Die Autoren bedanken sich Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder unseres Labors, die diese Techniken entwickeln geholfen. Teilfinanzierung durch einen Zuschuss aus dem California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538) DE zur Verfügung gestellt.

1. Zebrafisch Haltung, Embryo-Generation, und Behandlung <ol><li> Führen Sie die folgenden Protokolle Zebrafisch unter der Leitung von einem institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss (IACUC) und innerhalb der Tierpflege Richtlinien der NIH oder anderen Regulierungsbehörden / Richtlinien. </li><li> Zebrafisch-Stämme, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren in bestimmten Geweben, Zellen oder Organe sind von der Zebrafisch International Resource Center (ZIRC). Zum Beispiel, Tg (kdr: EGPF) S843 EGFP in vaskulären Endothelzellen 6, die verwendet werden können, um eine vollständige 3D-Gefäßstrukturen zu erzeugen, wie in diesem Protokoll gezeigt auszudrücken. Andere Linien transgener Zebrafische sind von ZIRC. </li><li> Haus erwachsenen Zebrafisch in einem geeigneten Aquakultursystem, pH-Wert, Salzgehalt, Temperatur, Sauerstoff, Licht und anderen Umweltfaktoren 7 überwacht. Das hier gezeigte Zebrafisch wurden in einem Aquaneering Inc. System (San Diego, CA) bei 28,5 ° C mit einer 14 Stunden lig untergebrachtht/10 Stunden Dunkel-Zyklus. Feed-erwachsenen Zebrafisch eine ausgewogene Ernährung der Artemia und NRD 06.04 Fischfutter (Artemia-Direct, Ogden, Utah). </li><li> Erwachsene männliche und weibliche Zebrafisch-Zucht Alter sollten separat untergebracht werden Paarung erfolgreich zu erhöhen. </li><li> Stimulieren Eiablage und Befruchtung, indem Weibchen (2-4) und Männchen (4-6) zusammen in einer passenden Container, der eine Gitterboden mit Löchern groß genug für die Eier durchfallen hat, aber zu klein für die Zebrafisch Erwachsene weitergeben . Bis Paarungen am Abend vor Set; Eier werden in der Nähe der Dämmerung gelegt, in der Regel während der Tageslichtzyklus in der Intensität (Morgendämmerung) steigt langsam. Check für Eier an der Unterseite des Gegen Behälter alle 15-30 Minuten. </li><li> Sammeln Sie Eier mit einem Mesh-Sieb und sauber mit E3-Puffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4). Übertragen Sie die Eier zu 100 mm Kulturplatten mit E3 Pufferspeicher gefüllt und in einem 28 ° C-Inkubator. </li><li> Um Chemikalien, die cer ändern studierenebrovascular Verzweigung hinzufügen gewünschten chemischen Konzentrationen. Zum Beispiel kann neovasular Verzweigung mit γ-Sekretase-Inhibitor (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester) in DMSO solubilisiert 4, beginnend 24 induziert werden, Stunden nach der Befruchtung (hpf). Zu dieser Zeit-Punkt-Embryonen sind immer noch in dem Chorion, und viele Chemikalien können durch sie 8 weiterzugeben. Wenn ein Behandlungszustand hat Nerven-oder Motor-Effekte, die die Fähigkeit von Embryonen zu befreien von dem Chorion beeinträchtigen können, dann Embryonen sollte zwischen 24 und 48 hpf, die entweder mit einer Pinzette Pronase 2 getan werden kann, de-chorionated werden. Die Embryonen in den bereitgestellten Bilder gezeigt wurden von griff vorsichtig das Chorion mit zwei geschärften Pinzette und es zu zerreißen offenen dechorionated. </li><li> Falls erforderlich / wünschenswert, Pigmentbildung kann durch Zugabe von 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) an die E3-Puffer bei 24 hpf gehemmt werden. </li></ol> 2. Konfokale Bildgebung von zerebrovaskulären Structnahmen in Festzebrafischembryonen <ol><li> Sacrifice Embryonen in 250 mg / L Tricainmethansulfonat, und befestigen Sie sie durch Eintauchen in 2-4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C Behälter mit fluoreszierenden Embryonen in Folie eingewickelt werden. Einmal festgelegt, sind Embryonen in PBS bei 4 ° C gelagert werden, bis abgebildet - EGFP-Fluoreszenzintensität wird weniger aufgelöst nach etwa einer Woche, aber die Morphologie (wie im Hellfeld aus gesehen) ist viel länger erhalten. </li><li> Bereiten Sie den Embryo, indem zuerst ein Auge mit einem geschärften Wolfram Nadelbefestigung. Um