Esta investigación fue apoyada por subvenciones GM046406 (de DB) y por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales Centro de Biología Cuantitativa (GM071508). RSM reconoce el financiamiento de la Beca de Investigación de Postgrado NSF. MNM con el apoyo de una beca de Lewis-Sigler. Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Botstein útil para los debates y los miembros ex Allegra Petti y Nikolai Slavov por sus contribuciones al proyecto de ciclo metabólico. Damos las gracias a Daniel Zenklusen y Robert Singer para conseguir nosotros empezó con el método de FISH.

Las figuras 1 y 2 son diagramas esquemáticos de los procedimientos experimentales FISH y análisis de imagen de tuberías utilizada para la cuantificación FISH imágenes. 1. Soluciones de prepararse * Las soluciones a continuación son para uso con sondas Singer. Si el uso de sondas de Stellaris, sustitúyase &quot;40% de formamida&quot; por &quot;10% de formamida&quot; tanto en tampón de hibridación y la solución de lavado. Cambios adicionales en tampón de hibridación al utilizar sondas Stellaris son (1) añadir 1 g de sulfato de dextrano y (2) no incluyen 10 mg ssDNA. Tampón B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1 M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Buffer spheroplasting 890 l Tampón B 100 l VRC 10 l 25000 U / ml de liticasa 2 l β-mercaptoetanol &lt;fuerte&gt; tampón de hibridación (10 ml, volumen final) 10 mg E. coli tRNA 10 mg de DNA de cadena simple * 100 l 200 mM de stock VRC 40 l de 50 mg / ml de BSA 1 ml de SSC 20X 4 ml de formamida al 40% * Nucleasa libre de agua (hasta 10 ml de volumen final) 1 g de sulfato de dextrano * * Tampón de Hibridación puede mantenerse en alícuotas de 0,5 ml a -20 ° C para la conveniencia. Tampón de lavado (50 ml, volumen final) 5 ml de SSC 20X 20 ml de formamida al 40% * Nucleasa libre de agua (50 ml de volumen final) Etiquetado Buffer 1,06 g de carbonato sódico 100 ml de agua DEPC pH 9 2. Probe-etiquetado (sondas Singer solamente) Obtenemos estas sondas mediante síntesis en la casa usando un aparato de síntesis de oligonucleótidos ABI. Typicaliado, 4-5 ~ 50 bp oligonucleótidos son sintetizados que son homólogas al gen de interés, sustituyendo timidina amino-alilo durante varios thymidines espaciadas al menos 8, preferiblemente 10 + pb aparte. Debido a su sensibilidad al ozono, se trabaja en una instalación libre de ozono cuando se utilizan colorantes CY. <ol><li> Obtener ~ 5 sondas y resuspender en 100 l de agua - las concentraciones de verificación en Nanodrop. </li><li> Dependiendo del número de sondas / genes, combine total de 10 oligonucleótidos mg / gen (por ejemplo, si se 5 / sondas de genes, entonces quiero 2 mg / sonda). </li><li> Utilice columnas QIAquick para purificar sondas según QIAquick nucleótidos Protocolo kit de retiro. </li><li> Añadir 10 volúmenes de tampón de PN con el total de volumen de sondas combinadas y mezclar. </li><li> Aplicar la muestra a la columna QIAquick - si el volumen total es mayor que 750 l, girar hacia abajo dos veces utilizando la mitad del volumen en cada giro </li><li> Deje reposar durante 1 min. </li><li> Centrifugar 1 min a 6000 rpm. </li><li> Lavar con 750 l PE Buffer. </li><li> Centrifugar1 min a 6000 rpm. </li><li> Eliminar el flujo a través de la columna y re-giro durante 1 min a 13000 rpm para secar. </li><li> Columna QIAquick Place en tubo nuevo de microcentrífuga y el ADN se eluye con 50 l H 2 O - Asegúrese de H 2 O pH está dentro de 7,0 y 8,5 y se coloca directamente sobre la membrana. </li><li> Deje reposar durante 1 min. </li><li> Centrifugar durante 1 min a 13.000 rpm para eluir el ADN. </li><li> Liofilizar ADN a 45 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado en 10 l buffer de etiquetado y añadir al tubo de tinte sin tocar el tinte. </li><li> Repita con el otro buffer etiquetado 10 l. </li><li> Vortex y centrifugar tubos de tinte y ADN. </li><li> Cubra los tubos con