Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde K08 NS061039-01A2, o Programa de Neurologia Research &amp; Discovery e The Taubman Alfred A. Instituto de Pesquisa de Medicina da Universidade de Michigan. Este trabalho utilizou a Morfologia e Análise de Imagem Núcleo de Michigan Diabetes Centro de Pesquisa e Formação, financiado pelo National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais. Os autores gostariam de agradecer a Robinson Singleton e Gordon Smith (University of Utah) pela sua generosa doação de amostras de pele humana para apoiar o desenvolvimento inicial da técnica de imuno-histoquímica biomarcador nociceptiva.

Parte A: Imunohistoquímica Preparação de placa de 96 poços e prevenção de fundo de coloração Dentre as biópsias da pele são recolhidos a partir de sujeitos humanos e incubados durante 12-24 h em solução de fixação (2% de paraformaldeído com uma solução de L-lisina 0,75 M (pH 7,4) e 0,05 mM de periodato de sódio) a 4 ° C como descrito anteriormente 8. As amostras são então cryoprotected em tampão fosfato salino (PBS) com 20% de glicerol, a 4 ° C durante até 1 semana, incorporado nos meios de fixação da temperatura de corte óptima (OCT), e depois seccionado em secções de 50 um de espessura sobre um criostato. O protocolo abaixo descrito é concebido para oito cortes de pele, o número máximo possível de secções de pele de sofrer imunohistoquímica de flutuação livre em uma placa de 96 poços. DIA 1: 1. Prevenção da imunoreactividade não específica no estrato córneo <ol><li> Etiqueta de placa de 96 poços, como mostrado na Figura 1. </li&gt; <li> Adicionar 150 ul de Imagem-IT FX sinal (Imagem-IT), eficaz para o bloqueio de fundo de coloração 11,12, para cada poço na linha 1 da placa de 96 poços. </li><li> Adicionar 150 ul de PBS 1X para cada poço na fila 2 e 3 da placa de 96 poços. </li><li> Adquirir duas seções 50 mM por paciente: uma seção da biópsia tomado em DL, uma seção da biópsia tomada na PT. Uma ansa de inoculação (LeLoop) é usado para transferir a partir de secções de uma lavagem para a seguinte para evitar danos morfológica. Gentilmente transferir cada seção 50 mM, utilizando um loop inoculação, em um indivíduo bem de Linha 1, que contém a imagem-IT. Incubar seções em Imagem-lo por 30 minutos em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço plana. </li><li> Lavar duas vezes com secções 1X PBS (linhas 2 e 3) durante 10 min à TA. Coloque em um prato bem roqueiro plana entre lavagens. </li></ol> 2. Preparação de BSA a 5% da solução de bloqueio e 1% de solução de lavagem <ol><li> Enquanto as seções de biópsia estão incubando em Imagem-IT, prepare-se 5% de bloqueio soluçãoção (BSA, TX-100, 0,3% de solução 0,1 M de PBS-BSA a vórtice até que se dissolva completamente 5%). </li><li> Adicionar 150 ul de solução de bloqueio BSA a 5% em cada cavidade de linha 4. </li><li> Utilizando uma ansa de inoculação, transferir secções em poços individuais de 5% de solução de bloqueio de BSA. Incubar as secções em solução de bloqueio de BSA 5% durante 1-2 horas à temperatura ambiente em um balancim plana. </li></ol> 3. Preparação de 1% de BSA e da solução de lavagem a diluição dos