الكتاب أشكر أعضاء في الماضي والحاضر من مختبراتنا الذي ساعد في تطوير هذه التقنيات. التمويل الجزئي المقدمة للDE بمنحة من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي / CIRM (RN1-00538).

1. الزرد تربية وتوليد الأجنة، والعلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء البروتوكولات التالية الزرد تحت إشراف لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC) وضمن المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من المعاهد الوطنية للصحة أو الهيئات الأخرى / المبادئ التوجيهية التنظيمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتتوفر من مركز الزرد الدولية الموارد (ZIRC) سلالات الزرد التي تعبر عن البروتينات الفلورية في أنسجة معينة، والخلايا، أو الأجهزة. على سبيل المثال، تيراغرام (KDR: EGPF) s843 التعبير عن EGFP في الخلايا البطانية الوعائية 6، والتي يمكن استخدامها لإنتاج الهياكل الأوعية الدموية 3D كاملة كما هو موضح في هذا البروتوكول. خطوط أخرى من الزرد المعدلة وراثيا المتوفرة من ZIRC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيت الزرد الكبار في نظام تربية الأحياء المائية المناسبة التي تراقب درجة الحموضة، والملوحة، ودرجة الحرارة، الأوكسجين المذاب، والضوء، والعوامل البيئية الأخرى 7. وتم إيواء الزرد هو موضح هنا في نظام Aquaneering شركة (سان دييغو، كاليفورنيا) في 28.5 درجة مئوية مع الممتاز 14 ساعةht/10 ساعة دورة الظلام. إطعام الزرد الكبار اتباع نظام غذائي متوازن من الأرتيميا وإدارة الجنسية والإقامة 4/6 علف الأسماك (الماء المالح الروبيان المباشر، أوجدن، يوتا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يضم الذكور البالغين والزرد الإناث في سن تربية منفصل لزيادة نجاح التزاوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز وضع البيض والإخصاب عن طريق وضع الإناث (2-4) والذكور (4-6) معا في وعاء يحتوي على التزاوج أسفل يتناغم مع ثقوب كبيرة بما يكفي للبيض في الانخفاض خلال، ولكن صغيرة جدا بالنسبة للبالغين الزرد لتمرير . إعداد التزاوج المساء قبل؛ وضعت البيض قرب الفجر، وعادة في حين أن ضوء النهار دورة يزيد ببطء في شدة (الفجر). التحقق من وجود البيض في أسفل الحاوية التزاوج كل 15-30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض باستخدام مصفاة شبكة ونظيفة مع العازلة E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 مم CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4). نقل البيض إلى 100 لوحات ثقافة ملم مليئة E3 العازلة وتخزينها في الحاضنة 28 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدراسة المواد الكيميائية التي تغير السرطانebrovascular المتفرعة إضافة التركيزات الكيميائية المرجوة. على سبيل المثال يمكن أن يتسبب المتفرعة neovasular مع γ-secretase المانع (GSI IX/DAPT/N- [N-(3،5-Difluorophenacetyl-L-ألانيل)]-S-phenylglycinet بوتيل استر) solubilized في DMSO 4، ابتداء من 24 آخر ساعة الإخصاب (HPF). في ذلك الوقت نقطة الأجنة لا تزال داخل المشيمه، ويمكن أن العديد من المواد الكيميائية تمر عبره 8. إذا شرط المعاملة لديه العصبية الحركية أو الآثار