papel de aluminio y guardar en la oscuridad a RT O / N para etiquetar. </li><li> Repita QIAquick nucleótidos Protocolo kit de retiro. Realizar con dos diferencias: - Añadir 200 l de tampón PN sondas y poner sondas marcadas a través de columnas de 2x. - Realizar 3 lavados con tampón PE con el fin de eliminar cualquier tinte no unido antes de la elución. </li><li> After elución obtener la concentración a través de nanogota. El etiquetado de eficiencia es típicamente ~ 0,25 pmol / ng de ADN de una sola hebra. </li></ol> 3. Coverslip Preparación <ol><li> Coloque los cubreobjetos en los portaobjetos en plasma-acicalarse cámara de vacío ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (cuanto más cerca del centro de la mejor). </li><li> Coloque la cámara de vacío en el microondas y asegúrese de que está sellado. </li><li> Encienda la bomba primero y luego gire en vacío de una sola vez de la bomba se pone en marcha. </li><li> Encienda el horno de microondas, y dejar 5 segundos después plasma es visible. </li><li> Apague la bomba de vacío a continuación. </li><li> Saque la cámara de vacío y retirar cubreobjetos con unas pinzas (aquellos que han caído necesita ser limpiado de nuevo). </li><li> Lugar cubreobjetos lado limpiado en placas de 12 pocillos. </li></ol> 4. Procedimiento Fijación <ol><li> Crecer levadura a un OD 600 de aproximadamente 0,1-0,2 en medio mínimo. 10 ml de células produce suficiente FOr ~ 10 hibridaciones separadas. </li><li> Añada 1/10 del volumen 37% de formaldehído directamente a los medios de cultivo (10 ml de cultivo + 1 ml de formaldehído al 37%) y dejar reposar durante 45 min. </li><li> Lavar 2x con hielo 1 ml de tampón B frío en un tubo de microcentrífuga (puede girar a 13.000 rpm durante 1 min). </li><li> Añadir 1 ml de tampón spheroplasting. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 15 min. Compruebe células cada pocos minutos bajo microscopio hasta la mayoría de las células son de color negro (es decir, no la eliminación brillante). </li><li> Lavar 2x con tampón enfriado con hielo B, girando a baja velocidad (~ 3500 rpm). </li><li> Añadir 1 ml de EtOH al 70%, resuspender suavemente y dejar toda la noche a 4 ° C (se puede almacenar indefinidamente a -20 ° C). </li></ol> 5. Procedimiento de hibridación <ol><li> Preparar la solución de hibridación: a 100 l de tampón de hibridación, agregue 1-3 l de la sonda, luego vortex y centrifugar. Cantante utilizan sondas 8-10 ng totales por sonda conjunto (es decir, por gen). Hemos fotografiado hasta 3 genes simultáneamente con 3 diferentessonda marcada rente fija. </li></ol> Asegúrese de calentar la solución de hibridación a temperatura ambiente antes de abrirlo. Para sondas Stellaris, se recomienda empezar 4 reacciones de hibridación independientes mediante la adición de 1 l cada uno de 1:10, 1:20, 1:50 y 1:100 diluciones de trabajo de las sondas para ver cuál es el óptimo. Diluciones de trabajo de sondas Stellaris se preparan en tampón de hibridación. <ol start="2"><li> Se centrifuga (para todos los pasos posteriores; 3.500 rpm, 5 min) las células fijadas (por ejemplo, 200 l) y aspirar lejos del etanol. </li><li> Resuspender suavemente en 1 ml de tampón de lavado que contiene el mismo porcentaje de formamida como el tampón de hibridación. Deje reposar durante 2-5 min. </li><li> Centrifugar la muestra y el tampón de lavado aspirado, a continuación, añadir solución de hibridación. Incubar en la oscuridad con agitación suave, O / N a 37 ° C. </li></ol> Nota: El siguiente procedimiento es para la aplicación de células / imagen en cubreobjetos. Para wincineración / células de formación de imágenes en placas de 96 pocillos, incluyendo el oxígeno solución de eliminador de especies reactivas alternativa ver <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Al día siguiente, o antes, limpio (ver procedimiento) y tratar cubreobjetos con 150 l 0,01% de poli-L-lisina durante 5 min. Aspirar, dejar secar, lavar 3 