anticorpos primários <ol><li> Embora as secções são incubar em 5% de solução de bloqueio de BSA, preparar uma solução de lavagem 1% (BSA a 1%, 0,3% de TX-100, solução de PBS-Vortex 0,1 M até que se dissolva completamente BSA). </li><li> Embora as secções são incubar em 5% de solução de bloqueio de BSA, dilui-se os anticorpos primários em 1% de solução de lavagem. <ol><li> Durante oito secções (8 x 150 mL = 1,200 mL) é necessário um total de 1200 ul. Os anticorpos primários são feitos em 1500 ul (cerca de 20% volume extra). </li><li> As diluições dos anticorpos primários: PGP, 1:500; Trk A,1:500 em BSA a 1% solução de lavagem. </li></ol></li></ol> 4. Incubação de biópsias seccionados em Anticorpo primário <ol><li> Adicionar 150 ul de anticorpos primários diluídos nas cavidades designadas da placa de 96 poços (linha 5). </li><li> Transferir secções de 5% de solução de bloqueio (linha 4) para os poços de anticorpos primários designados (Linha 5). </li><li> Selar a placa de 96 poços com parafilme e uma folha de alumínio para evitar a secagem e exposição à luz. </li><li> Incubar a placa de 96 poços de O / N a 4 ° C em um balancim plana. </li></ol> DIA 2: 5. Enxaguar biópsias em BSA a 1% solução de lavagem <ol><li> Adicionar 150 ul de solução de lavagem 1% de BSA para cada poço na linha 6, 7 e 8. </li><li> Enxaguar secções três vezes com solução de lavagem 1% de BSA (linhas 6, 7 e 8), durante 1 hora de cada vez, à TA. Cobrir a placa bem com papel alumínio e coloque no balancim plana entre lavagens. </li></ol> 6. A diluição dos anticorpos secundários &lt;ol&gt; <li> Embora as secções são incubadas no último enxaguamento de solução de lavagem 1% de BSA (linha 8), dilui-se em solução de anticorpos secundários de lavagem 1% de BSA: <ol><li> Durante oito secções (8 x 150 mL = 1,200 mL) é necessário um total de 1200 ul. Os anticorpos secundários são feitos em 1500 ul (cerca de 20% volume extra). </li><li> Diluições dos anticorpos secundários: para PGP (Alexa Fluor 488 burro anti-coelho, 1:250), para Trk A (Alexa Fluor 647 burro anti-cabra, 1:250) em solução de lavagem 1% BSA. </li></ol></li></ol> 7. Incubação de biópsias seccionados em Anticorpo secundário <ol><li> Adicionar 150 uL de anticorpos secundários diluídos nas suas cavidades designadas da placa de 96 poços (linha 9). </li><li> Transferir secções de solução a 1% de BSA de bloqueio (Linha 8) no poço de anticorpo secundário (linha 9). </li><li> Selar a placa de 96 poços com parafilme e uma folha de alumínio para evitar a secagem e exposição à luz. </li><li> Incubar seções no designado secundário anticorpos O/ N a 4 ° C em um balancim plana. </li></ol> 8. Enxaguar biópsias em BSA a 1% solução de lavagem <ol><li> Adicionar 150 ul de solução de lavagem 1% de BSA para cada poço na linha 10, 11 e 12. </li><li> Enxaguar secções três vezes com solução de lavagem 1% de BSA (linhas 10, 11 e 12) durante 1 hora de cada vez, à TA. Cobrir a placa bem com papel alumínio e coloque em uma cadeira de balanço plana entre lavagens. </li></ol> 9. Preparação de Lâminas de Microscopia e montagem Biopsias Seccionado <ol><li> Enquanto secções de biópsia estão incubando no último enxaguamento de