den Anschluss des Augengewebes ersten Cut schneiden Sie dann die Muskeln, geschnitten und schließlich den Sehnerv das Auge zu verdrängen. (Hinweis: Wenn die Abbildung beide Seiten gewünscht, beide Augen entfernen.) </li><li> Sobald das Auge entfernt wird, montieren Sie den Embryo auf einem Deckglas mit einem Rückgang von 3% Methylcellulose. Ausrichten der Embryo, so dass die Seite mit dem Auge entfernt wird, mit Blick auf das Deckglas und ist so nah an die Glas wie möglich. Decken den gesamten Embryo mit methylcellulose, um ein Austrocknen zu verhindern, während der Bildgebung. </li><li> Bild der montierte Embryo sofort mit einem inversen konfokalen Mikroskop mit einem hochwertigen Plan Apo 20x Objektiv (numerische Apertur = 0,75 oder besser) ausgestattet. Diese Konfiguration ist bevorzugt, ein nicht-invertiertes Mikroskop, das Anordnen der Embryo zwischen zwei Glasflächen, und Pressen des Embryos vor dem oberen Glas erfordern würde. </li><li> Sammeln optische Schnitte in Schritten von 1 um mit einem mittleren oder großen Blendeneinstellung. Größeren Schritten von 2,5 &amp;mgr; m können ebenfalls verwendet werden, aber es kann schwieriger sein, um die räumliche Ordnung der kleineren Objekte zu bestimmen. Kleine Öffnungen erzeugen schärfere Detail, aber die längeren Scans erforderlich ist, kann EGFP bleichen und auch die Tiefe der Bildgebung in den Embryo, die erreicht werden kann, zu begrenzen. Konfokales Mikroskop ermöglicht Abbildungs ​​etwa auf halbem Weg durch einen Embryo. </li><li> Wenn Bildgebung des gesamten Fisch gewünscht ist, entfernen Sie beide Augen von Anfang an (siehe Hinweis in Schritt 3.2), drehen Sie den Embryo nach imaging der einen Seite und wiederholen Sie die Schritte von 2,3 bis 2,5 für die Gegenseite. </li></ol> 3. 3D-Rekonstruktion der embryonalen Zebrafisch Cerebrovasculature <ol><li> Verwenden Sie den Fidschi-Verteilung 3 von Open-Source-ImageJ (http://fiji.sc), die für die 3D-Renderings optimiert ist kostenlos und mit PC-, Mac-und Linux-Computern kompatibel. </li><li> Import konfokalen Stapeln nach Fidschi, indem Sie auf Plugins&gt; LOCI&gt; BioFormats Importeur 9 wählen Sie dann die konfokale Datei, zB name.ids für Nikon Stapel (2A). Wählen Sie Ansicht Stack mit Hyperstack, Farbmodus: Graustufen, automatische Skalierung überprüfen, überprüfen aufgeteilt Kanäle. </li><li> Diese Auswahl wird vier separaten Kanal-Panels zu öffnen; für EGFP nur einer benötigt werden, in der Regel die dritte nach unten. Schließen Sie die anderen drei Platten (rot, blau und alpha) so dass die 16-Bit-Bild mit einem langen Namen, gefolgt von C = 1 (Abbildung 2A). </li><li> Stellen Schwelle durch Scannen wenn das Bild mit der Bildlauf tab entlang der Unterseite, eine Scheibe, die die Region oder die Struktur von Interesse ist zu finden, dann gehen dem Bild&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert (Abbildung 2C). </li><li> In dem Panel, das kommt, schieben Sie die obere Leiste (Schwarzwert) nach links, so dass die Struktur kann sehr gut über Hintergrund gesehen werden, und lassen den Boden Schieber (Weißwert), wo es ist (Abbildung 2D). Wählen Sie B &amp; W, wählen Dunkler Hintergrund. Sie berechnen Threshold für jedes Bild wählen nicht, es sei denn andere Einstellungen erforderlich sind für jede Scheibe, wählen Schwarz Hintergrund. Dieser Prozess schafft eine neue 8-Bit-Bild. </li><li> WARNUNG: Threshold kann nicht rückgängig gemacht werden oder in ImageJ gespeichert, so dass die konfokale Stapel müssen jedes Mal eine Veränderung notwendig ist neu geladen werden. Notieren Sie sich die Nummern und probieren Sie verschiedene Einstellungen, bis das gewünschte Ergebnis erreicht ist. </li><li> Zum Plugins&gt; 3D Viewer&gt; Schwellwert 0, Resampling Faktor 1 (am besten) oder 2 (gut), deaktivieren Sie die roten und blauen Farbfelder, um eine grüne 3D-Ausgabe zu machen - sonst ist es will produzieren einen weißen Rendering - wählen Sie Apply (nicht Auto) (2E). </li><li> Drehen, drehen und zoomen Sie das 3D-Bild mit der Maus und Tastatursteuerung (2F). </li><li> Speichern von Standbildern an jedem Punkt mit der Option Capture