Gli autori ringraziano i membri passati e presenti dei nostri laboratori che hanno contribuito a sviluppare queste tecniche. Finanziamento parziale fornito DE da una sovvenzione da parte del California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538).

1. Zebrafish Zootecnica, Embrione generazione e trattamento <ol><li> Condurre i seguenti protocolli di zebrafish sotto la guida di un cura degli animali e l&#39;uso comitato istituzionale (IACUC) e all&#39;interno delle linee guida per la cura degli animali del NIH o di altre normative enti / linee guida. </li><li> Ceppi di zebrafish che esprimono proteine ​​fluorescenti in specifici tessuti, cellule o organi sono disponibili presso il Zebrafish International Center Resource (Zirc). Ad esempio, Tg (KDR: EGPF) s843 esprimono EGFP in cellule endoteliali vascolari 6, che possono essere utilizzati per produrre complete strutture vascolari 3D come mostrato in questo protocollo. Altre linee di zebrafish transgenico sono disponibili da Zirc. </li><li> Casa zebrafish adulto in un sistema di acquacoltura appropriato che monitora pH, salinità, temperatura, ossigeno disciolto, luce, ed altri fattori ambientali 7. Il pesce zebra mostrata qui sono stati alloggiati in un sistema Aquaneering Inc. (San Diego, CA) a 28,5 ° C con un lig 14 oreht/10 ore di buio. Alimentare zebrafish adulto una dieta equilibrata di artemie e NRD 4/6 cibo Pesci (Brine Shrimp diretto, Ogden, Utah). </li><li> Maschio adulto e zebrafish donna in età fertile dovrebbero essere alloggiati separatamente per aumentare l&#39;accoppiamento di successo. </li><li> Stimolare la deposizione delle uova e la fecondazione ponendo femmine (2-4) e maschi (4-6) insieme in un contenitore di accoppiamento che dispone di un fondo a rete con fori abbastanza grande per le uova cadono attraverso, ma troppo piccola per il numero di adulti zebrafish per passare . Impostare accoppiamenti la sera prima; uova vengono deposte in prossimità dell&#39;alba, mentre di solito il ciclo di luce diurna aumenta lentamente di intensità (alba). Controllare uova sul fondo del contenitore accoppiamento ogni 15-30 minuti. </li><li> Raccogliere le uova con un colino a maglia e pulito con tampone E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2, 0.33 MgSO mm 4). Trasferire le uova fino a 100 mm piastre di coltura riempito con tampone E3 e conservare in un incubatore a 28 ° C. </li><li> Per studiare le sostanze chimiche che alterano cerebrovascular ramificazione aggiungi concentrazioni chimiche desiderati. Ad esempio ramificazione neovasular può essere indotta con inibitore di γ-secretasi (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)] estere-S-phenylglycinet-butil) solubilizzati in DMSO 4, iniziando 24 ore dopo la fecondazione (HPF). A quel tempo gli embrioni punti sono ancora all&#39;interno del corion, e molte sostanze chimiche possono passare attraverso di esso 8. Se una condizione di trattamento ha neurali motorie o effetti che possono compromettere la capacità di embrioni per liberarsi del corion, quindi gli embrioni devono essere de-chorionated tra 24 e 48 HPF, che può essere fatto sia con una pinza di pronasi 2. Embrioni mostrati nelle immagini fornite sono state dechorionated afferrando delicatamente il corion con due pinze affilato e strappare aperto. </li><li> Se necessario / desiderato, formazione di pigmento può essere inibita con l&#39;aggiunta di 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) al buffer E3 a 24 HPF. </li></ol> 2. Confocale Imaging di cerebrovascolare StructUres in Zebrafish fisso embrioni <ol><li> Sacrificare embrioni in 250 mg / L Tricaine metansolfonato, e poi fissarli per immersione in 2-4% paraformaldeide notte a 4 ° C. Contenitori con embrioni fluorescenti dovrebbero essere avvolti in carta stagnola. Una volta fissato, embrioni devono essere conservati in PBS a 4 ° C fino ripreso - EGFP fluorescenza diventa meno risolto dopo circa una settimana, ma morfologia (come visto in campo chiaro) è conservato molto più lungo. </li><li> Preparatevi a montare l&#39;embrione rimuovendo prima un occhio usando un ago di tungsteno affilato. Tagliare tutto il tessuto connettivo dell&#39;occhio prima tagliare i muscoli, e infine tagliare il nervo ottico per spostare l&#39;occhio. (Nota: remove Se l&#39;imaging entrambi i lati si desidera entrambi gli occhi.) </li><li> Una volta che l&#39;occhio viene rimosso, montare l&#39;embrione in un coprioggetti una goccia di 3% di metilcellulosa. Orientare l&#39;embrione in modo che il lato con l&#39;occhio rimosso sia rivolta coprioggetti ed è più vicino al vetro possibile. Coprire l&#39;intero embrione con methylcellulose per prevenire l&#39;essiccamento durante l&#39;imaging. </li><li> Immagine dell&#39;embrione montato immediatamente utilizzando un microscopio confocale invertito equipaggiato con un obiettivo 20x Plan Apo alta qualità (apertura numerica = 0,75 o superiore). Questa configurazione è preferibile un microscopio non invertita che richiederebbe sandwich dell&#39;embrione tra due piani di vetro, e premendo l&#39;embrione contro il vetro superiore. </li><li> Raccogliere fette ottici in 1 micron incrementi con un livello medio o grande apertura. Passi più grandi di 2,5 micron possono anche essere utilizzati, ma può essere più difficile da determinare l&#39;ordine spaziale degli oggetti più piccoli. Piccole aperture producono maggiore nitidezza, ma le scansioni lunghi richiesti possono candeggiare EGFP e anche limitare la profondità di imaging nella embrione che può essere raggiunto. Un microscopio confocale permette l&#39;imaging circa a metà strada attraverso un embrione. </li><li> Se si desidera l&#39;imaging del pesce intero, rimuovere entrambi gli occhi fin dall&#39;inizio (vedi nota nel passo 3.2), ruotare l&#39;embrione dopo imaging un lato e ripetere i passaggi 2,3-2,5 per il lato opposto. </li></ol> 3. 