המחברים מודים לחברים בעבר ובהווה של המעבדות שלנו שעזרו לפתח את הטכניקות הללו. מימון חלקי שנמסר לי DE על ידי מענק ממכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית / CIRM (RN1-00538).

1. דג הזברה בעלי, דור עובר, וטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל פרוטוקולי דג הזברה הבאים תחת הדרכתו של ועדה מוסדית טיפול בבעלי החיים ושימוש (IACUC) ובמסגרת הנחיות טיפול בבעלי חיים של NIH או גופים / הנחיות רגולטוריות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זני דג הזברה שמבטאים חלבוני ניאון ברקמות ספציפיות, תאים או איברים זמינים ממרכז המשאבים הבינלאומי דג הזברה (Zirc). לדוגמא, Tg (KDR: EGPF) s843 להביע EGFP בתאי אנדותל כלי דם 6, אשר יכול לשמש לייצור מבני כלי דם 3D מלאים כפי שמוצג בפרוטוקול זה. קווים אחרים של דג הזברה מהונדס זמינים Zirc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה מבוגר בית במערכת חקלאות ימית מתאימה המנטרת את רמת חומציות, מליחות, טמפרטורה, חמצן מומס, אור, וגורמים סביבתיים אחרים 7. דג הזברה מוצגת כאן שוכנו במערכת Aquaneering Inc (סן דייגו, קליפורניה) בשעה 28.5 ° C עם lig 14 שעהמחזור כהה ht/10 שעה. להאכיל את דג הזברה מבוגר דיאטה מאוזנת של ארטמיה ומזון NRD 4/6 דגים (ארטמיה ישירה, אוגדן, יוטה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכר בוגר ודג זברת נקבה בגיל פוריות צריך להיות שוכנו בנפרד כדי להגדיל מוצלח הזדווגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר הטלת ביצים והפריה על ידי הצבת נקבות (2-4) וגברים (4-6) יחד במכל הזדווגות שיש לו תחתית רשת עם חורים גדולים מספיק לביצים ליפול דרך, אבל קטן מדי עבור המבוגרים דג הזברה לעבור . הגדרת הזדווגויות הערב לפני; ביצים מוטלות ליד שחר, בדרך כלל בזמן מחזור שעות היום האור מגביר לאט בעצימות (שחר). בדוק עבור ביצים בחלק התחתון של מיכל ההזדווגות כל 15-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ביצים באמצעות מסננת רשת ונקיה עם חיץ E3 (5 mM NaCl, 0.17 מ&quot;מ KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4). מעביר את הביצים ל100 תרבות צלחות מ&quot;מ מלא בחיץ E3 וחנות בחממה 28 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללמוד כימיקלים שמשנים CERebrovascular הסתעפות להוסיף ריכוזים כימיים הרצויים. לדוגמא הסתעפות neovasular יכולה להיגרם עם מעכבי γ-secretase (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)] אסתר-S-phenylglycinet-בוטיל) solubilized ב4 DMSO, החל 24 שעות שלאחר הפריה (hpf). באותו הזמן עובר נקודה הם עדיין בתוך סיסי, וכימיקלים רבים יכולים לעבור את זה 8. אם מצב טיפול יש השפעות עצביות או מנוע שעלול לפגוע ביכולתם של עוברים להשתחרר מסיסי, ולאחר מכן עובר צריך להיות דה chorionated בין 24 ו48 hpf, אשר יכול להיעשות גם עם מלקחיים של pronase 2. עוברים שמוצגים בתמונות שסופקו היו dechorionated בעדינות על ידי תופס סיסית עם שני מלקחיים מחודדים וקורע אותה פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך / רצוי, היווצרות פיגמנט יכולה להיות מעוכבת על ידי הוספת 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למאגר שE3 ב24 hpf. </li></ol> 2. Confocal הדמיה של כלי הדם במוח Structures בעוברי דג הזברה קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העוברים