im Menü. Die Größe des Bildfeld auf dem Bildschirm schreibt Pixelmaße des Bildes erzeugt, so, wenn ein Bild mit hoher Auflösung gewünscht Make die Box größer durch die untere rechte Ecke ziehen. </li><li> Erstellen Sie ein 3D-Film Spinn über Ansicht&gt; Aufnahme 360 Grad Drehung (2G). Rotation standardmäßig auf 2 Grad pro Schritt, aber es kann bis 5 Grad zum Beispiel, die viel kleinere Dateigrößen erstellen wird geändert, kann aber Ruckeln, um die Animation hinzuzufügen. </li><li> Speichern Sie die Datei in einem von mehreren verfügbaren Formate für die spätere Betrachtung mit Media Player, das Hochladen auf das Internet oder die Verwendung in Powerpoint-Präsentationen. Die Open-Source-Media-Player, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), ist kostenfrei und verarbeitet diese Videos sehr gut. </li></ol>

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Es gibt nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine Grundlage für die visuelle Untersuchungen des Gefäßsystems bei der Entwicklung von Zebrafisch. Lebende Exemplare können verwendet werden, um physiologische Parameter, wie die Herzfrequenz und die Herzschlagvolumen zu beurteilen, während feste Proben für hochauflösende konfokale Bildgebung. Drosophila und C eingesetzt werden elegans ermöglichen Ganzkörper-Bildgebung, aber Zebrafisch sind Wirbeltiere und ein nützliches Modell für Wirbeltiergewebe, einschließlich einer Endothelzellen ausgekleidet Gefäßsystem. Diese Studien können erhebliche transgenen Linien und genomische Ressourcen aus dem Zebrafisch-Forschung zu integrieren. 3D-Rekonstruktion und Wiedergabe von konfokalen Bildern aus embryonalen Zebrafisch, wie hier beschrieben, ermöglichen einen systembiologischen Ansatz, um Gefäßverzweigung und Blutgefäßdichte, die nicht mit größeren Tiermodellen, wie Ratten und Mäusen ist möglich. Ferner ist, wie Zebrafisch Amnioten entwickeln in einer modifizierbaren Umwelt (E3-Puffer), wo man leicht hinzufügen chemicals, die bestimmte Enzyme oder andere Prozesse, die Gefäßentwicklung beeinflussen zu hemmen. Die Konzentration und der Zeitpunkt der Lieferung kann chemisch verändert werden, so dass die Forscher die Feinabstimmung Behandlungsbedingungen. 1. Änderungen und Fehlersuche Modifikationen dieses Systems können transgene Linien, die EGFP Zebrafisch oder andere fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, in einer Vielzahl von Gewebe, Organ oder einer Region spezifische Muster 10 zu integrieren. Ferner Analyse der neovaskulären Änderungen im Zebrafisch Retina wurde kürzlich veröffentlicht 5. Probleme mit Pigmentierung bei älteren Embryonen und erwachsenen Zebrafisch kann durch Kreuzung mit transgenen Linien, die Skala Pigmente oder Netzhautpigment produzieren nicht kompensiert werden. Probleme mit verminderter Fluoreszenz typischerweise vor unangemessenen Bedingungen Fixierung führen. Paraformaldehyd (4%) für 1 Tag ist optimal, aber stärker Fixiermittel, wie Glutaraldehyd, Osmiumtetroxid oder Alkohol,zerstören EGFP Fluoreszenz. Nach der Fixierung sollte Embryonen in PBS bei 4 ° C aufbewahrt werden und immer vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt. 2. Einschränkungen dieser Technik Die Qualität und Auflösung der 3D-Renderings mit diesem Protokoll erzeugt, hängt von der Qualität der Bilder erzeugt. Lichtdurchlässigkeit durch diese Embryonen zu der Mitte Sagittalebene mit einem Standard-Konfokalmikroskop beschränkt. Dieser Aspekt der Bild begrenzt die Tiefe der Bildgebung bei älteren Embryonen und Erwachsene, aber mehr erweiterte Multi-Photonen-Mikroskopie-Systeme ermöglichen für die Bildgebung in größeren Tiefen. 3. Bedeutung in Bezug auf bestehenden Methoden Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die Analyse von Blutgefäßnetze auf Systemebene, die eine ganze Tier integrieren können. Frühere Darstellungen solcher Daten oft angeführte Reihe von Bildern zusammen gelegt, aber 3D-Rendering bietet eine bessere Auflösung der räumlichen Beziehungenhungen beteiligt. 