solução de lavagem 1% de BSA (linha 12), preparam lâminas de microscópio. </li><li> Coloque 50 ml de solução a 1% de lavagem BSA em um slide de cada vez. </li><li> Remover secções de 1% de solução de lavagem de BSA (linha 12), e colocá-lo na gota 50 mL de solução de lavagem 1% de BSA na lâmina de microscópio designado. Após optimização da posição da secção, remover o excesso de solução de lavagem 1% de BSA com uma pipeta de vidro bulbed, tomando precauçõesevitar tocar o espécime. </li></ol> NOTA: Certifique-secção não é dobrado, a amostra deve ser plana contra a superfície da lâmina de microscópio. <ol start="4"><li> Coloque uma gota de reagente Prolongar montagem com DAPI perto da biópsia na lâmina de microscópio antifade Ouro. Dê uma lamela de vidro mm microscópio 22x22 e colocá-lo suavemente sobre a biópsia e uma gota de reagente Prolongar antifade ouro com DAPI queda. Repita a operação para cada seção. </li><li> Vamos lâminas de microscópio seca O / N em RT na escuridão. </li></ol> NOTA: Remova as bolhas de ar usando uma ponteira. Limpe o excesso de prolongar reagente antifade Ouro. Parte B: imagem confocal 10. Confocal <ol><li> Sinais de fluorescência de imagem usando uma Olympus FluoView 500 microscópio confocal de varredura a laser com óleo de imersão (1,3 NA) objetiva de 40X e zoom duas vezes com software versão 5.0 FluoView. </li&gt; <li> Use Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647 para excitar a 543 nm HeNe laser verde e 633 nm HeNe laser vermelho, respectivamente. O sinal Alexa Fluor 488 é representado por um olhar verde a tabela (LUT) e Alexa Fluor 647 por uma LUT vermelho. </li><li> Definir as aberturas confocais para cada detector a 400 um para melhorar os sinais. Varreduras seqüenciais devem ser tomados com uma resolução de 1024 x 1024 para maximizar a separação do sinal. </li><li> Capturar tridimensional z séries utilizando 1,2 mM intervalos z-passo (com base na unidade de digitalização óptima calculados pelo software FluoView) com média de Kalman (dois quadros). </li></ol> Parte C: visualização tridimensional e animação 11. Tridimensional (3D) Visualização e Animação <ol><li> Abrir arquivos FluoView em software x64 Imaris (versão 7.3, Bitplane AG) para visualizar os conjuntos de imagens 3D. </li><li> Ajustar o indicador conforme necessário para aumentar o contraste do sinal específico do nervo. </li><li> Criar um surface para visualizar o limite dermo-epidérmica. Use a ferramenta Contorno no modo de desenho para desenhar o contorno. </li><li> Atribuir uma superfície semi-transparente para o limite, a fim de ver os sinais fluorescentes subjacentes. </li><li> Capturar imagens estáticas dos sinais fluorescentes em 3D para criar imagens instantâneo do filme em 3D. </li><li> Use o recurso de animação para criar um filme em 3D. As imagens podem ser giradas em 360 graus várias vezes para mostrar cada sinal separadamente e intercalado (Figuras 2, 3 e 4). Definir animação para criar filmes que consistem em 200 quadros animaram a 15 quadros por segundo. Salve cada filme como um arquivo AVI cru. </li><li> Comprimir o final do filme AVI com o software VirtualDub (versão 1.9.4). </li></ol>