ב250 methanesulfonate Tricaine מ&quot;ג / ליטר, ולאחר מכן לתקן אותם על ידי טבילה ב2 - paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C. מכולות עם עוברי ניאון צריכה להיות עטופות בנייר כסף. קבוע פעם אחת, צריכים להיות מאוחסנים עוברי PBS ב 4 מעלות צלזיוס עד צילמו - עוצמת הקרינה EGFP הופכת פחות נפתרה לאחר כשבוע, אבל מורפולוגיה (כפי שנצפו בשדה בהיר) נשמרה הרבה זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לעלות את העובר על ידי הסרת עין אחת הראשון באמצעות מחט טונגסטן חידדה. לחתוך סביב רקמת חיבור העין ראשונה ולאחר מכן לחתוך את השרירים ולבסוף חתך את עצב הראייה כדי לעקור את העין. (הערה: להסיר אם ההדמיה שני הצדדים הוא רצוי בשתי העיניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע העין מוסרת, הר העובר על coverglass באמצעות ירידה של methylcellulose 3%. לכוון את העובר כך שהצד עם העין שהוסרה עומד בפני coverglass וקרוב לזכוכית ככל האפשר. לכסות את כל העובר עם methylcellulose כדי למנוע התייבשות במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת העובר רכוב באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצויד מטרת 20x תכנית Apo באיכות גבוהה (צמצם מספרי = 0.75 או יותר) באופן מיידי. תצורה זו עדיפה על מיקרוסקופ שאינו הפוך שיחייב הרבדה העובר בין שני מטוסי זכוכית, ולחיצה על העובר על הזכוכית העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פרוסות אופטיות במרווחים של 1 מיקרומטר באמצעות הגדרת צמצם בינונית או גדולה. גם צעדים גדולים יותר של 2.5 מיקרומטר ניתן להשתמש בם, אבל זה עלול להיות קשה יותר כדי לקבוע את הסדר המרחבי של אובייקטים קטנים יותר. פתחים קטנים לייצר פירוט חדים יותר, אך הסריקות נדרשות עוד יכולות להלבין EGFP וגם להגביל את העומק של הדמיה לעובר שניתן להשיג. מיקרוסקופ confocal מאפשר הדמיה על חצי דרך עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה של כל הדגים היא רצויה, להסיר את שני העיניים בתחילת הדרך (ראה הערה בשלב 3.2), לסובב את העובר לאחר לדמייןצד אחד גרם וחזור על השלבים 2.3-2.5 לצד הנגדי. </li></ol> 3. 3D שחזור עוברי דג הזברה Cerebrovasculature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהפצת פיג&#39;י 3 של ImageJ קוד פתוח (http://fiji.sc), אשר מותאמת במיוחד עבור הדמיות 3D, ללא תשלום, ותואמת עם מחשבי PC, Mac ו-Linux. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות יבוא confocal לפיג&#39;י ידי הולך BioFormats לוקוסים&gt; יבואן 9 לאחר מכן בחר תוספים&gt; קובץ confocal, למשל name.ids לערימות של ניקון (איור 2 א). בחר צפו במחסנית עם מצב hyperstack, צבע: גווני אפור, בדוק autoscale, לבדוק ערוצים לפצל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירות אלה יפתחו ארבעה פנלי ערוץ נפרדים; לEGFP רק אחד יהיה צורך, בדרך כלל אחד למטה השלישי. סגור שלושה לוחות האחרים (אדום, כחול ואלפא) והשאיר את התמונה 16 סיביות עם שם ארוך ואחריו (איור 2 א) C = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם סף על ידי סריקה אם כי את התמונה באמצעות הגלילה taב בחלק התחתון כדי למצוא הפרוסה שיש לו את האזור או מבנה של עניין, ואז ללכת לתמונה&gt; התאם&gt; סף (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפנל שעולה, חלק את הסרגל העליון (רמה שחורה) משמאל, כך שהמבנה ניתן לראות היטב על רקע, ולהשאיר את השקופית התחתונה (ברמה לבנה) שבו הוא (איור 2 ד). בחר B &amp; W, בחר רקע כהה. אל תבחר סף לחשב עבור כל תמונה, אלא אם כן התאמות שונות הנדרשות לכל פרוסה, בחרו רקע שחור. תהליך זה יוצר תמונה של 8 ביט חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזהרה: סף לא ניתן לבטל או נשמר בImageJ, אז ערימת confocal תצטרך להיות מחדש בכל פעם שיש צורך בשינוי. רשום את המספרים ולנסות הגדרות שונות עד לתוצאה הרצויה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתוספים&gt; 3D Viewer&gt; סף 0, דגימה מחדש של גורם 1 (הטוב ביותר) או 2 (טוב), בטל את התיבות בצבע אדום והכחולים כדי להפוך את פלט 3D ירוק - אחר זה will לייצר לבן טיוח - בחר החל (לא אוטומטי) (2E איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב, ספין וזום תמונת 3D באמצעות העכבר ומקשי מקלדת (איור 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירת תמונות סטילס בכל נקודה על ידי שימוש באפשרות ללכוד בתפריט. גודל תיבת התמונה על המסך מכתיב ממדי פיקסל של התמונה מיוצרים על כך שאם תמונה ברזולוציה גבוהה היא רצויה להפוך את התיבה גדולה יותר על ידי גרירת הפינה ימנית התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור סרט 3D ספינינג על ידי בחירת סיבוב תצוגה&gt; שיא 360 מעלות (איור 2G). ברירות המחדל של סיבוב עד 2 מעלות לכל צעד, אבל זה יכול להיות שונה עד 5 מעלות לדוגמא, אשר ייצרו גדלי קובץ קטנים בהרבה, אבל עשוי להוסיף עצבנות לאנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הקובץ באחד מכמה פורמטים זמינים לשימוש מאוחר יותר צפייה עם נגני מדיה, העלאה לאינטרנט, או באמצעות במצגות PowerPoint. נגן המדיה בקוד הפתוח, VLC <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">(ht</a>TP :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), הנו ללא תשלום ומטפל בסרטונים האלה טובים מאוד. </li></ol>

<ol>
	<li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish.">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-&#946;+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-&#946; plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina.">Amyloid-&#946; increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+a+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo.">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development.">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li><li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging.">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy.">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

אין מה לחשוף.

השיטות שתוארו כאן לספק בסיס ללימודים חזותיים של מערכת כלי הדם בפיתוח דג הזברה. דגימות בשידור חי ניתן להשתמש כדי להעריך את פרמטרים פיסיולוגיים, כגון קצב לב ונפח פעימת לב, ואילו דגימות קבועות יכולות לשמש לconfocal הדמיה ברזולוציה גבוהה. דרוזופילה וג elegans לאפשר הדמיה של כל גוף, אבל דג הזברה הן בעלי חוליות ולספק מודל שימושי לרקמות חוליות, כולל מערכת כלי דם מרופד תא האנדותל. מחקרים אלה יכולים לשלב קווים מהונדסים משמעותיים ומשאבים הגנומי מהקהילה מחקר דג הזברה. שחזור 3D ו טיוח של תמונות confocal מדג הזברה עוברית, כפי שתואר כאן, מאפשר גישת ביולוגיה של מערכות להסתעפות של כלי דם וצפיפות כלי דם שאינה אפשרי עם מודלים של בעלי חיים גדולים כמו חולדות ועכברים. יתר על כן, כamniotes דג הזברה מתפתחת בסביבה לשינוי (חיץ E3), שבו אפשר להוסיף בקלות גhemicals המעכבים אנזימים ספציפיים או תהליכים אחרים המשפיעים על התפתחות של כלי דם. הריכוז ועיתוי המשלוח כימי ניתן לשנות, מה שמאפשר לחוקר תנאי טיפול לכוונן. 