この研究は、助成金GM046406（DB）にすることによってと定量生物学のための一般的な医学センター（GM071508）の国立研究所によってサポートされていました。 RSMはNSF大学院研究フェローシップからの資金調達を認めるものです。 MNMはルイススカラフェローシップでサポートされています。我々は代謝サイクルプロジェクトへの貢献のために有用な議論と元メンバーアレグラのPettiとニコライSlavovためBotstein研究室のメンバーに感謝したい。私たちは、私たちはFISH法を開始するためのダニエルZenklusenとロバート·シンガーに感謝します。

図1および図2は、FISHの実験手順とFISH像を定量化するために用いられる画像解析パイプラインの概略図である。 1。準備するためのソリューション以下*ソリューションは歌手プローブで使用するためのものです。ステラリスプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄バッファーの両方で、 &quot;10％ホルムアミド&quot;と &quot;40％ホルムアミド&quot;を交換してください。ステラリスプローブを用いたハイブリダイゼーションバッファーに追加の変更（1）1グラムデキストラン硫酸を追加している、（2）10mgを一本鎖DNAを含んでいません。 バッファーB 8ミリリットル1 M KH 2 PO 4 41.5ミリリットル1M K 2 HPO 4 ソルビトール109.3グラム Spheroplastingバッファ 890μlのBuffer B 100μlのVRC 10μlの25,000 U / mlのリチカーゼ 2μlのβ-メルカプトエタノール &lt;strong&gt;のハイブリダイゼーション緩衝液（10ミリリットル、最終容量） 10 mgのE.大腸菌のtRNA 10mgを一本鎖DNA * 100μlの200mMのVRCの株式 50 mg / mlのBSA40μlの 1ミリリットル20X SSC 4ミリリットル40％ホルムアミド* ヌクレアーゼフリー水（10mlの最終体積まで） 1グラムデキストラン硫酸* *ハイブリダイゼーション緩衝液は、便宜上-20℃で0.5ミリリットルのアリコートに維持することができる。 （50ミリリットル、最終容量）バッファを洗う 5ミリリットル20X SSC 20ミリリットル40％ホルムアミド* ヌクレアーゼフリー水（50mL最終容量） ラベルバッファ 1.06グラムの炭酸ナトリウム 100ミリリットルDEPC水 pHが9 2。プローブ標識（歌手プローブのみ） 私たちは、ABIのオリゴヌクレオチド合成装置を用いて社内の合成によってこれらのプローブを得る。 Typic同盟国は、4-5〜50塩基対のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも10 8、+ BP離隔いくつチミジン用アミノアリルチミジンを代入し、目的の遺伝子と相同であることを合成される。 CY染料を使用している場合があるためオゾンに対する感受性のため、私たちは、オゾンフリーの施設で働いています。 <ol><li> 〜5プローブを取得し、100μlの水に懸濁し - ナノドロップのチェック濃度。 </li><li>どのように多くのプローブ/遺伝子に応じて、10μgのオリゴヌクレオチド/遺伝子（ 例えば 5プローブ/遺伝子を持っている場合は、2μgの/プローブしたい）との合計配合しています。 </li><li> QIAクイックヌクレオチド除去キットプロトコルに従ってプローブを精製するQIAクイック列を使用します。 </li><li>複合プローブとミックスの総容積に10倍量のバッファーPNを追加します。 </li><li> QIAクイックカラムにサンプルを適用 - 総容積は、2回のスピンでボリュームの半分を使用してスピンダウンし、750μlのよりも大きい場合</li><li> 1分間放置。 </li><li> 6,000 rpmで1分間遠心します。 </li><li> 750μlのBuffer PEで洗浄。 </li><li>遠心6,000 rpmで1分。 </li><li>乾燥するために13,000 rpmで1分間フロースルーと再スピンカラムを廃棄してください。 </li><li> H 2 OのpHは7.0〜8.5の範囲内であると、膜上に直接配置されていることを確認します-新しいマイクロチューブ及び50μlのH 2 Oで溶出したDNAに置きQIAクイック列。 </li><li> 1分間放置。 </li><li> DNAを溶出するために13,000 rpmで1分間遠心します。 </li><li> 45℃でDNAを凍結乾燥</li><li> 10μlのラベルバッファ内のペレットを再懸濁しと染料に触れることなく、染料のチューブに加える。 </li><li>別の10μlのラベルバッファーで繰り返します。 </li><li>ボルテックスと色素とDNAのチューブをスピンダウン。 </li><li>アルミホイルでチューブをカバーし、ラベルにRT O / N暗所で保管してください。 </li><li> QIAクイックヌクレオチド除去キットプロトコルを繰り返します。 2つの違いを実行します。 - プローブに200μlのPNバッファを追加して、2倍のカラムを通して標識プローブを置く。 - 溶出前にアタッチされていない染料を洗い流すために、バッファPEで3回洗浄を行います。 </li><li> AFター溶出光度計を経由して濃度を得る。標識効率は、典型的には一本鎖DNAの約0.25ピコモル/ NGである。 </li></ol> 3。カバースリップの準備<ol><li>プラズマpreen、修復真空室（内スライドの上に置いてカバースリップ<a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ）（良い中心に近い）。 </li><li>電子レンジで真空チャンバーを入れて、それが密閉されていることを確認します。 </li><li>ポンプの電源をオンには、まず、ポンプが起動され、一度だけ真空をオンにします。 </li><li>電子レンジの電源をオンにして、プラズマが表示されている後5秒停止。 </li><li>その後、ポンプを真空の電源をオフにします。 </li><li>真空チャンバーを引き出し、鉗子（再び洗浄する必要が下落しているもの）でカバースリップを削除します。 </li><li>場所カバースリップは、12ウェルプレートで側をクリーンアップ。 </li></ol> 4。固定手順<ol><li>最少培地に0.1〜0.2程度のOD 600に酵母を育てる。細胞の10mlを十分にFOを生成R〜10別ハイブリダイゼーション。 </li><li>増殖培地（培養10mlの+ 1ミリリットル37％ホルムアルデヒド）に直接1/10の容積37％ホルムアルデヒドを追加し、45分間放置します。 </li><li>マイクロ遠心チューブ（1分間13,000 rpmで回転することができます）で、1mlの氷冷緩衝液Bで2倍洗う。 </li><li> spheroplasting緩衝液1mlを加える。 </li><li> 15分間37℃でインキュベートする。ほとんどの細胞（ すなわち位相明るくない）黒になるまで細胞を顕微鏡下で数分ごとにチェックしてください。 </li><li>低速（〜3,500 rpm）で回転し、氷冷緩衝液Bで2倍洗う。 </li><li> 、70％エタノール1 mlを加え穏やかに再懸濁します（-20℃で無期限に保存することができます）4℃で一晩おきます。 </li></ol> 5。ハイブリダイゼーションの手順<ol><li>ハイブリダイゼーション溶液を準備します。