veces con H2O destilada y dejar secar. </li><li> En la mañana, añadir 1 ml de tampón de lavado a la muestra, resuspender suavemente, centrífuga y aspirar, a continuación, volver a suspender en otro 1 ml de tampón de lavado y se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar con 2 x SSC + 0,1% de Triton X-100 a TA 15 min en un agitador. </li><li> Tome medio de montaje fuera del congelador para permitir que suba a temperatura ambiente antes de montar. </li><li> Lavar con 1X SSC a TA 15 min en un agitador. </li><li> Diluir DAPI en PBS (0,1 mg / ml final) y volver a suspender las células en 150 l. </li><li> Solución Place a limpiar / poli-lys-treacubre-ted en placa de 12 pocillos, al menos 30 minutos sin ser molestados. </li><li> Retire la solución (es posible colocarlo en una hoja de cubierta de repuesto como copia de seguridad) y se lava 3 veces con 1 ml de 1X PBS. </li><li> Coloque 3 l de prolongar medio de montaje del oro en un portaobjetos (Invitrogen P36934). Para ello, uno a la vez si tiene varias hojas de la cubierta para evitar la desecación del medio de montaje. </li><li> Agregar ~ 0,5 ml de etanol al cubreobjetos en placas de 12 pocillos, retire la hoja de la cubierta y el aire seco, mientras que la celebración de unas pinzas. </li><li> Coloque cubrir deslizamiento celular del lado hacia abajo en medio de montaje y dejar endurecer varias horas o O / N en la oscuridad. </li><li> Selle los bordes con esmalte de uñas y proceder a la creación de imágenes. </li></ol> 6. Obtención de imágenes de células con Olympus IX-81 microscopio invertido general <ol><li> Para la adquisición de imágenes utilizamos software Slidebook (inteligente imaging.com) y un 1,45 NA, aceite objetivo TIRFM 100X. Para GFP serie, DAPI, Cy3, Cy5 y Cy3.5 imagen: conjuntos de filtros Chroma (ver reactivos). </li><li> Utilice el filtro de DAPIpara encontrar y centrarse células. </li><li> Establezca este como punto de referencia. </li><li> Tome un z-stack de imágenes alrededor del punto de referencia donde la distancia total es de 5 m con 0,2 mM tamaño (25 aviones). Repita el procedimiento para cada canal de colorante (es decir, cada sonda conjunto). </li><li> Exportar como TIFF de 16 bits para el análisis de imágenes. </li></ol> 7. Resumen Análisis de Imágenes (sondas Singer) A continuación ofrecemos un resumen de los métodos de cálculo que utilizamos para el análisis de imágenes de peces en MATLAB. Las funciones de MATLAB relevantes utilizadas están entre corchetes a la derecha. Los algoritmos y los umbrales están sintonizados para los datos de las sondas de estilo Singer. Uso de sondas de estilo Stellaris serán necesarios algunos ajustes, en particular a la etapa de filtración final (7,8). Identificación teléfono 15 <ol><li> Separar las células del fondo utilizando un umbral global sobre DAPI imágenes 16 [graythresh]. </li><li> Identificar núcleos mediante la función maxima extendida [imextendedmax]. </li><li> Células segmento utilizando núcleos como semillas para un algoritmo de cuenca [cuenca]. </li></ol> Encuentra puntos de interés en cada canal de fluorescencia <ol start="4"><li> Lleve a cabo la transformación tophat para normalizar fondo y mejorar la relación señal-ruido [bwmorph]. </li><li> Encontrar máximos para identificar la capa de enfoque (en el plano z) para cada punto de [imregionalmax]. </li><li> Filtrar lugares potenciales utilizando un modelo de ajuste lineal a un gradiente radial. </li></ol> Intensidad punto de medición y señales de la sonda mono contra poli filtro <ol start="7"><li> Ajustar un perfil gaussiano 2D al lugar en la capa de enfoque previamente identificados y la intensidad estimación 17. </li><li> Filtrar los puntos débiles utilizando un umbral (basado en histograma). Para sondas tipo Singer esto es importante, pero lo es menos para las sondas de Stellaris. </li><li> Contar puntos en cada celda. </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hasta la fecha, pescado