4. Zukünftige Anwendungen Neue Entwicklungen in der Bildgebung und Gewebeverarbeitung bieten viele neue Anwendungen für diese Methoden, die zählen können machen älteren Embryonen oder Erwachsene transparent 14.11. Verbesserte Transparenz Gewebepenetration deutlich erhöhen durch konfokale und Multiphotonen-Laser. Ferner ist, wie die Geschwindigkeit der Kameras und Photomultiplier-Röhren zu erhöhen kann es bald möglich sein wird, um 3D-Renderings von Fischen in Echtzeit zu erzeugen, die eine 4. Dimension Analyse. 5. Kritische Schritte Ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll ist die Vorbereitung für die Bildgebung, die die ordnungsgemäße Fixierung beinhaltet. Imaging sollte nach der Fixierung mit hohen Qualitätszielen, die die besten numerischen Aperturen zur Verfügung haben so schnell wie möglich durchgeführt werden. Auflösung ist abhängig von der Abbildungssystem verwendet werden, sind so hoch, Qualitätssysteme in der Regel besser. Generieren von 3D-Renderings ist speicherintensivfür so neuere, High-End-Computer mit einer großen Menge an Speicher und gute Grafik-Prozessoren empfohlen. Die hier beschriebene optische System ist für die Biologie transgenen Zebrafisch, das EGFP in vaskulären Endothelzellen exprimieren optimiert, wenn diese Verfahren auf die GFP-transgenen Embryos oder andere fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, in Populationen von Neuronen, Muskeln, Drüsen oder einer beliebigen Anzahl von anpassen anderen Zellen. Der große Vorteil bei der Arbeit mit diesem System ist die Möglichkeit, zu jeder Zeit während dieser Entwicklungsphase zu studieren, was in der gesamten Embryo, in fest-und / oder lebenden Tieren.

Zebrafisch bieten ein leistungsfähiges System zur Entwicklungsbiologie zu studieren, und die relative Transparenz ihrer Embryonen zugänglich ist Imaging-basierte Studien ein. Der Zebrafisch ist nun als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren seit Jahrzehnten eingesetzt. Knochenfischen, einschließlich Zebrafisch, eine vereinfachte Wirbelkreislauf-System, die keine angemessenen Homolog in Wirbellosen hat. Blut wird aus der vorderen Kammer eines Zwei-Kammer-Herz durch Kiemen, wo es mit Sauerstoff angereichert wird, gepumpt. Blut von den Kiemen konvergiert an der dorsalen Aorta und durch Arterien, Zweig in immer kleinere Schiffe erreicht schließlich Kapillaren in Organgeweben. Innerhalb Kapillaren Sauerstoff freigesetzt und Kohlendioxid absorbiert. Auf der venösen Seite des Blut Kapillaren fließt in immer größeren Venen und wird schließlich in die hintere Kammer des Herzens, wobei der Zyklus wiederholt gezogen. Ein erwachsener Zebrafisch kann 200 oder mehr Eier auf einmal legen und ONCE befruchtet, entwickeln sie schnell zwei. Innerhalb eines Tages die Körperachse ist gut entwickelt, einschließlich der Muskeln, die Vertrags-und um den Embryo innerhalb der Chorion-Membran zu bewegen. Von 2-7 Tage nach der Befruchtung (DPF) die meisten Körpersysteme zu entwickeln, einschließlich der Augen und des Zentralnervensystems, die koordinieren können schwimmen in Richtung Essen oder weg von hellem Licht. Bis zu 7 dpf Embryonen sind klein genug, um für die Visualisierung mit der Mikroskopie zu ermöglichen. Transgene Linien, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, können mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie oder abgebildet werden. Die konfokale Bildgebung kann mit Open-Source-Software 3 bis 3D-Renderings von kompletten Gefäßstrukturen in Zebrafischembryonen, die einen systembiologischen Perspektive der Gefäßentwicklung bieten erstellen gepaart werden. Mit Veränderungen in der Gefäß-und zerebrovaskuläre Komplexität betreffenden Studien werden von diesem Protokoll profitieren, da sie ermöglicht eine Analyse der Systemebene Gefäßnetze 4,5. Eine Zusammenstellung von Methoden und Ressourcen zur Verfügung stellend für die einfache Annahme und dieser Techniken für Studien, die Abbildung von Gefäßstrukturen in embryonalen Zebrafisch erfordern können. Die Kosteneffizienz der Zebrafisch als Tiermodell ist mit Schwellen Imaging-Technologien kombinieren, um neue Plattformen, mit dem angiogenen Effekte der molekularen Signalwege in der Wirbeltierentwicklung und Homöostase beurteilen zu können.

