&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين يتم تحضين المقاطع في شطف الماضي من 1٪ BSA حل الشطف (الصف 8)، وتمييع الأجسام المضادة الثانوية في 1٪ BSA حل الشطف: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمدة ثمانية أقسام (8 × 150 = 1،200 ميكرولتر ميكرولتر) هناك حاجة إلى ما مجموعه 1،200 ميكرولتر. مصنوعة من الأجسام المضادة الثانوية في عام 1500 ميكرولتر (حوالي حجم إضافي 20٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخفيفات من الأجسام المضادة الثانوية: لPGP (فلور اليكسا 488 حمار المضادة للأرنب، 1:250)، لتورك A (فلور اليكسا 647 حمار المضادة للماعز، 1:250) في 1٪ BSA حل الشطف. </li></ol></li></ol> 7. حضانة خزعات مقطوع في الضد الثانوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف في الآبار المخصصة لهم من لوحة 96 جيدا (الصف 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أقسام من 1٪ BSA عرقلة الحل (الصف 8) إلى الأجسام المضادة الثانوية جيدا (الصف 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة 96 جيدا مع parafilm ورقائق الألومنيوم لتجنب جفاف والتعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع في المعينة الثانوية الأجسام المضادة O/ N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز مسطحة. </li></ol> 8. شطف خزعات في 1٪ BSA الشطف الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من 1٪ BSA الشطف الحل في كل بئر في صف 10، 11، و 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف أقسام ثلاث مرات مع 1٪ BSA حل الشطف (الصفوف 10، 11، و 12) لمدة 1 ساعة في كل مرة في RT. تغطية لوحة جيدا بورق الألمنيوم ومكان على الكرسي الهزاز شقة بين يشطف. </li></ol> 9. إعداد الشرائح المجهر وتركيب مقسم خزعات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما تحتضن أقسام خزعة في شطف الماضي من 1٪ BSA حل الشطف (الصف 12)، وإعداد الشرائح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 50 ميكرولتر من 1٪ BSA حل الشطف على شريحة واحدة في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أجزاء من 1٪ BSA حل الشطف (الصف 12)، ووضعه في انخفاض 50 ميكرولتر من 1٪ BSA الشطف حل على شريحة المجهر المعينة. بعد تحقيق الاستفادة المثلى من موقف من هذا الباب، إزالة الزائدة 1٪ BSA حل الشطف مع ماصة الزجاج bulbed، اتخاذ الاحتياطاتلتجنب لمس العينة. </li></ol> ملاحظة: تأكد من عدم مطوية القسم أكثر، وينبغي أن تكون العينة شقة ضد سطح شريحة المجهر. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان 1 قطرة من إطالة الذهب antifade تصاعد كاشف مع دابي بالقرب من الخزعة على شريحة المجهر. نلقي المجهر 22x22 ملم ساترة الزجاج ووضعه برفق فوق خزعة وقطرة من الذهب إطالة كاشف antifade مع دابي قطرة. كرر لكل قسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الشرائح المجهر الجافة O / N في RT في الظلام. </li></ol> ملاحظة: إزالة أي فقاعات الهواء باستخدام طرف ماصة. امسحي الزائد إطالة الذهب antifade كاشف. الجزء باء: التصوير متحد البؤر 10. التصوير متحد البؤر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إشارات مضان صورة باستخدام أوليمبوس FluoView 500 ليزر متحد البؤر المسح المجهر مع النفط الغمر (1.3 NA) هدف 40X والتكبير مرتين مع FluoView إصدار البرنامج 5.0. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اليكسا فلور 488 واليكسا فلور 647 لإثارة 543 نانومتر هيليوم نيون ذو اللون الأخضر ليزر و633 نانومتر ليزر هيليوم نيون ذو الأحمر، على التوالي. يتم تمثيل اليكسا فلور 488 إشارة من نظرة الخضراء متابعة الجدول (طرفية) واليكسا فلور 647 من طرفية الأحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين فتحات متحد البؤر لكل كاشف في 400 ميكرون لتعزيز الإشارات. ينبغي أن تؤخذ بالاشعة متتابعة في قرار من 1،024 X 1،024 إلى تحقيق أقصى قدر من الانفصال إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط ثلاثي الأبعاد Z-سلسلة باستخدام 1.2 ميكرومتر فترات Z-خطوة (على أساس وحدة المسح الضوئي الأمثل وتحسب على أساس البرامج FluoView) مع كالمان في المتوسط ​​(إطارين). </li></ol> جزء C: التصور ثلاثي الأبعاد والرسوم المتحركة 11. ثلاثي الأبعاد (3D) وتصور الرسوم المتحركة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملفات مفتوحة Fluoview في Imaris البرنامج إلى x64 (الإصدار 7.3، Bitplane AG) لتصور مجموعات صورة 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط عرض حسب الحاجة لتعزيز النقيض من إشارة محددة العصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء سوrface لتصور الحدود الجلدي-البشرة. استخدام أداة كونتور في وضع التعادل لرسم الحدود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين سطح شبه شفافة على الحدود من أجل أن نرى إشارات الفلورسنت الكامنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور الثابتة من الإشارات الفلورسنت 3D لخلق صور لقطة من فيلم 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ميزة الرسوم المتحركة لإنشاء فيلم 3D. الصور يمكن أن تكون استدارة 360 درجة عدة مرات لاظهار كل إشارة على حدة والمدمجة (أرقام 2 و 3 و 4). ضبط الرسوم المتحركة لخلق أفلام تتكون من 200 إطارات الرسوم المتحركة في 15 لقطة في الثانية الواحدة. حفظ كل فيلم كملف AVI الخام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضغط الفيلم AVI النهائي مع برنامج فيرتوالدوب (الإصدار 1.9.4). </li></ol>