ha sido sobre todo un método de bajo rendimiento. El uso de Cy3, Cy3.5, y Cy5 tintes limita el número de genes se puede investigar en células individuales para tres a la vez. Algunas sondas adicionales se han desarrollado (Stellaris), pero el número de sondas distinguibles se encuentra todavía en más de siete. Para evitar esta limitación, las estrategias de etiquetado combinatorias utilizando múltiples fluoróforos se han utilizado para crear códigos de barras para diferentes especies de ARNm 19,20. Más recientemente, Lubeck y Cai utilizan códigos de barras óptico y espectral para cuantificar 32 especies diferentes al mismo tiempo con los pescados en células de levadura individuales 19. Una limitación de este enfoque combinatorio reciente es que requiere el uso de super-resolución de la microscopía. El análisis necesario para distinguir las sondas de código de barras también es bastante complejo. Hemos encontrado que Cy3 y Cy3.5 son preferibles a Cy5 para experimentos de FISH. Una de las limitaciones del tinte Cy5 es su sensibilidada photobleaching. Sin embargo, Stellaris ha desarrollado recientemente Cy5 variantes que se anuncian como más resistentes a photobleaching, y puede aliviar este problema técnico. Es también digno de mención que el pescado es un método costoso de implementar y que tanto Singer y Stellaris sondas suelen costar $ 700 - $ 1,000 por sonda conjunto, aunque los precios de las sondas disponibles en el mercado deberían disminuir en el futuro. Ahorradores de reactivos y etiquetado eficientes trae sondas Singer hasta el rango más bajo en precio. Uno de los principales desafíos técnicos es la separación de los puntos de sonda única o múltiple, que requiere la aplicación de algoritmos de punto a indicar sofisticados. Esto puede tomar una amplia revisión manual para ajustar los parámetros de análisis de imágenes para instalaciones experimentales específicas. Un resumen de nuestra cartera de cálculo con funciones relevantes MATLAB se proporciona en la Sección 7 del protocolo. Este problema es un tanto aliviado por las sondas de Stellaris que sólo tienen<html> una etiqueta por sonda. Por lo tanto, requiere la colocalización de múltiples sondas para ver una señal. Dado que el pescado requiere la fijación de las células, que no facilita el seguimiento de las células individuales en el tiempo. Anteriormente, se utilizaron los datos de instantánea FISH para reconstruir la dinámica de la expresión de genes en las poblaciones de levadura ciclismo metabólicamente individuales 6. Ciclo metabólico se observa en la pre-hambrientos, cultivos continuos, y se caracteriza por oscilaciones colectivas en toda la población en el consumo de oxígeno. Estas oscilaciones se asocian con el genoma de las transcripciones oscilaciones que se producen por medio de todos los genes de levadura en las diferentes fases de consumo de oxígeno. Hemos tratado de determinar si el ciclismo metabólico estaba presente en cultivos de levaduras continuas sin sincronizar. Si está presente, las transcripciones que son anti-correlacionados en las poblaciones síncronos también deben ser anti-correlación en las células individuales no sincronizadas, y viceversa para transcripciones correlacionados. ent &quot;&gt; Para reconstruir dinámica de la producción de ARNm en el tiempo, los datos de la instantánea observados debe ser comparado con lo que se espera de un modelo del comportamiento subyacente. Existen limitaciones teóricas a que tales&quot; instantáneas &quot;de los datos de expresión de genes pueden ser utilizados para determinar la dinámica de expresión de genes subyacentes y que tipo de modelos se pueden distinguir 21. Para los datos de los ciclos metabólicos, en lugar de mostrar directamente la presencia de oscilaciones temporales, las mediciones estadísticas se llevaron a cabo para demostrar que efectivamente existe una celda programa oscilatoria autónoma consistente con mayor microarray mediciones.