3D Ricostruzione di Zebrafish embrionali Cerebrovasculature <ol><li> Utilizzare la distribuzione Fiji 3 su open source ImageJ (http://fiji.sc), che è ottimizzata per rendering 3D, gratuito e compatibile con PC, Mac e Linux. </li><li> Importa pile confocale a Fiji per andare a Plugins&gt; LOCI&gt; BioFormats Importatore 9, quindi selezionare il file confocale, ad esempio name.ids per pile Nikon (Figura 2A). Selezionare Visualizza stack con modalità HyperStack, Colore: scala di grigi, controllare autoscale, controllare i canali divisi. </li><li> Queste selezioni si apriranno quattro pannelli canali separati; per EGFP saranno necessari solo uno, di solito il terzo giù. Chiudere gli altri tre pannelli (rosso, blu e alfa) lasciando l&#39;immagine a 16 bit con un nome lungo seguito da C = 1 (Figura 2A). </li><li> Regolare la soglia dalla scansione se l&#39;immagine utilizzando il rotolo tab lungo il fondo per trovare una fetta che ha la regione o la struttura di interesse, poi vai a Immagine&gt; Regolazioni&gt; Soglia (Figura 2C). </li><li> Nel pannello che si apre, fare scorrere la barra superiore (livello di nero) a sinistra in modo che la struttura possa essere visto molto bene su sfondo, e lasciare la slitta inferiore (livello di bianco), dove è (Figura 2D). Seleziona B &amp; W, selezionare Sfondo scuro. Non selezionare Soglia calcolate per ogni immagine, a meno diversi aggiustamenti sono necessari per ogni sezione, selezionare Sfondo nero. Questo processo crea una nuova immagine a 8 bit. </li><li> ATTENZIONE: soglia non può essere annullata o salvato in ImageJ, quindi lo stack confocale dovrà essere ricaricato ogni volta che è necessario un cambiamento. Annotare i numeri e provare diverse impostazioni fino ad ottenere il risultato desiderato. </li><li> Vai a Plugins&gt; Visualizzatore 3D&gt; soglia 0, il fattore 1 (migliore) o 2 (buono) ridefinizione, deselezionare le caselle di colore rosso e blu per fare un uscita in 3D verde - altrimenti will produrre un rendering bianco - selezionare Applica (non Auto) (Figura 2E). </li><li> Ruotare, girare e ingrandire l&#39;immagine 3D utilizzando il mouse e comandi da tastiera (Figura 2F). </li><li> Salvare immagini fisse in qualsiasi momento utilizzando l&#39;opzione di cattura nel menu. La dimensione della casella di immagine sullo schermo determina le dimensioni in pixel dell&#39;immagine prodotta quindi se un immagine ad alta risoluzione si desidera fare la scatola più grande trascinando l&#39;angolo in basso a destra. </li><li> Creare un filmato di filatura in 3D selezionando Visualizza&gt; Record di rotazione di 360 gradi (Figura 2G). Default Rotazione a 2 gradi al passo, ma possono essere modificati a 5 gradi per esempio, che creerà file di dimensioni molto più piccole, ma possono aggiungere scatti per l&#39;animazione. </li><li> Salvare il file in uno dei diversi formati disponibili per la successiva visualizzazione con i lettori multimediali, caricare su Internet o utilizzando in presentazioni PowerPoint. Il lettore multimediale open source VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), è gratuito e gestisce questi video molto bene. </li></ol>

<ol>
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Non c&#39;è nulla da rivelare.

I metodi qui descritti forniscono una base per gli studi visivi del sistema vascolare nello sviluppo di zebrafish. Esemplari vivi possono essere usate per valutare i parametri fisiologici, come la frequenza cardiaca e la gittata sistolica cardiaca, mentre i campioni fissi possono essere usate per alta risoluzione confocale. Drosophila e C. elegans consentire intero corpo di imaging, ma zebrafish sono vertebrati e fornire un modello utile per tessuti vertebrati, compreso un sistema vascolare cellule endoteliali allineato. Questi studi possono incorporare significative linee transgeniche e risorse genomiche dalla comunità di ricerca zebrafish. Ricostruzione 3D e rendering delle immagini confocale di zebrafish embrionale, come qui descritte, consentirà un approccio di biologia dei sistemi di ramificazione vascolare e del sangue densità dei vasi che non è possibile con modelli animali grandi come ratti e topi. Inoltre, come amnioti zebrafish sviluppano in un ambiente modificabili (buffer E3), dove si può facilmente aggiungere chemicals che inibiscono gli enzimi specifici o altri processi che influenzano lo sviluppo vascolare. La concentrazione e la tempistica di consegna chimiche possono essere modificati, consentendo al ricercatore condizioni di trattamento di fine-tune. 1. Modifiche e risoluzione dei problemi Le modifiche al sistema possono includere linee transgeniche di zebrafish che esprimono proteine ​​fluorescenti EGFP o altri in una varietà di tessuto, organo o regione specifici modelli 10. Inoltre, l&#39;analisi delle variazioni neovascolari nella retina zebrafish è stato recentemente pubblicato 5. Problemi con la pigmentazione di embrioni anziani e zebrafish adulti possono essere compensati da incrocio con linee transgeniche che non producono pigmenti di scala o pigmentato retinico. Problemi con la fluorescenza diminuita in genere derivano da condizioni di fissazione inadeguato. Paraformaldeide (4%) per 1 giorno è ottimale, ma fissativi più forti, come la glutaraldeide, tetrossido di osmio o alcool, possonodistruggere EGFP fluorescenza. Dopo la fissazione, gli embrioni devono essere conservati in PBS a 4 ° C e sempre protetti dalla luce solare diretta. 2. Limitazioni di questa tecnica La qualità e la risoluzione di rendering 3D prodotti con questo protocollo dipendono dalla qualità delle immagini generate. Penetrazione della luce attraverso questi embrioni è limitata al piano sagittale utilizzando un microscopio confocale standard. Questo aspetto delle immagini limita la profondità delle immagini in embrioni grandi e negli adulti, ma i sistemi di microscopia multi-fotone più avanzati consentono per l&#39;imaging a profondità maggiori. 3. Importanza rispetto ai metodi esistenti Questo protocollo fornisce un approccio per l&#39;analisi delle reti del vaso sanguigno a livello dei sistemi che possono incorporare un intero animale. Rappresentazioni precedenti di tali dati, spesso invocato serie di immagini disposte insieme, ma il rendering 3D fornisce una migliore risoluzione del rapporto spazialetionships coinvolti. 4. Applicazioni future Nuovi sviluppi nel campo dell&#39;imaging e trattamento dei tessuti fornirà molte nuove applicazioni per questi metodi che possono comprendere facendo embrioni superiore o gli adulti trasparente 11-14. Maggiore trasparenza aumenterà notevolmente la penetrazione nei tessuti da laser confocale e multi-fotone. Inoltre, poiché la velocità di telecamere e fotomoltiplicatori aumentare potrebbe essere presto possibile produrre rendering 3D di pesci in tempo reale, fornendo una 4 ° dimensione di analisi. 5. Passaggi critici Un passo fondamentale in questo protocollo è la preparazione per l&#39;imaging, che comprende la fissazione corretta. Imaging deve essere fatto il più presto possibile dopo fissazione con obiettivi di alta qualità che hanno le migliori aperture numeriche disponibili. Risoluzione dipende dal sistema di imaging utilizzata, sistemi così alta qualità sono generalmente migliori. Generazione di rendering 3D è la memoria intensivaper così nuovi, computer di fascia alta, con una grande quantità di memoria e di buoni processori grafici sono raccomandati. Il sistema visivo biologia qui descritto è stato ottimizzato per zebrafish transgenici che esprimono EGFP in cellule endoteliali vascolari, sebbene questi metodi possono essere adattati agli embrioni transgenici che esprimono GFP, o altre proteine ​​fluorescenti, in popolazioni di neuroni, muscoli, ghiandole o qualsiasi numero di altre cellule. Il principale vantaggio nel lavorare con questo sistema è la possibilità di studiare ciò che sta accadendo in tutta embrione in qualsiasi momento durante questo periodo di sviluppo, negli animali fisse e / o dal vivo.

Zebrafish forniscono un potente sistema per studiare la biologia dello sviluppo, e la relativa trasparenza dei loro embrioni è suscettibile di studi di imaging basata su 1. Lo zebrafish è stato ora utilizzato come modello per lo sviluppo dei vertebrati per decenni. Teleostei, inclusi zebrafish, hanno un sistema vascolare vertebrato semplificato che non ha omologo ragionevole invertebrati. Il sangue viene pompato dalla camera anteriore di un cuore a due camere attraverso branchie, dove è ossigenata. Il sangue dalle branchie converge alla aorta dorsale e passa attraverso le arterie che si diramano in vasi più piccoli, infine capillari raggiungendo in tessuti di organi. Da capillari ossigeno viene rilasciato e anidride carbonica viene assorbita. Sul lato venoso dei capillari sangue scorre nelle vene sempre più grandi e viene infine aspirato nella camera posteriore del cuore, in cui il ciclo si ripete. Un zebrafish adulto può deporre 200 o più uova alla volta, e ONCe fecondato, si sviluppano rapidamente 2. Entro un giorno l&#39;asse corpo è ben sviluppato, compresi i muscoli che muovono contratto e l&#39;embrione intorno all&#39;interno della membrana coriali. Da 2-7 giorni dopo la fecondazione (dpf) la maggior parte dei sistemi del corpo a sviluppare, tra cui gli occhi e un sistema nervoso centrale in grado di coordinare nuotare verso il cibo o lontano dalla luce intensa. Fino a 7 embrioni DPF sono abbastanza piccoli da consentire la visualizzazione al microscopio. Linee transgeniche che esprimono proteine ​​fluorescenti possono essere esposte con microscopia confocale o fluorescenza. Confocale può essere accoppiato con il software open-source 3 per creare rendering 3D delle strutture vascolari complete in embrioni di zebrafish che forniscono una prospettiva biologia dei sistemi di sviluppo vascolare. Studi in questione con i cambiamenti nella complessità vascolare e cerebrovascolari potranno beneficiare di questo protocollo in quanto consente una analisi a livello di sistemi di reti vascolari 4,5. Una raccolta di metodi e risorse sono fornired per consentire un facile adozione e di queste tecniche per studi che richiedono l&#39;imaging di strutture vascolari in zebrafish embrionale. L&#39;efficienza di costo di zebrafish come modello animale sta combinando con le tecnologie di imaging emergenti per fornire nuove piattaforme con cui valutare gli effetti angiogenici di vie molecolari di sviluppo dei vertebrati e l&#39;omeostasi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

Zebrafish sono un potente strumento per studiare la biologia dello sviluppo e patologia in vivo. La piccola dimensione e relativa trasparenza di embrioni di zebrafish li rendono particolarmente utile per l&#39;esame visivo dei processi come cuore e sviluppo vascolare. In diversi studi recenti zebrafish transgenici che esprimono EGFP in cellule endoteliali vascolari sono stati usati per immagine e analizzare reti vascolari complesse nel cervello e retina, usando la microscopia confocale. Le descrizioni sono forniti da preparare, trattare e immagine embrioni di zebrafish che esprimono una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP), e quindi generare rendering 3D completi del sistema cerebrovascolare. Protocolli includono il trattamento di embrioni, confocale, e protocolli di fissaggio che conservano EGFP fluorescenza. Inoltre, sono forniti consigli utili su come ottenere immagini di alta qualità delle strutture cerebrovascolari, come ad esempio la rimozione dell&#39;occhio senza danneggiare vicina tessuto neurale. Potenziali insidiecon confocale sono discussi, insieme con i passi necessari per generare ricostruzioni in 3D stack di immagini confocale utilizzando liberamente disponibile software open source.