<ol>
	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies.">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li><li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor/p38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes.">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li><li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies.">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li><li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation.">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li><li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies.">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+among+pain,+sensory+loss,+and+small+nerve+fibers+in+diabetes.">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies.">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li><li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

أي تضارب في المصالح لتعلن.

قياس IENFD وقد استخدم على نطاق واسع لتحديد درجة من اعتلال الأعصاب المحيطية 13،14. في الوقت الحاضر، والبروتوكول الأكثر استخداما يقيس فقط كثافة من الألياف العصبية التي تخترق الغشاء القاعدي في البشرة، وهي لا تأخذ بعين الاعتبار المحاور المتفرعة و / أو التغيرات المورفو...

في الوقت الحاضر، بل هو ممارسة شائعة للأطباء لقياس كثافة الألياف العصبية داخل البشرة، (IENFD) من الجلد الخزعات لكمة، والتي يمكن استخدامها لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة 3، 6-8. يتم أخذ خزعات من الساق البعيدة (DL)، و 10 سم فوق الكعب الوحشي، والفخذ الدانية (PT)، و 20 سم تحت العمود الفقري الحرقفي الأمامي 9. وصفت جميع IENF باستخدام بروتين منتج الجين 9.5 (PGP)، علامة العصبية عموم 10-12. في الوقت الحاضر، فمن الممارسة القياسية لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة باستخدام IENFD يحدده تلطيخ PGP مع المجهري brightfield 6. بالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت العديد من المجموعات البحثية بروتوكولات مناعي لPGP المناعية 7-9. ويرتبط الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة عادة مع ألم الأعصاب. من أجل زيادة فهم دور IENF ضرورية لمعالجة الألم، قمنا بتطوير تقنية للمشاركة في تسمية مجموع IENF مع الألياف التي تولد الألم. NocicepTIVE IENF، Aδ على وجه التحديد والألياف C، يمكن دراستها من خلال المشاركة في وضع العلامات من IENF مع PGP وعلامة مسبب، تروبوميوزين مستقبلات كيناز A (تورك A) 5. TRK A هو مستقبلات تقارب السامي لعامل نمو الأعصاب التي لا غنى عنها لتنمية حس الألم. وتورك A-إيجابي الألياف العصبية مسبب هي ألياف ببتيدي المفعول التي تعبر عن جوهر P (SP) والكالسيتونين الجينات ذات الصلة الببتيد (CGRP). سابقا، لوريا وزملاؤه تطبيق تقنية مزدوجة وضع العلامات لدراسة PN، وشارك في وضع العلامات IENF إيجابية PGP مع علامة مسبب 10. في دراستنا السابقة، أثبتنا أن تورك IENF A-إيجابي، ولكن ليس تورك IENF A-السلبية، وupregulated في نموذج حيواني من الاعتلال العصبي السكري مؤلمة 5. توفر هذه التقنية شارك في وضع العلامات القدرة على مقارنة الكمي للIENFD مسبب إلى إجمالي IENFD والقدرة على دراسة التغيرات المورفولوجية المرتبطة PN. القدرة على تصور IENF مسبب والمقارنةالكمي إعادة IENFD الإجمالي إلى IENFD مسبب يمكن أن توفر دليل موضوعي على وجود الألم، وربما نظرة ثاقبة من شدة الألم الذي يصاحب PN. هذه التقنية قابلة للتطبيق على الجلد من النماذج الحيوانية أيضا. بالمقارنة مع الدراسات السابقة، ويصف البروتوكول الحالي طرق لتحليل الصور 3D، وخلق فرصة لتجنب الأخطاء التي يمكن أن تحدث في تحليل الصور 2D.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