Usando técnicas de medición a granel, no es posible ensayar el número de transcripciones o la actividad transcripcional dentro de las células individuales 1. Uso de proteínas fluorescentes conducidos por promotores de interés como reporteros de la expresión génica puede abordar este problema en cierta medida, pero el tiempo necesario para las proteínas fluorescentes para plegar oscurece la dinámica de los primeros. Proteínas fluorescentes de larga vida tampoco pueden reportar vidas ARNm. El método FISH se puede usar para ensayo de ARNm durante su ciclo de vida completo, desde la iniciación de la transcripción en el núcleo para la posterior maduración y la decadencia en las células individuales, con la resolución de una sola molécula. El original en experimentos in situ para la visualización de los ácidos nucleicos utilizados sondas de ARN radiomarcadas para sondear elementos de ADN. Estos incluyen la visualización de ADN ribosomal en los ovarios de la rana Xenopus laevis 2 y el ADN satélite en tejidos de ratón 3. La primera fluorescente in situ en experiment utiliza una molécula de ARN marcado con un fluoróforo a la sonda secuencias particulares de ADN 4. La primera aplicación de sondas fluorescentes para la visualización de ARN in situ era la visualización de la expresión del gen de actina de pollo en cultivo de tejido muscular 5. Más recientemente, en la levadura en ciernes, PEZ, se ha utilizado para investigar oscilaciones en la transcripción durante el ciclo metabólico de levadura 6, la descomposición de ARNm durante la progresión del ciclo celular 7, y la localización espacial de los transcritos de ARNm durante la mitosis 8. PECES se ha utilizado en la levadura para mostrar que las fluctuaciones no correlacionadas en forma constitutiva genes transcritos, que constituyen más de la mitad de todos los genes de la levadura, surgen de iniciación de la transcripción no correlacionado 9. En las especies distintas de la levadura, pescado ha sido utilizado para identificar marcadores de células madre en el intestino del ratón 10 y para determinar que la penetrancia incompleta de destinos celulares puede resultar de genes estocásticos fluctuaciones de expresión en C.Elegans embriones 11. El método descrito aquí PESCADO funciona mediante la hibridación de marcado tinte, sondas de ADN de cadena sencilla a ARNm mensajes. Las células se obtuvieron imágenes y los ARNm se cuentan usando un algoritmo de punto de detección. Sondas de cadena simple pueden ser generados con un sintetizador de ADN y marcaron a continuación (se hace referencia aquí como sondas Singer) o ordenados comercialmente como sondas de pre-marcados (sondas Stellaris) 12,13. Una diferencia importante entre el cantante y Stellaris sondas es que las sondas de Singer son más largas (~ 50 pb) y son multi-etiquetados, mientras que las sondas Stellaris son cortos (~ 20 pb) con sólo una etiqueta por sonda, como se describe por Raj et al 14. Además, el enfoque Stellaris utiliza muchos más sondas de genes que el de Singer (~ 30 frente a 5 sondas por gen, respectivamente). A continuación se proporciona un protocolo que describe el uso de cualquier tipo de sonda. En la sección 2, se proporciona un protocolo para etiquetar amino-alilo sondas timidina que contienen wi-ésimo un colorante Cy elegido. Una visión general de los pasos de cálculo necesarios para identificar los puntos individuales de ARNm se proporciona en la Sección 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

La hibridación in situ fluorescente (FISH) método permite detectar los ácidos nucleicos en el medio ambiente celular nativo. Aquí se proporciona un protocolo para el uso de FISH para cuantificar el número de ARNm en las células individuales de levadura. Las células pueden ser cultivadas en cualquier condición de interés y después se fijaron y hacen permeables. Posteriormente, múltiples desoxioligonucleótidos monocatenario conjugados con tintes fluorescentes se utilizan para etiquetar y visualizar los ARNm. Fluorescencia de difracción limitada de las moléculas de ARNm individuales se cuantifica usando un algoritmo de punto de detección para identificar y contar el número de ARNm por célula. Mientras que los métodos de cuantificación más estándar de transferencias Northern, RT-PCR y microarrays de expresión génica proporcionan información sobre los ARNm promedio en la población mayor, PEZ, facilita tanto el recuento y localización de estos ARNm en las células individuales a una resolución de una sola molécula.