<ol>
	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies.">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li><li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor/p38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes.">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li><li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies.">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li><li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation.">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li><li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies.">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+among+pain,+sensory+loss,+and+small+nerve+fibers+in+diabetes.">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies.">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li><li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse a declarar.

Medição da IENFD tem sido amplamente utilizada para determinar o grau de neuropatias periféricas 13,14. Actualmente, o protocolo mais comumente utilizado apenas mede a densidade de fibras nervosas que penetram na membrana basal da epiderme, e não toma em consideração a ramificação axonal e / ou alterações morfológicas dos nervos. Além disso, a análise IENFD actual não foi mostrado para correlacionar IENFD com a presença de dor no PN 15. Nós relatamos ant...

Actualmente, é prática comum para os médicos para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) a partir de biópsias de punção da pele, que podem ser utilizados para diagnosticar neuropatias pequenas fibras 3, 6-8. As biópsias são tomadas a partir da perna distal (DL), de 10 cm acima do maléolo lateral, e a coxa proximal (PT), 20 cm abaixo da espinha ilíaca anterior 9. Todos IENF são rotulados usando o produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal pan 10-12. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada pela coloração PGP com brightfield microscopia 6. Além disso, vários grupos de pesquisa têm utilizaram protocolos de imunofluorescência para o PGP imunohistoquímica 7-9. Neuropatia fibra pequeno é comumente associado com dor neuropática. A fim de entender melhor o papel do IENF essencial para o processamento da dor, foi desenvolvida uma técnica para co-label IENF total, com fibras que geram dor. Nociceptiva IENF, especificamente Aδ e fibras C, pode ser estudada através da co-rotulagem de IENF com PGP e o marcador nociceptiva, tropomyosin-receptor-quinase A (Trk A) 5. Trk A é o receptor de elevada afinidade para o factor de crescimento do nervo, que é essencial para o desenvolvimento de nocicepção. As fibras nervosas nociceptivas A positivas Trk são fibras peptidérgicas que expressam a substância P (SP) e peptídeo relacionado com gene da calcitonina (CGRP). Anteriormente, Lauria e colegas aplicaram a técnica de dupla marcação para estudar PN, co-rotulagem IENF PGP positivo com um marcador nociceptivo 10. No nosso estudo anterior, foi demonstrado que IENF Trk A-positivos, mas não IENF Trk A-negativos, foram regulada positivamente num modelo animal de neuropatia diabética dolorosa 5. Esta técnica de co-rotulagem fornece a capacidade de comparar a quantificação de IENFD nociceptiva totalizar IENFD ea capacidade de estudar alterações morfológicas associadas à PN. A capacidade de visualizar nociceptiva IENF e compare quantificação de IENFD total IENFD nociceptiva poderia fornecer provas objectivas para a presença da dor, e possivelmente percepção da intensidade da dor associada com PN. Esta técnica é também aplicável para a pele de modelos animais. Em comparação com estudos anteriores, o protocolo actual descreve métodos para análise de imagem 3D, criando a possibilidade de evitar os erros que possam ocorrer na análise da imagem 2D.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

Uma biópsia da pele é geralmente utilizado para quantificar intraepidérmicos densidades de fibras nervosas (IENFD) para o diagnóstico de 1,2 polineuropatia periférica. Actualmente, é prática comum para recolher três milímetros biópsias de pele a partir da perna distal (DL) e na coxa proximal (PT) para a avaliação de polineuropatias comprimento dependentes 3. No entanto, devido à natureza de IENFs multidireccional, é um desafio para examinar sobreposição estruturas nervosas através da análise de imagem bidimensional (2D). Alternativamente, tridimensional de imagem (3D) poderia fornecer a melhor solução para este dilema. No relatório atual, apresentamos métodos para aplicar imagens em 3D para estudar neuropatia dolorosa (PN). A fim de identificar IENFs, amostras de pele são processadas para análise de imunofluorescência de produto do gene da proteína 9.5 (PGP), um marcador neuronal panela. Actualmente, é uma prática padrão para diagnosticar neuropatias fibra pequenos usando IENFD determinada por imuno-histoquímica PGP usando microscopia de campo claro 4. No presente estudo, aplicou-se análise de imunofluorescência dupla para identificar IENFD total, utilizando o PGP, e IENF nociceptiva, através da utilização de anticorpos que reconhecem a tropomiosina-receptor-quinase A (Trk A), o receptor de alta afinidade para o factor de crescimento do nervo 5. As vantagens do IENF co-coloração com PGP e Trk anticorpos se beneficia do estudo de PN através da coloração claramente fibras PGP-positivas, nociceptivos. Estes sinais de fluorescência pode ser quantificada para determinar as alterações morfológicas e IENFD nociceptivos do IENF associados PN. As imagens fluorescentes são obtidas por microscopia confocal e processadas para análise 3D. 3D-imaging fornece capacidades de rotação para analisar mais alterações morfológicas associadas à PN. Tomados em conjunto, co-coloração fluorescente, imagem confocal e análise 3D beneficiar claramente o estudo de PN.

Foi aplicado o protocolo atual para estudar a morfologia do IENF na PT e DL biópsias de pele de pacientes com PN. A pele, a partir de três indivíduos, foi recolhido da Universidade de Utah, para demonstrar a Pathomorphology associado PN. Os temas incluem: Caso 1: um homem de 51 anos com uma história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 14 meses; escore de dor: 51); Caso 2: um homem de 56 anos com uma história de PN de diabetes tipo 2 (duração: 108 meses; escore de dor: 47), e Caso 3: um homem de 66 anos de idade,...

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Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K visualizações.  University of Michigan. A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.