1. שינויים ופתרון בעיות שינויים במערכת זו יכולה לשלב קווים מהונדסים של דג הזברה שמבטאים חלבוני ניאון EGFP או אחרים במגוון רחב של דפוסי רקמות ספציפיים, איבר או אזור 10. יתר על כן, ניתוח של שינויי neovascular ברשתית דג הזברה באחרונה פורסם 5. בעיות עם פיגמנטציה בעוברים ודג זברה מבוגרים יותר יכולות להיות מתוגמלות על ידי מעבר עם קווים מהונדסים, שאינו מייצרים פיגמנטים בקנה מידה או פיגמנט של רשתית. בעיות עם הקרינה מופחתת בדרך כלל כתוצאה מתנאי קיבעון לא הולמים. Paraformaldehyde (4%) ליום 1 הוא אופטימלי, אבל fixatives חזק יותר, כגון glutaraldehyde, tetroxide אוסמיום או אלכוהול, עלוללהרוס הקרינה EGFP. לאחר קיבוע, צריך להיות כל הזמן עובר בPBS ב 4 ° C ותמיד מוגן מפני אור שמש ישיר. 2. מגבלות של טכניקה זו האיכות והרזולוציה של הדמיות 3D מיוצרות עם פרוטוקול זה תלויות באיכות של תמונות שנוצרו. חדירת אור דרך עוברים אלה מוגבלים למישור אמצע sagittal-באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי. היבט זה של הדמיה מגביל את העומק של הדמיה בעוברים ומבוגרים, אבל מערכות מיקרוסקופיה רב פוטון מתקדמות יותר מאפשרות הדמיה בעומקים גדולים יותר. 3. משמעות ביחס לשיטות קיימות פרוטוקול זה מספק גישה לניתוח של רשתות כלי דם ברמה מערכות שיכולים לשלב כל בעלי חיים. ייצוגים קודמים של נתונים כאלה לעתים קרובות הסתמכו על סדרה של תמונות ערוכים יחד, אבל טיוח 3D מספק רזולוציה טובה יותר של רלה המרחביתtionships מעורב. 4. יישומים עתידיים פיתוחים חדשים בתחום הדמיה ועיבוד רקמות יספק יישומים חדשים רבים לשיטות אלה, שעשויים לכלול מה שהופך את עוברים או מבוגרים 11-14 שקוף מבוגרים יותר. שקיפות משופרת תגדיל חדירה לרקמות מאוד על ידי לייזרי פוטונים רב confocal ו. יתר על כן, כמו המהירות של מצלמות וצינורות מכפיל להגדיל זה עשוי להיות אפשרי בקרוב לייצר הדמיות 3D של דגים בזמן אמת, ומספק ממד ה -4 של ניתוח. 5. צעדים קריטיים שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא הכנה להדמיה, הכולל קיבוע נכון. הדמיה צריך להיעשות בהקדם האפשרי לאחר קיבוע עם יעדים באיכות גבוהה שיש להם הפתחים המספריים הטובים ביותר הזמינים. החלטה תלויה במערכת ההדמיה משמשת, מערכות איכות כל כך גבוהה הן בדרך כלל טוב יותר. יצירת הדמיות 3D היא זיכרון אינטנסיבילכך מחשבים עם כמות גדולה של זיכרון ומעבדי גרפיקה טובים יותר, high-end מומלץ. מערכת הביולוגיה החזותית שתוארה כאן כבר מותאמת לדג זברה מהונדס המבטא EGFP בתאי האנדותל של כלי דם, אם כי יכולים להיות מותאמות בשיטות אלה לעוברים מהונדסים המבטאים את ה-GFP, או חלבוני ניאון אחרים, באוכלוסיות של תאי עצב, שרירים, בלוטות או כל מספר של תאים אחרים. היתרון העיקרי בעבודה עם מערכת זו הוא היכולת ללמוד מה שקורה בכל העובר בכל עת במהלך תקופת התפתחותי זה, בבעלי חיים קבועים ו / או בשידור חי.

דג הזברה לספק מערכת רבת עוצמה כדי לחקור ביולוגיה התפתחותית, והשקיפות היחסית של העוברים שלהם ניתנת למחקרים מבוססי הדמיה 1. החברה דג הזברה שמשה כמודל לפיתוח חוליות במשך עשרות שנים. Teleosts, כוללים דג הזברה, יש מערכת כלי דם חוליות פשוטה שאין לו הומולוג סביר בחסרי חוליות. דם נשאב מהלשכה הקדמית של לב שני תאיים דרך זימים, שם הוא מחומצן. דם מהזימים מתכנס באב העורקים הגב ועובר דרך עורקי הסניף לתוך כלי קטן יותר ויותר, בסופו נימי לכת ברקמות איברים. בתוך חמצן נימים הוא שוחרר ופחמן דו חמצני נספג. בצד הוורידים של נימי דם זורם לורידים גדולים יותר ויותר ולבסוף נשאב לתוך התא האחורי של הלב, שבו המחזור חוזר. דג הזברה מבוגר יכולה להניח 200 או יותר ביצים בכל פעם, וoncדואר מופרה, שהם מפתחים במהירות 2. בתוך יום אחד ציר הגוף מפותח, כולל שרירים שחוזה ולהעביר את העובר סביב בתוך קרום כוריוני. מ2-7 ימים לאחר הפריה (DPF) רוב מערכות הגוף לפתח, כולל עיניים ומערכת עצבים מרכזיות שיכולים לתאם שוחה לעבר מזון או הרחק מאור בהיר. עד 7 עוברי DPF הם קטנים מספיק כדי לאפשר הדמיה עם מיקרוסקופ. קווים מהונדסים המבטאים את חלבוני ניאון ניתן הדמיה עם מיקרוסקופיה confocal או הקרינה. ההדמיה confocal ניתן לזווג עם תוכנות קוד פתוח 3 כדי ליצור הדמיות 3D של מבני כלי דם מלאים בעוברי דג הזברה המספקים נקודת מבט ביולוגיה מערכות של התפתחות כלי דם. מחקרים העוסקים בשינויים במורכבות כלי דם וכלי דם במוח ייהנו מפרוטוקול זה כפי שהוא מאפשר ניתוח ברמת מערכות של רשתות כלי דם 4,5. אוסף של שיטות ומשאבים הם לספקד, כדי לאפשר אימוץ קל ושל טכניקות אלה ללימודים שדורשים הדמיה של מבני כלי דם בדג זברה עוברית. יעילות העלות של דג הזברה כמודל חיה היא שילוב עם טכנולוגיות הדמיה המתעוררות לספק פלטפורמות חדשות שבה להעריך את השפעות angiogenic של מסלולים מולקולריים בהתפתחות חוליות והומאוסטזיס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

דג הזברה הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה התפתחותית ופתולוגיה בגוף חי. הגודל הקטן ושקיפות היחסית של עוברי דג הזברה להפוך אותם שימושי במיוחד לבדיקה ויזואלית של תהליכים כגון לב והתפתחות כלי דם. בכמה מחקרים שנעשה לאחרונה דג הזברה מהונדס המבטא EGFP בתאי האנדותל של כלי דם שימשו לתמונה ולנתח את רשתות כלי דם מורכבות במוח וברשתית, באמצעות מיקרוסקופיה confocal. תיאורים מסופקים להכין, לטפל ותמונה עוברי דג הזברה שמבטאים את החלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), ולאחר מכן ליצור הדמיות 3D מקיפות של מערכת כלי הדם במוח. פרוטוקולים כוללים את הטיפול בעוברים, הדמיה confocal, ופרוטוקולי קיבעון שלשמר הקרינה EGFP. יתר על כן, עצות שימושיות על קבלת תמונות באיכות גבוהה של מבני כלי דם במוח, כגון הסרת עין ללא רקמה עצבית סמוכה מזיקה מסופקות. בעיות פוטנציאליותעם ההדמיה confocal הם דנו, יחד עם הצעדים הדרושים כדי ליצור 3D שחזורים מארובות תמונת confocal באמצעות תוכנת קוד פתוח זמינה באופן חופשי.