La Figura 3 muestra histogramas típicos calculados a partir de FISH imágenes y se utiliza para determinar el número de los ARNm presentes en las células individuales. Una ventaja importante de la microscopía basado en la cuantificación del ARN es que se puede obtener información sobre la localización de las transcripciones. Por ejemplo, hemos utilizado FISH para identificar ARNm en células individuales con una inducible CBF1 alelo (Figura 4). Debido a que muchas moléculas de ARNm están presentes en el sitio de la transcripción, que son capaces de identificar la presencia y ubicación de los sitios de transcripción dentro del núcleo. Mediante la utilización de diferentes colorantes para ARNm de etiquetas de diferentes genes, uno puede cuantificar múltiples especies de ARNm en las mismas células. Para demostrar esto, las células de levadura se incubaron en presencia de α-factor de y sorbitol. FUS1 transcripción (Quasar670 colorante, rojo) es inducida por α-factor. Transcripción STL1 (Quasar 570 tinte, verde) es inducido por el aumento de la osmolaridad extracelular ( <strong&gt; Figura 5). Figura 4 es un ejemplo de FISH con las sondas Singer. Figura 5 es un ejemplo de FISH con las sondas de Stellaris. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema del procedimiento experimental FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de la tubería de análisis de imagen. Los puntos finales se determinan en la figura más a la derecha. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figura 3. Histograma de las intensidades de terreno para un gen particular, utilizando sondas Singer </strong&gt;. Intensidad de la sonda se computan tanto las células externas (azul) en el interior (rojo) y. Puntos de baja intensidad son o ruido o sondas individuales. Mensajes ARNm reales se etiquetan con múltiples sondas. Al utilizar las sondas Stellaris, sondas individuales son menos detectables y por lo tanto los umbrales y los filtros se deben ajustar en consecuencia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> La Figura 4. Los resultados representativos de procedimiento PESCADO cantante. En este experimento, la transcripción CBF1 se activa con un promotor inducible 18. Los núcleos se tiñen de azul con DAPI. MRNAs CBF1 etiquetados con Cy3-etiquetados sondas. Las flechas blancas destacan la presencia de CBF1 sitios de transcripción en el núcleo. Transcripciones de ARNm individuales son visibles en el citoplasma. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figura 5. Los resultados representativos de procedimiento PESCADO Stellaris. Células de levadura Mata fueron expuestos simultáneamente a 30 ng / ml de factor de α-y 0,75 M de sorbitol durante 10 min y se probaron simultáneamente para FUS1 (Quasar 670, rojo) y STL1 (Quasar 570, verde) transcripciones. En el cuadro resaltado, podemos ver una célula de responder sólo a la feromona (FUS1 sitio de inicio, rojo) y la otra predominantemente responder al sorbitol (sitio de inicio de STL1, verde).

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Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la realización de fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el recuento de ARNm en células individuales con una resolución de una sola molécula.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.6K vistas.  Princeton University. Este protocolo describe un procedimiento experimental para la realización de fluorescencia In situ La hibridación (FISH) para el recuento de ARNm en células individuales con una resolución de una sola molécula.

Video: Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Investigación

Biología

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Methods Article

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia