פרוטוקול מספק מודל פשוט להערכת תקינות סינפטית באופן תלוי גיל. אז אנחנו יכולים לחקור מחלות ניווניות ברקמות כי הם נוחים לניתוח מבני ותפקודי כאחד. טכניקה זו מקלה על שימור של רקמת עצבים ושרירים מן הצמתים neuromuscular שריר האורך הגבי.
כדי לחקור באופן מקיף את התפקוד הסינפטי לאורך זמן ורקמות שקשה לעבוד איתן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של מחלות ניווניות כולל ALS, פרקינסון, הנטינגטון ומחלת אלצהיימר. לפני תחילת הניתוח לחתוך כ 10 מילימטרים מהקצה של פיפטה 200 מיקרוליטר.
לאחר מתן ההרדמה, לשחק שישה עד 10 זבובים בצלחת פטרי שישה סנטימטר המכיל 70% אתנול ולהשתמש במברשת צבע ללגום בעדינות למזג כל זבוב. לאחר שעה עד שתי דקות, השתמש במטסים כדי להעביר זבוב אחד ברגליים או בכנפיים לצלחת ניתוח מצופה אלסטומר סיליקון המכילה שבעה עד 10 מיליליטר של PBS תחת מיקרוסקופ ניתוח. עם הזבוב שקוע PBS, להשתמש קהה Dumont מספר חמש למצוא מלקחיים כדי להסיר בזהירות את הכנפיים ולהשתמש משתרע על פני מספריים ניתוח קפיץ קצה ישר לעשות חתך קטן בצד הגחוני של קוטיקל כדי להסיר את הרגליים.
מחזיק את מספריים ניתוח ביד אחת מדפים קהה ביד השנייה, למקם את הצד הגחוני לטוס למעלה מחזיק את הדגימה במקום עם מאלץ, להסיר את הראש והבטן עם המספריים. השתמשו בצנרת של 200 מיקרוליטרים המוגדרת ל-40 מיקרוליטרים ובטיפ פיפיט שונה כדי לאסוף את התוראצ'ים ולהנחית את דגימות הרקמה המבודדות בצינור המסומן כראוי המכיל 900 מיקרוליטרים של PBS ו-150 מיקרוליטרים של 32% פורמלדהיד. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, השתמש פיפטה פסטר כדי להסיר את התיקון ולשטוף את plies שלוש פעמים עם 1.5 מיליליטר של PBS לכל לשטוף.
לפני תחילת הביסקטס דון קריו כפפות מגן ומשקפי בטיחות ולמלא בקבוק סיור עם חנקן נוזלי. השתמש מפסק להב לתפוס להב נוצה בזווית לכופף את הלהב כדי לשבור חתיכה קטנה. השתמש מפסק הלהב כדי לנעול את הלהב בעמדה ולהשתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי להסיר את כל PBS מצינורות מדגם.
השתמש פינצטה קריוגנית כדי להטביע את הצינורות בבקבוק של חנקן נוזלי. לאחר 10 שניות, השתמשו בפיפיאט פסטר כדי להוסיף כ-300 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח לכל צינור על קרח, והמקמו צד גחוני אחד גרוע של Axe בצלחת ניתוח מצופה אלסטומר סיליקון באורך 10 ס"מ המכילה PBS קר כקרח. השתמש זוג משעמם של מדפים כדי למקם את בית החזה ולמצוא זוג מדפים, כדי להסיר חלק מהגנגליה בית החזה לחשוף את קו האמצע של בית החזה.
באמצעות קו האמצע של בית החזה כמדריך, להשתמש במשחק כדי להפוך חתך רדוד דרך שליש בית החזה ולהשתמש מדפים קהה למקם את בית החזה בזווית של 45 מעלות. השתמש בלהב כדי לחתוך ישר את קו האמצע של בית החזה כדי להשיג שני hemithoraces ולעשות בזהירות אחד או שניים חתכים כדי להסיר את הרקמה העודפת מבלי לפגוע בשרירי האורך הגביים. ואז למקם את דגימות רקמת השריר לתוך צינור שכותרתו כראוי של PBS.
כאשר כל דגימות בית החזה כבר חציית permeabilize הרקמות במאגר חסימה לפחות שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מערבולת מוכנה טרי פתרון כתם מבני ולהוסיף 150 microliters של הכתם לכל מדגם עבור דגירה של שעתיים על מסובב בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר ויטראז'ים לשטוף את הדגימות PBST, ולמקום חמש תוויות חיזוק מוערמים לחתוך חצי 15 מילימטרים זה מזה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית אחת.
השתמש טיפ פיפטה מיקרו שונה כדי להעביר את Thoraces על כל שקופית ולהשתמש לנגב מעבדה כדי להסיר כל PBST עודף. השתמש במדפים כדי לארגן את הדגימות כך Thoraces פונים לצד השריר כלפי מעלה. כאשר הדגימות מכוונות כראוי, השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להחיל 70 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה על כל שקופית ולכסות כל שקופית עם פתק כיסוי.
לאחר מכן השתמש לק ציפורניים בנדיבות לצפות את הקצוות החיצוניים של החלקות הכיסוי כדי לקבל חותם שלם סביב כל רקמה. כדי להעריך את השלמות הסינפטית. צמתים neuromuscular יכול להיות מוכתם עם peroxidase חזרת ו Floe פח נוירונים מוטוריים בחלבון זפת מחייב של 43 כבשים Kilodalton יש מעט מאוד חזרת peroxidase מכתים על ידי יום 21, בעוד חלבון סוג הבר נשאר שלם.
אין הבדלים גלויים מכתמי שרירים נצפו. בנוסף לתיוג צומת neuromuscular שריר אורך הגב מבנית יכול גם לספק הערכה של שלמות סינפטית עם סמנים סינפטיים מראש ופוסט סינפטית. שים לב כי הקפאת הבזק חנקן נוזלי מקלה על bisection מוצלח כמו רקמה קפואה שאינה פלאש רגישה יותר לנזק במהלך הניתוח.
בעקבות הליך זה ניתן לנתח את דגימות השימור על ידי מיקרוסקופיה קונפוקל כדי למדוד היבטים ספציפיים של מבנה סינפטי.