<table><tbody><tr><td>N &amp;ndash; Phenylthiourea&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar, catalog #41972</td><td></td><td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>E3 buffer</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX/DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td></tr><tr><td>24 well plates&amp;nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td><td></td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&amp;nbsp;</td><td>VWR, cat #414004-001</td><td></td><td>VWR disposable transfer pipettes</td></tr><tr><td>Methyl-cellulose&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar, cat#43146</td><td></td><td>3% in E3 buffer</td></tr><tr><td>NRD 4/6 Fish food&amp;nbsp;</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Dried</td></tr><tr><td>Brine shrimp</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Live</td></tr><tr><td>Tungsten wire&amp;nbsp;</td><td>Small Parts # TW-016-60</td><td></td><td>0.016&amp;rdquo; OD</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td></tr></tbody></table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

Zebrafische sind ein mächtiges Werkzeug, um die Entwicklungsbiologie und Pathologie in vivo zu untersuchen. Die geringe Größe und die relative Transparenz der Zebrafisch-Embryonen machen sie besonders geeignet für die visuelle Untersuchung der Prozesse, wie Herz-und Gefäßentwicklung. In mehreren aktuellen Studien wurden transgene Zebrafisch, die EGFP in vaskulären Endothelzellen exprimieren zur Abbildung und Analyse komplexer Gefäßnetze im Gehirn und Netzhaut, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Beschreibungen sind vorgesehen, um vorzubereiten, zu behandeln und Bild Zebrafischembryonen, die verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) ausdrücken, und dann erzeugen umfassende 3D-Renderings des zerebrovaskulären Systems. Protokolle umfassen die Behandlung von Embryonen, konfokale Bildgebung, und die Fixierung Protokolle, die EGFP-Fluoreszenz zu bewahren. Weiterhin werden nützliche Tipps für die Beschaffung qualitativ hochwertiger Bilder von zerebrovaskulären Strukturen, wie das Auge die Entfernung ohne Beschädigung in der Nähe von Nervengewebe zur Verfügung gestellt. Mögliche Fallstrickemit konfokaler Bildgebung diskutiert, zusammen mit den notwendigen 3D-Rekonstruktionen aus konfokalen Bildstapeln mit frei verfügbaren Open-Source-Software erzeugen Schritte.