ハイブリダイゼーション緩衝液を100μlに、プローブの1-3μlを添加し、その後ボルテックスと遠心。歌手プローブはプローブセット当たり8-10 ngの合計（ つまり当たり遺伝子）を使用します。我々は3 DIFと同時に3遺伝子にまでイメージしていますferent標識プローブセット。 </li></ol>それを開く前に室温にハイブリダイゼーション溶液を温めるようにしてください。 ステラリスプローブの場合、それは1が最適であるかを確認するためのプローブの希釈作業1:10 1:20 1:50 1:1001μlのそれぞれを追加することで、4つの別々のハイブリダイゼーション反応を開始することをお勧めします。ステラプローブの作業希釈物をハイブリダイゼーション緩衝液中で調製される。 <ol start="2"><li>遠心分離機（後続のすべてのステップのために、3,500 rpmで、5分）で固定した細胞（ 例えば 200μl）を、エタノールを取り除く吸引。 </li><li>穏やかにハイブリダイゼーション緩衝液と同じ割合ホルムアミドを含有する、1mlの洗浄緩衝液中で再懸濁する。 2-5分間放置。 </li><li>サンプルを遠心分離し、洗浄緩衝液を吸引し、ハイブリダイゼーション溶液を追加します。穏やかに振盪し、37℃でO / N°Cで、暗所でインキュベート</li></ol>注：次の手順では、カバーガラス上の細胞を適用/イメージングのためのものです。のw代替の活性酸素種のスカベンジャー溶液が見含む96ウェルプレートに細胞をアッシング/イメージング<a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocolsた。</a> <ol start="5"><li>翌日、 又は予め 、クリーン（手順を参照）と5分間、150μlの0.01％ポリ-L-リシンでカバースリップを扱う。吸引、のdH 2 Oで3回洗浄し、乾燥させ、乾燥させます。 </li><li>午前中は、サンプルに洗浄緩衝液1mlを加え軽く懸濁し、遠心分離や吸引、その後30分間37℃で洗浄バッファーとインキュベートの別1mlに再懸濁します。 </li><li>シェーカー上でRT 15分で2X SSC + 0.1％トリトンX-100で洗浄する。 </li><li>それをマウントする前にRTに考え出すことができるように冷凍庫の封入剤を取り出します。 </li><li>シェーカー上でRT 15分で1X SSCで洗浄する。 </li><li> 150μlのPBSにDAPI（最終は0.1μg/ ml）を再懸濁し、細胞を希釈する。 </li><li>洗浄/ポリのLys-トリートメントルーム、ドラッグプレースソリューション12ウェルプレートでのテッドカバースリップ、邪魔されずに少なくとも30分間。 </li><li>溶液を除去します（バックアップとして予備のカバースリップの上に置くことがあります）し、1ml 1X PBSで3回洗浄する。 </li><li>スライド上にゴールドマウンティング培地を延長の代わりに3液（インビトロジェンP36934）。あなたはメディアをマウントするの乾燥を避けるため、複数のカバースリップを持っている場合に、随時、このいずれかを実行します。 </li><li>ピンセットで保持しながら、12ウェルプレートにカバースリップに〜0.5ミリリットルのエタノールを加え、乾燥したカバースリップと空気を除去する。 </li><li>メディアをマウントするにスリップ細胞側を下にカバーし、暗闇の中で硬化する数時間またはO / Nを聞かせて置きます。 </li><li>マニキュアとの縁をシールし、イメージングに進みます。 </li></ol> 6。オリンパスIX-81倒立顕微鏡の概要を有する細胞のイメージング<ol><li>画像取得のために我々はSlidebook（インテリジェントimaging.com）ソフトウェアや100X、1.45 NA、TIRFM油目標を利用しています。クロマフィルターセット（試薬を参照）：シリアルGFP、DAPI、Cy3で、Cy3.5およびCy5イメージングのため。 </li><li> DAPIフィルタを使用細胞を見つけ、集中する。 </li><li>基準点としてこれを設定してください。 </li><li>総距離は0.2μMサイズ（25面）で5μMである基準点の周りの画像のzスタックを取る。各色素チャネル（ すなわち 、各プローブセット）について、この手順を繰り返します。 </li><li>画像解析のための16ビットのTIFFとしてエクスポートします。 </li></ol> 7。画像解析の概要（歌手プローブ） 以下我々はMATLABでFISH画像を分析するために使う計算手法の概要を提供します。使用され、関連するMATLAB関数は右側に囲まれている。アルゴリズムとしきい値は現在シンガースタイルのプローブからのデータのために調整されています。ステラリススタイルのプローブを使用すると、特に最後のフィルタリングステップ（7.8）にはいくつかの調整が必要となります。 セル識別15 <ol><li> DAPIの画像16上のグローバルしきい値を使用してバックグラウンドから別々のセル[graythresh]。 </li><li>拡張された最大値関数[IMを使って核を識別extendedmax]。 </li><li>流域アルゴリズムシードとして核を使用してセグメント細胞[分水嶺]。 </li></ol>各蛍光チャネルでスポットを検索<ol start="4"><li>背景を正規化し、信号対雑音比を向上させるためにトップハット変換を実行する[bwmorph]。 </li><li>各スポットのために合焦層（z平面上の）を識別するための最大値を見つける[imregionalmax]。 </li><li>放射状グラデーションの線形近似モデルを用いて、潜在的なスポットをフィルタリングします。 </li></ol>スポット強度とフィルタシングル対複数のプローブ信号を測定<ol start="7"><li>以前に同定された合焦層と推定強度17のスポットに2Dガウシアンプロファイルを合わせる。 </li><li>しきい値（ヒストグラムに基づいて）を使用して、弱点を除外。歌手型プローブでは、これは重要ですが、ステラのプローブに少ないそうです。 </li><li>各セル内のスポットを数える。 </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells.">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912 (1970).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate.">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li><li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast.">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated.">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li><li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine.">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li><li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係はありません宣言。

現在までに、魚は主に低スループット方法であった。 Cy3での使用、Cy3.5、およびCy5色素は1つが一度に3への単一細胞で調べることができた遺伝子の数を制限します。いくつかの追加のプローブが開発された（ステラリス）は区別プローブの数は、ほとんど7にまだあるされています。この制限を回避するために、複数の蛍光色素を用いたコンビナトリアル標識戦略は、異なるmRNA種19,20のバーコードを作成するために使用されてきた。最近では、リューベックとカイは、単一の酵母細胞19の魚と同時に32の異なる種を定量化するために、光とスペクトルバーコーディングを使用していました。この最近のコンビナトリアル手法の一つの制限は、それが超解像顕微鏡法を使用する必要がある。バーコードプローブを区別するために必要な分析も非常に複雑である。 我々は、Cy3標識およびCy3.5がFISH実験のCy5のに好適であることを見出した。 Cy5の色素の制限の1つは、その感度である退色する。しかし、ステラリスは最近、退色に対してより耐性としてアドバタイズされCy5の亜種を開発し、この技術的な問題を軽減することがあります。市販のプローブの価格が将来的に減少するべきであるが、プローブセットにつき$ 1,000 - それはまた、その魚を注目に値する実装するための高価な方法であり、シンガーとステラリス両プローブは通常、700 $の費用がかかること。試薬および効率的なラベルの温存と、価格の低い範囲まで歌手プローブをもたらします。 主要な技術課題の一つは、洗練されたスポットを決定するアルゴリズムの実装を必要とする単一対複数のプローブスポットの分離である。これは、具体的な実験のセットアップのための画像解析パラメータを調整するために大規模なマニュアルの見直しを取ることができます。関連するMATLAB関数との計算パイプラインの概要をプロトコルのセクション7で提供されています。この問題は多少しかないステラプローブによって軽減される<html>プローブごとにラベル。したがって、複数のプローブの局在が信号を参照する必要があります。 FISHは、固定細胞を必要とするので、時間をかけて個々の細胞を追跡を容易にしない。先に、我々は、6個々の代謝サイクル酵母集団における遺伝子発現の動態を再構築するためにFISHのスナップショットデータを用いる。代謝サイクルは、プレ飢え、連続培養物に​​おいて観察されており、酸素消費の人口集団全体の振動によって特徴付けられる。これらの振動は、酸素消費量の異なる段階において、すべての酵母遺伝子の半分を発生する転写物のゲノムワイドな振動と関連している。我々は代謝サイクリング非同期連続酵母培養中に存在していたかどうかを判断しようとした。存在する場合、同期集団で反相関している転写産物はまた、非同期単一細胞、および相関転写産物のためにその逆に反相関されるべきである。 耳鼻咽喉科 &quot;&gt;即座にmRNAの生産の動態を再構築するためには、観測されたスナップショットデータは基礎となる行動のモデルから期待されるものと比較しなければならない。そのようなときに理論的な制限があり、&quot;遺伝子発現データのスナップショット &quot;を決定するために用いることができる基礎となる遺伝子発現動態かつモデルの種類21を区別することができる。代謝周期データではなく、直接的に時間的な振動の存在を示すために、統計測定は、バルクマイクロアレイと一致して細胞自律的振動プログラムが実際に存在することを実証するために実施された測定。

バルク測定技術を用いて、単一の細胞内アッセイ転写物又は転写活性の数を1に不可能である。ある程度まで、この問題に対処することができる遺伝子発現の記者として関心のあるプロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を使用したが、折り蛍光タンパク質に要する時間が早いダイナミクスを不明瞭。長命の蛍光タンパク質はまた、mRNAの寿命を報告することはできません。 FISH法は単一分子分解能で、核内の転写開始から単一細胞内の後続の成熟および減衰に、その完全なライフサイクルの間に測定mRNAに使用することができる。 核酸を可視化するための現場実験の元は、DNAの要素を調べるために放射性標識RNAプローブを使用していました。これらはカエルアフリカツメガエル2及びマウス組織3でサテライトDNAの卵巣でリボソームDNAを可視化が含まれています。 現場 exper における第1の蛍光imentは、特定のDNA配列4を調べるために蛍光体が付いているRNA分子を使用していました。 in situで RNAを可視化するための蛍光プローブの最初のアプリケーションは、ニワトリ筋肉組織培養5におけるアクチン遺伝子発現の可視化であった。最近では、出芽酵母において、FISHは、酵母代謝サイクル6、細胞周期の進行7、および有糸分裂の間に8 mRNA転写物の空間的局在の間のmRNAの減衰の間に転写振動を調査するために使用されている。 FISHは、すべての酵母遺伝子の半分以上を構成する構成的に転写された遺伝子で無相関変動は、無相関転写開始9から生じることを示すために、酵母において使用されている。非酵母種において、FISHは、マウスの腸10における幹細胞のマーカーを同定し、細胞運命の不完全な浸透度を決定するために使用されているC.における確率遺伝子発現の変動に起因することができ虫の胚11。 ここで説明したFISH法は、メッセージをmRNAに色素標識、一本鎖DNAプローブをハイブリダイズすることによって動作する。細胞は、画像化され、mRNAはスポット検出アルゴリズムを使用してカウントされます。一本鎖プローブはDNA合成機を用いて生成した後、ラベル（歌手プローブとしてここと呼ばれる）またはプレ標識プローブ（ステラリスプローブ）12,13として商業的に発注することができる。シンガーとステラリスプローブ間の主な違いは、ステラリスプローブようラジらによって記載プローブごとに1つだけのラベルを持つ（〜20 bpの）短いながら歌手プローブが長い（〜50塩基対）とマルチラベルが付いていますということです14。さらに、ステラリスアプローチはシンガー（それぞれ1遺伝子あたり〜30対5プローブ）のそれよりも遺伝子あたりより多くのプローブを使用しています。以下では、プローブのいずれかのタイプの使用について説明プロトコルを提供する。第2節では、アミノアリルチミジン含有プローブワット標識するためのプロトコルを提供選択したCyの染料i番目。単一のmRNAスポットを識別するために必要な計算ステップの概要は、セクション7に設けられている。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

in situハイブリダイゼーション（FISH）法における蛍光は1つが、ネイティブの細胞環境中の核酸を検出することができます。ここでは、単一の酵母細胞内のmRNAの数を定量化するためにFISHを使用するためのプロトコルを提供する。細胞は、関心のある任意の条件で増殖させ、次いで固定し、透過性にすることができる。その後、蛍光色素に結合した複数の一本鎖のデオキシオリゴヌクレオチドは、mRNAをラベルし、可視化するために使用されています。単一のmRNA分子からの回折限界の蛍光は細胞あたりのmRNAの数を識別し、カウントするスポット検出アルゴリズムを使用して定量した。ノーザンブロット、RT-PCRおよび遺伝子発現マイクロアレイのより標準的な定量法は、バルク集団における平均のmRNAの情報を提供しながら、魚は単一分子分解能で単一細胞内の計数およびこれらのmRNAの局在の両方を容易にします。

図3は、FISH画像から計算され、単一細胞中に存在するmRNAの数を決定するために使用される典型的なヒストグラムを示している。顕微鏡ベースのRNA定量の重要な利点は、一つは転写産物の局在に関する情報を得ることができるということです。例えば、私たちは誘導CBF1対立遺伝子（ 図4）を用いて、単一細胞内のmRNAを同定するためにFISHを使用していました。多くのmRNA分子は、転写部位に存在するため、我々は核内で転写部位の存在および位置を識別することができる。 異なる遺伝子のmRNAを標識するために異なる色素を利用することによって、人は、同じセル内の複数のmRNA種を定量化することができる。これを示すために、酵母細胞を、α-因子及びソルビトールの存在下でインキュベートした。 FUS1転写（Quasar670色素、赤）α-因子によって誘導される。 STL1転写（570クエーサー染料、緑色）は、細胞外浸透圧の増加により誘導される（ <stronG&gt;図5） 図4は、歌手プローブによるFISHの一例です。 図5のStellarisプローブによるFISHの一例です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> 図1。 FISH実験手順の概略は <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> 図2。画像解析パイプラインの概略図 。最終的なスポットは、右端の図に決定されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> 図3。歌手プローブを使用して特定の遺伝子のスポット強度のヒストグラム </strong&gt;。プローブ強度は、内側（赤）と外側（青）セルの両方が計算される。低強度のスポットは、ノイズまたは単一プローブのいずれかです。実数のmRNAメッセージは、複数のプローブで標識される。ステラリスプローブを使用する場合は、1つのプローブは、しきい値とフィルタリングがそれに応じて調整しなければならないので、より少ない検出可能とされています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> 図4。歌手FISH手順の代表的な結果 。この実験では、CBF1転写が誘導性プロモーター18で活性化される。核はDAPI、青色染色する。CBF1のmRNAをCy3標識プローブでタグ付けされています。白矢印は核内CBF1転写部位の存在を強調する。単一のmRNA転写産物は、細胞質に表示されます。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> 図5。ステラリスFISH手順の代表的な結果 。マタ酵母細胞は、同時に30 ngの/ mlのα-因子で10分間、ソルビトール113 Mにさらされ、同時にFUS1（670クエーサー、赤）とSTL1（570クエーサー、緑）転写産物をプローブした。ハイライトボックスで、私たちは、一つのセルがフェロモンだけに応答する（FUS1開始部位、赤）と別の主（緑、STL1開始部位）ソルビトールへの対応を見ることができます。

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明<em&gt;その場で</em単一分子の解像度で単一細胞中のmRNAを計数する&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）。

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.6K ビュー.  Princeton University. このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明その場でハイブリダイゼーション（FISH）。

ビデオ: Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

生物学

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).