Ricostruzione 3D di strutture vascolari fornisce una prospettiva globale e visivamente interessante di sviluppo zebrafish. Metodi figure 1 e 2 mostrano che sono tipicamente fatte. Figura 3 mostra diversi angoli di strutture vascolari in 6 dpf zebrafish che esprime EGFP in cellule endoteliali. Con un colore verde o bianco solido può essere difficile apprezzare intensità del segnale; pseudo-colorazione forniscono intensità immagine da un look-up-table e permette una migliore percezione della profondità in cui le strutture si sovrappongono. Un esempio di una pseudo-colore immagine 3D del sistema vascolare in un 6 dpf zebrafish è fornito in Figura 4. Fluorescence Imaging di embrioni vivi può essere usata per studiare le caratteristiche fisiologiche che includono occhio e movimento del corpo, e l&#39;attività cardiaca. Figure 3 e 4 mostrare i risultati rappresentativi ottenuti con questi metodi, utilizzando la linea zebrafish transgenico<html> descritto. Risoluzione di immagini dipende dalle caratteristiche del microscopio, ma la luminosità del segnale EGFP è sufficiente per una buona qualità di immagine con la maggior parte dei sistemi commerciali. Ricostruzione e rendering di rappresentazioni 3D è coerente e opzioni all&#39;interno di questo software open-source forniscono sempre buoni risultati. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Rimozione degli occhi. A) Una fisso 3 dpf embrione con un bisogno tungsteno posizionato accanto all&#39;occhio. Tessuto viene tagliato intorno all&#39;occhio da questa posizione. B) L&#39;occhio è cade fuori e muscoli oculari sottostanti e nervo ottico sono tagliati. La cavità oculare vuota è indicata con il cerchio tratteggiato. C) Lo stesso embrione è girato e montato con metil cellulosa, con l&#39;occhio intatto rivolto verso l&#39;alto.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Passo-passo ricostruzione 3D di una pila di immagini confocale. A) Aprire il file (4104.1.ids) caricato all&#39;interno Fiji utilizzando Plugins&gt; LOCI&gt; BIOFORMAT per selezionare. B) Dopo aver trovato una fetta con la regione di interesse, regolazione soglia viene selezionato come mostrato in figura. C) Soglia viene regolato a 214 con il top è selezionato scorrimento e applicare. visualizzatore D) 3D si chiama come mostrato in figura. E) La ricostruzione 3D è mostrato di una zebrafish con l&#39;occhio intatto, per l&#39;orientamento. F) L&#39;immagine è stata ingrandita e ruotata. G) ​​Un film rotazione di 360 gradi è realizzato come mostrato.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Prospettive di ricostruzione 3D. A) punto di vista mediale del 6 dpf embrione ripreso con obiettivo 10x, la bocca si trova sulla destra, non branchie all&#39;interno della bocca. B) laterale dello stesso embrione, nota pinna è un ciclo nel mezzo. C) Stessa embrione ripreso con obiettivo 20x, punto di vista mediale, la risoluzione branchia nota. D) prospettiva laterale della 20x di imaging obiettivo. La pinna è sul bordo destro del pannello. E) vista antero-mediale della 20x rappresentazione oggettiva, branchie nota all&#39;interno della bocca. F) Addome dello stesso embrione ripreso con un obiettivo 20x, la testa verso destra. Nota vascolare sul sacco vitellino in basso a destra.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Differenze Figura 4. Intensità in 6 dpf embrione. Immagine di una ricostruzione 6 dpf utilizzando un pseudocolore look-up-table per l&#39;intensità del segnale. Bocca, il cervello, le branchie e sacco vitellino sono etichettati per l&#39;orientamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Figura 5. Movie del sistema vascolare ricostruito in un zebrafish 4 dpf. Il pesce è stato ripreso a 2,5 micron. Le immagini eranoda l&#39;imaging metà dell&#39;embrione. Confrontare strutture vascolari con strutture in un zebrafish GSI trattati forniti in Figura 6. Noti la minore densità dei vasi sanguigni nella testa e branchie grandi. (Vedere &quot;Zfish_spin.avi&quot; File supplementare sotto Downloads) <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Figura 6. 3D Movie del sistema vascolare in un embrione GSI-trattato a 4 dpf. Il pesce è stato ripreso a 2,5 micron attraverso da laterale a linea mediana. Confrontare strutture vascolari con il controllo 4 dpf pesce mostrato in Figura 5. Il dorso arcuato e dimensioni ridotte sono tipici in embrioni trattati con questa sostanza chimica. (Vedere &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; File supplementare sotto Downloads)

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Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l&#39;imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici.

Imaging 3D e ricostruzione di strutture cerebrovascolari in Zebrafish embrionali

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  Western University of Health Sciences.  Imaging di sviluppo cerebrovascolare in zebrafish larvale è descritto. Sono forniti anche tecniche per facilitare l'imaging 3D e modificare lo sviluppo cerebrale con trattamenti chimici. 

Video: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Ricerca

Biologia

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissezione dei tessuti oculari Zebrafish embrionali

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Imaging cellulare dal vivo e analisi 3D del recettore dell&#39;angiotensina di tipo 1a tratta degli transfettati embrionali umane cellule renali Utilizzando Microscopia confocale