التي قد تضعف قدرة الأجنة للتحرر من المشيمه، ثم الأجنة يجب إزالة chorionated بين 24 و 48 HPF، والتي يمكن أن يتم ذلك إما مع ملقط من pronase 2. تم dechorionated الأجنة هو مبين في الصور المقدمة عن طريق الاستيلاء بلطف المشيماء مع اثنين من ملقط شحذ وتمزق مفتوحا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر / المطلوب، تشكيل الصباغ يمكن تثبيط بإضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU) إلى المخزن المؤقت E3 في 24 HPF. </li></ol> 2. التصوير متحد البؤر الدماغية من البنيةالقوام ثابت في الزرد الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الأجنة في 250 ملغ / لتر تريكين methanesulfonate، ومن ثم اصلاحها عن طريق الغمر في 2-4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. حاويات مع الأجنة الفلورسنت ينبغي أن تكون ملفوفة في احباط. مرة واحدة ثابتة، ويجب أن يتم تخزين الأجنة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تصوير - EGFP يصبح أقل كثافة مضان حلها بعد نحو أسبوع، ولكن يتم الاحتفاظ مورفولوجيا (كما تراه في حقل مشرق) أطول بكثير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لتركيب الجنين عن طريق إزالة عين واحدة أولا باستخدام إبرة التنغستن شحذ. قطع حول الأنسجة التي تربط العين الأولى ثم قطع العضلات، وأخيرا قطع العصب البصري لتهجير العين. (ملاحظة: إذا كان التصوير إزالة كلا الجانبين هو المطلوب كلتا العينين.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد إزالة العين، جبل الجنين على ساترة باستخدام قطرة من 3٪ ميثيل. توجيه الجنين بحيث الجانب بالعين إزالتها تواجه ساترة وأقرب إلى الزجاج ممكن. تغطية الجنين كامل مع methylcellulose لمنع جفاف أثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الجنين شنت على الفور باستخدام المجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة عالية الجودة الهدف 20X خطة آبو (الفتحة العددية = 0.75 أو أفضل). هذا التكوين هو الأفضل المجهر غير مقلوب التي من شأنها أن تتطلب يقحم الجنين بين طائرتين الزجاج، والضغط على الجنين على الزجاج العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع شرائح الضوئية في 1 ميكرون الزيادات باستخدام إعداد فتحة متوسطة أو كبيرة. يمكن أيضا خطوات أكبر من 2.5 ميكرون يمكن استخدامها، ولكن قد يكون أكثر صعوبة لتحديد الترتيب المكاني للكائنات أصغر. فتحات صغيرة تنتج أكثر وضوحا من التفصيل، ولكن بالاشعة تعد مطلوبة قد تبييض EGFP ويحد أيضا من عمق التصوير في الجنين التي يمكن تحقيقها. A المجهر متحد البؤر يسمح للتصوير حوالي نصف الطريق من خلال الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب تصوير السمك كله، وإزالة كلتا العينين في البداية (انظر ملاحظة في الخطوة 3.2)، وتناوب على الجنين بعد تخيلز جانب واحد وكرر الخطوات من 2،3-2،5 عن الجانب المقابل. </li></ol> 3. إعادة الإعمار 3D الجنينية الزرد Cerebrovasculature <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام توزيع فيجي 3 من يماغيج مفتوحة المصدر (http://fiji.sc)، الذي هو الأمثل لالاداءات 3D، مجانا، ومتوافقة مع جهاز الكمبيوتر، لينكس وماك أجهزة الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد مداخن مبائر إلى فيجي عن طريق الذهاب إلى الإضافات&gt; الامكنه&gt; BioFormats المستورد 9 ثم حدد الملف متحد البؤر، مثل name.ids للمداخن نيكون (الشكل 2A). حدد عرض مكدس مع وضع Hyperstack، اللون: الرمادي، والتحقق autoscale، تحقق قنوات الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهذه التحديدات فتح أربع لوحات قناة منفصلة؛ لEGFP سوف تكون هناك حاجة واحدة فقط، وعادة ثالث واحد لأسفل. إغلاق الألواح الثلاثة الأخرى (الأحمر والأزرق وألفا) وترك الصورة 16 بت مع اسم طويل تليها C = 1 (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط عتبة عن طريق المسح الضوئي على الرغم من أن الصورة باستخدام التمرير تاب على طول الجزء السفلي للعثور على شريحة لديها المنطقة أو بنية الفائدة، ثم انتقل إلى صورة&gt; ضبط&gt; عتبة (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة أن يأتي، حرك الشريط العلوي (مستوى الأسود) إلى اليسار بحيث يمكن رؤية الهيكل تماما على الخلفية، وترك الشريحة السفلي (مستوى أبيض) حيث هو (الشكل 2D). حدد B &amp; W، حدد الخلفية المظلمة. لم تقم بتحديد عتبة حساب لكل صورة ما لم يتم إجراء تعديلات مختلفة لكل شريحة، حدد خلفية سوداء. هذه العملية يخلق صورة جديدة من 8 بت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحذير: عتبة لا يمكن التراجع أو حفظها في ImageJ، وبالتالي فإن كومة متحد البؤر يجب أن تكون إعادة تحميل كل مرة هناك حاجة إلى التغيير. كتابة الأرقام ومحاولة إعدادات مختلفة حتى يتم تحقيق النتيجة المرجوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الإضافات&gt; عارض 3D&gt; عتبة 0، اختزال عامل 1 (الأفضل) أو 2 (جيد)، قم بإلغاء تحديد خانات اللون الأحمر والأزرق لجعل الانتاج 3D الخضراء - وإلا فإنه وايليرة لبنانية تنتج تقديم البيضاء - حدد تطبيق (لا تلقائي) (الشكل 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير، وتدور وتكبير صورة 3D باستخدام الماوس والضوابط لوحة المفاتيح (الشكل 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الصور الثابتة في أي لحظة باستخدام الخيار الالتقاط في القائمة. حجم مربع الصورة على الشاشة يملي أبعاد بكسل من الصورة أنتجت حتى إذا كان المطلوب على صورة عالية الدقة جعل مربع أكبر عن طريق سحب الركن الأيمن السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء فيلم 3D الغزل عن طريق اختيار عرض&gt; سجل 360 درجة دوران (الشكل 2G). التخلف التناوب إلى 2 درجة لكل خطوة، ولكن يمكن أن تتغير إلى 5 درجات على سبيل المثال، والتي من شأنها خلق أحجام ملف أصغر من ذلك بكثير، ولكن قد تضيف الاهتزاز إلى الرسوم المتحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الملف في واحدة من العديد من الأشكال المتاحة لمشاهدتها لاحقا مع لاعبين وسائل الإعلام، وتحميلها على شبكة الإنترنت، أو استخدام في العروض التقديمية. المصدر المفتوح وسائل الاعلام لاعب، VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">حزب التحرير</a>ن :/ / www.videolan.org / VLC / index.html و)، هو مجانا ويعالج أشرطة الفيديو هذه بشكل جيد للغاية. </li></ol>