A لكمة خزعة من الجلد يستخدم عادة لقياس كثافة الألياف العصبية داخل البشرة (IENFD) لتشخيص اعتلال الأعصاب الطرفية من 1،2. في الوقت الحاضر، بل هو ممارسة شائعة لجمع 3 خزعات الجلد مم من الساق البعيدة (DL) والفخذ الدانية (PT) لتقييم polyneuropathies التي تعتمد على طول 3. ومع ذلك، نظرا لطبيعة متعددة الاتجاهات من IENFs، فإنه يمثل تحديا لدراسة تداخل الهياكل العصبية من خلال تحليل ثنائي الأبعاد (2D) التصوير. بدلا من ذلك، يمكن ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير توفر حلا أفضل لهذه المعضلة. في التقرير الحالي، فإننا نقدم طرق لتطبيق التصوير 3D لدراسة الاعتلال العصبي المؤلم (PN). من أجل تحديد IENFs، تتم معالجة عينات الجلد لتحليل مناعي للبروتين منتج الجين 9.5 (PGP)، علامة العصبية عموم. في الوقت الحاضر، فمن الممارسة القياسية لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة باستخدام IENFD ردعتستخرجه PGP المناعية باستخدام المجهري brightfield 4. وفي الدراسة الحالية، طبقنا تحليل مناعي مزدوج لتحديد مجموع IENFD، وذلك باستخدام PGP، وIENF مسبب، من خلال استخدام الأجسام المضادة التي تعترف تروبوميوزين مستقبلات كيناز A (تورك A)، ومستقبلات تقارب السامي لعامل نمو العصب 5. مزايا IENF شارك في تلطيخ مع PGP وتورك A الأجسام المضادة تفيد دراسة PN بواسطة تلطيخ بوضوح إيجابية PGP، والألياف مسبب. يمكن قياس هذه الإشارات الفلورسنت لتحديد التغيرات المورفولوجية IENFD ومسبب من IENF المرتبطة PN. يتم الحصول على الصور الفلورسنت بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر وتجهيزها للتحليل 3D. يوفر 3D التصوير قدرات التناوب إلى مزيد من تحليل التغيرات المورفولوجية المرتبطة PN. أخذت معا، فلوري شارك في تلطيخ، والتصوير متحد البؤر، وتحليل 3D تستفيد بوضوح دراسة PN.