3D-Rekonstruktion von Gefäßstrukturen bietet eine umfassende und visuell interessante Perspektive der Zebrafisch-Entwicklung. Abbildungen 1 und 2 zeigen die Methoden, wie sie in der Regel getan. Abbildung 3 zeigt mehrere Winkel von Gefäßstrukturen in einem 6 dpf Zebrafisch-Embryo, der EGFP in Endothelzellen exprimiert. Mit einem grün oder weiß es schwierig sein kann, um die Signalstärke zu schätzen wissen; Pseudo-Färbung liefern Bildintensität aus einer Look-up-Tabelle und ermöglicht eine bessere Tiefenwahrnehmung, wenn Strukturen überlappen. Ein Beispiel einer Pseudo-farbige 3D-Bild des Gefäßsystems in einem 6 dpf Zebrafisch ist in Fig. 4 vorgesehen. Können Fluoreszenz-Bildgebung von lebenden Embryonen verwendet werden, um physiologische Merkmale, Augen-und Körperbewegung gehören zu studieren, und die Herzaktivität. Fig. 3 und 4 zeigen, mit diesen Methoden erhalten repräsentative Ergebnisse mit Hilfe der transgenen Zebrafischlinie<html> beschrieben. Imaging Auflösung hängt von Mikroskop Eigenschaften, aber die Helligkeit des EGFP-Signal ist ausreichend für eine gute Bildqualität mit den meisten kommerziellen Systemen. Wiederaufbau und Rendering von 3D-Darstellungen ist konsistent und Optionen innerhalb dieser Open-Source-Software bieten durchweg gute Ergebnisse. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Augenentfernung. A) Eine feste 3 dpf Embryo mit einer Wolfram Bedarf positioniert neben dem Auge. Das Gewebe wird um das Auge von dieser Position. B geschnitten) Das Auge ist fällt aus und die zugrunde liegenden Augenmuskeln und Sehnerv geschnitten werden. Die leere Augenhöhle ist mit gestrichelten Kreis angedeutet. C) Das gleiche Embryo wird umgedreht und mit Methyl-Cellulose-montiert, mit dem intakten Auge nach oben.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> 2. Schritt-für-Schritt-3D-Rekonstruktion eines konfokalen Bildstapels. A) Öffnen Sie die Datei (4104.1.ids) in Fidschi mit Plugins&gt; LOCI&gt; Bioformat an. B) Nach der Feststellung ein Stück mit dem interessierenden Bereich auswählen geladen ist, wird Schwelleneinstellung wie gezeigt. C) ausgewählt wird Threshold auf 214 mit dem oben angepasst Schieberegler und gelten gewählt. D) 3D-Viewer wird aufgerufen, wie dargestellt. E) Die 3D-Rekonstruktion eines Zebrafisches mit dem Auge intakt, zur Orientierung. F) Das Bild wurde gezoomt und gedreht. G) eine 360-Grad-Drehung Film gezeigt hergestellt wird, wie dargestellt.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3. Perspektiven aus 3D-Rekonstruktion. A) Medial Sicht von 6 dpf Embryo mit 10-fach Objektiv abgebildet wird, ist Mund auf der rechten Seite, nicht Kiemen in den Mund. B) Seiten des gleichen Embryos ist Note Flosse eine Schleife in der Mitte. C) Gleiche Embryo mit 20x-Objektiv abgebildet wird, medialen Perspektive, Anmerkung Kiemenauflösung. D) Seitliche Sicht der 20x-Objektiv-Bildgebung. Die Flosse ist am rechten Rand des Panels. E) Antero-medial von 20x-Objektiv Bildgebung, Anmerkung Kiemen in den Mund. F) Abdomen des gleichen Embryos mit einem 20x-Objektiv, Kopf nach rechts abgebildet. Hinweis Gefäß auf dem Dottersack unten rechts.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4. Unterschiede in der Intensität 6 dpf Embryo. Bild von einem 6 dpf Rekonstruktion mit Pseudo Look-Up-Tabelle für Signalintensität. Mund-, Hirn, Kiemen und Dottersack sind zur Orientierung gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Film des rekonstruierten Gefäßsystem in einem 4 dpf Zebrafisch. Der Fisch wurde auf 2,5 um abgebildet. Die Bilder warenAbbilden von einer Hälfte des Embryos. Vergleichen vaskulären Strukturen mit Strukturen in einer GSI-behandelten Zebrafisch in Abbildung 6 vorgesehen. Beachten Sie die geringere Dichte der Blutgefäße im Kopf und größeren Kiemen. (Siehe &quot;Zfish_spin.avi&quot; ergänzende Datei unter Downloads) <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Abbildung 6. 3D Movie des Gefäßsystems in einer GSI-behandelten Embryo bei 4 dpf. Der Fisch wurde auf 2,5 um durch von lateral nach Mittellinie abgebildet. Vergleichen Gefäßstrukturen mit der Steuerung 4 dpf Fisch in Abbildung 5 dargestellt. Die gewölbte Rückseite und kleinere Größe typisch in Embryonen mit dieser Chemikalie behandelt. (Siehe &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; ergänzende Datei unter Downloads)

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Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Aufrufe.  Western University of Health Sciences.  Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden. 

Serie: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologie

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neurowissenschaften

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...