<ol>
	<li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish.">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-&#946;+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-&#946; plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina.">Amyloid-&#946; increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+a+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo.">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development.">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li><li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging.">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy.">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

الأساليب المذكورة هنا توفير أساس للدراسات البصرية لنظام الأوعية الدموية في تطوير الزرد. عينات حية يمكن استخدامها لتقييم المعلمات الفسيولوجية، مثل معدل ضربات القلب والقلب حجم السكتة الدماغية، في حين عينات ثابتة يمكن استخدامها لعالية الدقة التصوير متحد البؤر. ذبابة الفاكهة وC. ايليجانس تسمح للتصوير الجسم كله، ولكن الزرد هي الفقاريات وتقدم نموذجا مفيدا للأنسجة الفقاريات، بما في ذلك نظام الأوعية الدموية مبطنة الخلايا البطانية. ويمكن لهذه الدراسات تتضمن خطوط المعدلة وراثيا كبيرا والموارد الجيني من مجتمع البحوث الزرد. إعادة الإعمار 3D وجعل من الصور متحد البؤر من الزرد الجنينية، كما هو موضح هنا، والسماح لنهج النظم لعلم الأحياء المتفرعة الأوعية الدموية والدم كثافة السفينة لم يكن ذلك ممكنا مع النماذج الحيوانية الكبيرة مثل الجرذان والفئران. كذلك، amniotes الزرد التطور في بيئة قابلة للتعديل (العازلة E3)، حيث يمكن للمرء بسهولة إضافة جhemicals التي تمنع إنزيمات معينة أو العمليات الأخرى التي تؤثر على التنمية الأوعية الدموية. تركيز وتوقيت التسليم الكيميائية يمكن تغييرها، مما يتيح للباحث ظروف العلاج لصقل. 1. التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها يمكن إدخال تعديلات على هذا النظام دمج خطوط المعدلة وراثيا من الزرد التي تعبر عن البروتينات الفلورية EGFP أو غيرها في مجموعة متنوعة من الأنسجة أو جهاز أو المنطقة أنماط محددة 10. علاوة على ذلك، تم مؤخرا نشر التوعية المستحدثة تحليل التغيرات في شبكية العين الزرد 5. مشاكل مع تصبغ في الأجنة الزرد الكبار في السن ويمكن تعويضها عن طريق عبور مع خطوط المعدلة وراثيا التي لا تنتج على نطاق وأصباغ أو صبغة الشبكية. مشاكل مع مضان تقلص ينتج عادة من ظروف غير ملائمة التثبيت. بارافورمالدهيد (4٪) لمدة 1 يوم هو الأمثل، ولكن قد مثبتات أقوى، مثل غلوتارالدهيد، رباعي أكسيد الأوزميوم أو الكحول،تدمير EGFP مضان. بعد التثبيت، يجب أن تبقى الأجنة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية ومحمية دائما من أشعة الشمس المباشرة. 2. حدود هذه التقنية جودة ودقة الأداءات 3D المنتجة مع هذا البروتوكول يعتمد على نوعية الصور ولدت. اختراق الضوء من خلال هذه الأجنة يقتصر على الطائرة منتصف السهمي باستخدام مجهر متحد البؤر القياسية. هذا الجانب من التصوير يحد من عمق التصوير في الأجنة الأكبر سنا والبالغين، ولكن أنظمة متعددة الفوتون المجهري أكثر تقدما تسمح للتصوير في أعماق أكبر. 3. أهمية فيما يتعلق بأساليب القائمة يوفر هذا البروتوكول مدخلا لتحليل شبكات الأوعية الدموية على مستوى النظم التي يمكن أن تتضمن حيوان بأكمله. كثيرا ما يعتمد التمثيل في وقت سابق من هذه البيانات على مجموعة من الصور التي وضعت معا، ولكنها توفر 3D تقديم أفضل قرار من العالقات المكانيةtionships المعنية. 4. التطبيقات المستقبلية والتطورات الجديدة في مجال التصوير ومعالجة الأنسجة توفير العديد من التطبيقات الجديدة لهذه الأساليب التي يمكن أن تتضمن الإدلاء الأجنة الأكبر سنا أو البالغين شفافة 11-14. سوف الشفافية المحسن زيادة كبيرة في اختراق الأنسجة بواسطة الليزر متحد البؤر ومتعددة الفوتون. أبعد من ذلك، لأن سرعة الكاميرات وأنابيب مضخم زيادة قد يكون من الممكن قريبا لإنتاج الاداءات 3D من الأسماك في الوقت الحقيقي، وتوفير البعد 4 عشر من التحليل. 5. خطوات حاسمة خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو إعداد للتصوير، والذي يتضمن تثبيت المناسبة. وينبغي أن يتم التصوير في أقرب وقت ممكن بعد التثبيت مع أهداف الجودة العالية التي لديها أفضل فتحات الرقمية المتاحة. يعتمد القرار على نظام التصوير المستخدمة، وأنظمة الجودة عالية جدا عادة ما تكون أفضل. توليد الاداءات 3D هو الذاكرة المكثفةلذلك أجدد، أجهزة الكمبيوتر الراقية مع كمية كبيرة من الذاكرة ومعالجات رسومات جيدة ويوصى. وقد تم تحسين نظام البيولوجيا البصرية الموصوفة هنا لالزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن EGFP في الخلايا البطانية في الأوعية الدموية، رغم أن هذه الأساليب يمكن أن تتكيف مع الأجنة وراثيا التي تعبر عن GFP، أو البروتينات الفلورية الأخرى، والسكان من الخلايا العصبية والعضلات والغدد أو أي عدد من الخلايا الأخرى. والميزة الرئيسية في العمل مع هذا النظام هو القدرة على دراسة ما يحدث في الجنين بأكمله في أي وقت خلال هذه الفترة التنموية، في الحيوانات ثابتة و / أو الحية.

الزرد توفير نظام قوي لدراسة البيولوجيا التطورية، والشفافية النسبية للأجنة التي هي قابلة للدراسات القائم على التصوير 1. وقد تم الآن استخدام الزرد كنموذج للتنمية الفقاريات على مدى عقود. Teleosts، بما في ذلك الزرد، لديها نظام الأوعية الدموية الفقارية مبسطة التي لا يوجد لديه homolog معقولة في اللافقاريات. يتم ضخ الدم من الغرفة الأمامية من حجرات القلب يومين من خلال الخياشيم، حيث يتم الاوكسيجين ذلك. الدم من الخياشيم يتقاطع في الشريان الأبهر الظهري ويمر عبر الشرايين التي تتفرع إلى سفن أصغر وأصغر، في نهاية المطاف التوصل إلى الشعيرات الدموية في أنسجة الجهاز. داخل الشعيرات الدموية الأكسجين يتم تحريرها ويتم امتصاص ثاني أكسيد الكربون. على الجانب الوريدي من الشعيرات الدموية تدفق الدم إلى الأوردة أكبر وأكبر ويوجه أخيرا في الغرفة الخلفية من القلب، حيث يكرر دورة. والزرد الكبار يمكن أن تضع 200 بيضة أو أكثر في وقت واحد، وانسه المخصبة، فإنها تتطور بسرعة 2. خلال يوم واحد محور الجسم ومتطورة، بما في ذلك عضلات هذا العقد ونقل الجنين داخل الغشاء حول المشيمي. من 2-7 أيام بعد الإخصاب (DPF) معظم أجهزة الجسم تطوير، بما في ذلك العينين والجهاز العصبي المركزي التي يمكن أن تنسق السباحة نحو الطعام أو بعيدا عن الضوء الساطع. تصل إلى 7 أجنة DPF هي صغيرة بما يكفي للسماح التصور مع المجهري. خطوط المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية يمكن تصوير مع مبائر أو مضان المجهري. يمكن إقران التصوير متحد البؤر مع برمجيات المصدر المفتوح 3 لإنشاء الاداءات 3D هياكل الأوعية الدموية كاملة في الأجنة الزرد التي توفر منظور بيولوجيا الأنظمة من تطوير الأوعية الدموية. والدراسات المعنية مع التغيرات في تعقيد الأوعية الدموية والدماغية تستفيد من هذا البروتوكول لأنها تسمح لإجراء تحليل مستوى أنظمة شبكات الأوعية الدموية 4،5. تجميع للطرق وتوفير المواردد للسماح لسهولة اعتماد وهذه التقنيات للدراسات التي تتطلب التصوير هياكل الأوعية الدموية في الزرد الجنينية. كفاءة التكلفة من الزرد كنموذج للحيوانات يتم الجمع بين تقنيات التصوير الناشئة لتوفير منصات جديدة تستخدمها لتقييم آثار عائية من المسارات الجزيئية في التنمية الفقاريات والتوازن.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

الزرد هي أداة قوية لدراسة البيولوجيا التطورية وعلم الأمراض في الجسم الحي. حجم صغير والشفافية النسبية للأجنة الزرد جعلها مفيدة بشكل خاص لفحص البصري للعمليات مثل القلب والأوعية الدموية التنمية. في العديد من الدراسات الحديثة تم استخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن EGFP في الخلايا البطانية في الأوعية الدموية لصورة وتحليل شبكات الأوعية الدموية المعقدة في الدماغ والشبكية، وذلك باستخدام متحد البؤر المجهري. وتقدم وصفا للتحضير، وعلاج الأجنة الزرد الصورة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر المعززة (EGFP)، ومن ثم توليد الاداءات 3D شاملة للنظام الدماغية. وتشمل بروتوكولات علاج الأجنة، والتصوير متحد البؤر، وبروتوكولات التثبيت التي تحفظ EGFP مضان. علاوة على ذلك، يتم توفير النصائح المفيدة حول كيفية الحصول على صور عالية الجودة من الهياكل الدماغية، مثل إزالة العين دون تلف الأنسجة العصبية في مكان قريب. المزالق المحتملةمع التصوير متحد البؤر وتناقش، جنبا إلى جنب مع الخطوات اللازمة لتوليد اعادة البناء 3D من مداخن صورة متحد البؤر باستخدام متاحة بحرية البرمجيات مفتوحة المصدر.