שחזור 3D של מבני כלי דם מספק נקודת מבט מקיפה ומעניינת מבחינה ויזואלית של פיתוח דג הזברה. איורים שיטות מופע 1 ו -2 כפי שהם בדרך כלל עשו. איור 3 מציג כמה זוויות של מבני כלי דם ב6 DPF עובר דג הזברה שהביע EGFP בתאי האנדותל. עם צבע ירוק או לבן מוצק זה יכול להיות קשה להעריך את עוצמת אות; פסאודו צביעה לספק עוצמת תמונה מלהסתכל למעלה שולחנות ומאפשרת תפיסת עומק טובה יותר כאשר מבנים חופפים. דוגמא לתמונת 3D פסאודו בצבע של כלי הדם ב6 DPF דג הזברה מסופקת באיור 4. דימות פלואורסצנטי של עוברים חיים יכולה לשמש כדי לחקור מאפיינים פיסיולוגיים הכוללים את העין ותנועת גוף, ופעילות לב. איורים 3 ו -4 להראות תוצאות שהושגו עם נציג שיטות אלה, תוך שימוש בקו דג הזברה המהונדס<html> תאר. הדמיה ברזולוציה תלויה במאפייני מיקרוסקופ, אבל הבהירות של אות EGFP מספיק עבור איכות תמונה טובה עם רוב המערכות מסחריות. שיקום וטיוח של ייצוגי 3D הוא עקביים ואפשרויות בתוך תוכנת קוד פתוח זו מספקות תוצאות טובות באופן עקבי. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. הסרת עין. א) העובר DPF 3 קבועים עם צורך טונגסטן ממוקם בסמוך לעין. רקמה היא לחתוך מסביב לעין מזו עמדה. B) העין היא נופל החוצה ושרירי העין הבסיסיים ועצב ראייה נחתכים. שקע העין הריק מסומן בעיגול מקווקו. C) אותו העובר התהפך ועלה עם מתיל תאית, בעין ללא פגע פונה כלפי מעלה.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2. צעד אחר צעד שחזור 3D של ערימת תמונת confocal. א) פתח קובץ (4104.1.ids) הטעון בתוך פיג&#39;י באמצעות תוספים&gt; לוקוסים&gt; Bioformat לבחור. ב &#39;) לאחר מציאת פרוסה עם האזור של עניין, התאמת סף נבחרה כפי שמוצגת. C) סף מותאם ל214 משתמש העליון מחוון ולהחיל נבחר. צופה 3D D) נקרא כפי שמוצג. E) שחזור 3D מוצג של דג הזברה עם עין שלמה, להתמצאות. F) התמונה כבר מוגדלת ומסובבת. G) סרט סיבוב של o360 הוא עשה כפי שמוצג.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3. פרספקטיבות משחזור 3D. א) נקודת מבט המדיאלי של 6 העובר DPF צילם עם 10x אובייקטיבי, פה הוא בצד הימין, ולא זימים בתוך פה. ב &#39;) לרוחב של אותו העובר, סנפיר פתק הוא לולאה באמצע.) אותו העובר C צילם עם 20x אובייקטיבי, נקודת מבט המדיאלי, רזולוציה זימים פתק. ד) נקודת מבט רוחבית של 20x הדמיה אובייקטיבית. הסנפיר הוא בקצה הימני של הפנל.) תצוגה Antero-E המדיאלי של 20x הדמיה אובייקטיבית, זימי פתק בתוך הפה של בטן. F) מאותו העובר צילם עם 20x אובייקטיבי, ראשו לצד הימין. שים לב כלי דם בצק החלמון בפינה הימנית התחתונה.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4. הבדלי עוצמה ב6 עובר DPF. תמונה של שיקום 6 DPF באמצעות להסתכל למעלה שולחנות pseudocolor לעוצמת אות. פה, מוח, זימים וצק חלמון מסומנים להתמצאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> איור 5. הסרט של מערכת כלי דם משוחזרת בדג זברת DPF 4. הדגים היו צילם ב2.5 מיקרומטר. התמונות היומהדמית חצי אחד של העובר. השוואת מבני כלי דם עם מבנים בדג זברה שטופל GSI סיפקו באיור 6. שים לב לצפיפות נמוכה יותר של כלי דם בראש ובזימים גדולים יותר. (ראה קובץ משלים &quot;Zfish_spin.avi&quot; תחת הורדות) <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> איור 6. 3D סרט של מערכת כלי דם בעובר שטופל ב-GSI בDPF 4. הדגים היו צילם ב2.5 מיקרומטר באמצעות מרוחב לקו אמצע. השוואת מבני כלי דם עם השליטה DPF 4 דגים שמוצגים באיור 5. הגב המקומר והגודל קטן יותר אופייניים בעוברים שטופלו בחומר כימי זה. (ראה קובץ משלים &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; תחת הורדות)

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  Western University of Health Sciences.  הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות. 

Video: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.