طبقنا البروتوكول الحالي لدراسة مورفولوجية IENF في PT وDL خزعات الجلد من المرضى الذين يعانون من PN. الجلد، من ثلاث مواد، تم جمعها في جامعة ولاية يوتا لإثبات المورفولوجيا المرضية المرتبطة PN. الموضوعات ما يلي: حالة 1: الذكور 51 عاما مع تاريخ من PN من مرض السكري من النوع 2 (المدة: 14...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies at JoVE.com

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

من أجل دراسة التغيرات من الألياف العصبية داخل البشرة مسبب (IENFs) في اعتلال الأعصاب المؤلم (PN)، قمنا بتطوير البروتوكولات التي يمكن أن تفحص مباشرة التغيرات المورفولوجية ثلاثي الأبعاد لوحظ في IENFs مسبب. تحليل ثلاثي الأبعاد للIENFs لديه القدرة على تقييم التغيرات المورفولوجية للIENF في PN.

التصوير ثلاثي الأبعاد من مسبب الألياف العصبية داخل البشرة في خزعات الجلد البشري

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K Views.  University of Michigan. من أجل دراسة التغيرات من الألياف العصبية داخل البشرة مسبب (IENFs) في اعتلال الأعصاب المؤلم (PN)، قمنا بتطوير البروتوكولات التي يمكن أن تفحص مباشرة التغيرات المورفولوجية ثلاثي الأبعاد لوحظ في IENFs مسبب. تحليل ثلاثي الأبعاد للIENFs لديه القدرة على تقييم التغيرات المورفو?...

Video: Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

ثقافة الأنسجة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الابتدائية نخاع العظم الإنسان والأورام الخبيثة في

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Objective Nociceptive Assessment in Ventilated ICU Patients: A Feasibility Study Using Pupillometry and the Nociceptive Flexion Reflex

The concept of objective nociceptive assessment and optimal pain management have gained increasing attention. Despite the known negative short- and long-term consequences of unresolved pain or excessive analgosedation, adequate nociceptive monitoring remains challenging in non-communicative, critically ill adults. In the intensive care unit (ICU), routine nociceptive evaluation is carried out by the attending nurse using the Behavior Pain Scale (BPS) in mechanically ventilated patients. This assessment is limited by medication use (e.g., neuromuscular blocking agents) and the inherent subjective character of nociceptive evaluation by third parties.
Here, we describe the use of two nociceptive reflex testing devices as tools for objective pain evaluation: the pupillary dilation reflex (PDR) and nociception flexion reflex (NFR). These measurement tools are non-invasive and well tolerated, providing clinicians and researchers with objective information regarding two different nociceptive processing pathways: (1)&#160;the pain-related autonomic reactivity&#160;and (2) the ascending component of the somatosensory system. The use of PDR and NFR measurements are currently limited to specialized pain clinics and research institutions because of impressions that these are technically demanding or time-consuming procedures, or even because of a lack of knowledge regarding their existence.
By focusing on the two abovementioned nociceptive reflex assessments, this study evaluated their feasibility as a physiological pain measurement method in daily practice. Pursuing novel technologies for evaluating the analgesia level in unconscious patients may further improve individual pharmacological treatment and patient related outcome measures. Therefore, future research must include large well-designed clinical trials in a real-life environment.

Pain assessment in anesthetized patients who cannot communicate with the outside world in any way remains challenging despite the development of innovative objective pain evaluation tools. In this project, the pupillary dilation reflex and the nociception flexion reflex are assessed in critically ill, mechanically ventilated adult patients.

تقييم Nociceptive موضوعي في المرضى التهوية اتحاد المحاكم الإسلامية: دراسة جدوى استخدام بوبيلوميتري والمنعكس Nociceptive الانحناء

The concept of objective nociceptive assessment and optimal pain management have gained increasing attention. Despite the known negative short- and ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

الطباعة ثلاثية الأبعاد ليمثل شذوذاً الابهري المعقدة

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

تنقية الأنسجة المستندة إلى الوضوح لمنظمة الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد في قلوب الفئران الصحية والمصابة

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

تصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأوعية الدموية لوسادة القدم في نموذج غرغرينا Murine Hindlimb

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

علاج جذور الأسنان الموجه: التخطيط ثلاثي الأبعاد والتحضير بمساعدة القالب لتجاويف الوصول اللبية

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...