إعادة الإعمار 3D هياكل الأوعية الدموية يوفر منظور شامل وبصريا للاهتمام التنمية الزرد. أرقام أساليب 1 و 2 تظهر لأنها عادة القيام به. ويبين الشكل 3 عدة زوايا هياكل الأوعية الدموية في 6 DPF الجنين الزرد أن أعرب EGFP في الخلايا البطانية. مع اللون الأخضر أو ​​الأبيض الصلبة يمكن أن يكون من الصعب أن نقدر كثافة إشارة؛ الزائفة التلوين توفير كثافة صورة من الجدول نظرة المتابعة ويسمح أفضل عمق التصور عندما تتداخل الهياكل. مثال على شبه الملونة صورة 3D من الأوعية الدموية في 6 DPF يتم توفير الزرد في الشكل 4. يمكن استخدامها الإسفار التصوير الأجنة الحية لدراسة الخصائص الفسيولوجية التي تشمل العين وحركة الجسم، ونشاط القلب. أرقام 3 و 4 وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها مع ممثل هذه الأساليب، وذلك باستخدام خط الزرد المعدلة وراثيا<html> وصفها. القرار التصوير يعتمد على خصائص المجهر، ولكن سطوع إشارة EGFP كافية لجودة الصورة جيدة مع معظم الأنظمة التجارية. إعادة الإعمار وتقديم التمثيل 3D يتفق والخيارات في هذا البرنامج مفتوح المصدر تقديم نتائج جيدة باستمرار. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. إزالة العين. أ) الثابتة 3 DPF الجنين مع حاجة التنغستن وضعه بجانب العين. يتم قطع الأنسجة حول العين من هذا الموقف. B) العين هو يقع خارج ويتم قطع عضلات العين الأساسي والعصب البصري. يشار إلى محجر العين الفارغة مع دائرة متقطع. C) يتم تشغيل نفس الجنين أكثر ومزودة ميثيل السليلوز، مع العين سليمة مواجهة.<html> hres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2. خطوة بخطوة إعادة الإعمار 3D من صورة كومة متحد البؤر. A) الملف المفتوح (4104.1.ids) محملة داخل فيجي باستخدام الإضافات&gt; الامكنه&gt; Bioformat لتحديد باء) بعد العثور على شريحة مع المنطقة من الفائدة، يتم تحديد عتبة التعديل كما هو مبين. C) يتم ضبط عتبة إلى 214 باستخدام أعلى يتم تحديد وتطبيق المنزلق. يسمى المشاهد D) 3D كما هو مبين. E) يظهر إعادة الإعمار 3D من الزرد مع العين سليمة، لتحديد اتجاهاتها. F) تم تصغيرها الصورة وتدويرها. G) A 360 درجة دوران الفيلم يتم كما هو مبين.<html> res.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> الرقم 3. وجهات نظر من إعادة الإعمار 3D. أ) المنظور الإنسي من 6 DPF الجنين تصويرها مع 10x الهدف والفم هو على حق، وليس الخياشيم داخل الفم. B) الجانبي من نفس الجنين، علما الزعنفة هو حلقة في الوسط. C) نفس الجنين المصورة مع 20x والهدف، منظور وسطي، علما القرار الخيشومية. D) المنظور الجانبي من 20x والتصوير الهدف. الزعنفة هو على الحافة اليمنى من لوحة. E) عرض انتيرو-20x وسطي من التصوير موضوعية، علما الخياشيم داخل الفم. F) بطن من نفس الجنين تصويرها مع 20x والهدف، فإنه الرأس إلى اليمين. ملاحظة الأوعية الدموية على الكيس المحي في أسفل اليمين.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> الشكل 4. الاختلافات في كثافة 6 DPF الجنين. صورة لإعادة الإعمار 6 DPF باستخدام نظرة متابعة الجدول pseudocolor لكثافة الإشارة. وصفت الفم والدماغ والخياشيم والكيس المحي لتحديد اتجاهاتها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> الرقم 5. فيلم من الأوعية الدموية التي أعيد بناؤها في الزرد 4 DPF. تم تصويرها الأسماك عند 2.5 ميكرون. كانت الصورمن تصوير نصف الجنين. مقارنة مع الهياكل هياكل الأوعية الدموية في الزرد GSI المعاملة المنصوص عليها في الشكل 6. ملاحظة كثافة أقل من الأوعية الدموية في الرأس والخياشيم أكبر. (راجع &quot;Zfish_spin.avi&quot; ملف التكميلي تحت التحميل) <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> الرقم 6. فيلم 3D من الأوعية الدموية في جنين GSI المعاملة في 4 DPF. تم تصويرها الأسماك عند 2.5 ميكرون من خلال من الأفقي إلى خط الوسط. مقارنة هياكل الأوعية الدموية مع التحكم 4 DPF الأسماك هو مبين في الشكل 5. وتقوس الظهر وحجم أصغر هي نموذجية في الأجنة تعامل مع هذه المادة الكيميائية. (راجع &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; ملف التكميلي تحت التحميل)

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

يوصف التصوير التنمية الدماغية في الزرد اليرقات. كما يتم توفير التقنيات اللازمة لتسهيل 3D التصوير وتعديل وضع الدماغية باستخدام العلاجات الكيميائية.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  Western University of Health Sciences.  يوصف التصوير التنمية الدماغية في الزرد اليرقات. كما يتم توفير التقنيات اللازمة لتسهيل 3D التصوير وتعديل وضع الدماغية باستخدام العلاجات الكيميائية. 

Video: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissection من الأنسجة الجنينية العين اسماك الزرد

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

تحليل الجنينية واليرقات الزرد الهيكل العظمي Myofibers من الاستعدادات فصلها

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.