מימון עבור עבודה זו סופק על ידי מאטה גארנט ורודני וויליאמס קרן זיכרון לפרויקט מענק לר &#39;לים ומחנה AJ.

1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים התקבלו ממרכז מכרסמים האוסטרלי (ARC; פרת&#39;, אוסטרליה) ונערכו באוניברסיטת בית החיות בוש סידני על מחזור אור / חושך של 12 שעות נורמלי עם העשרה סביבתית. כל הניסויים שתוארו אושרו על ידי ועדת אתיקה של אוניברסיטת סידני בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי זכרים ונקבה (C57/Bl6) שמשו לכל הניסויים שכן זן זה משמש בדרך כלל כרקע למניפולציה גנטית, ויכולים להיחשב שווה הערך ל wildtype 8-9. </li></ol> 2. הכנת רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 300 מ&quot;ל של נוזל מבוסס גליצרול מלאכותי השדרתי (ACSF) בהיקף של (מ&quot;מ): 26 3 אא NaHCO, 11 גלוקוז, 250 גליצרול, 2.5 KCl, 1.2 2 PO 4, 1.2 MgCl 2, ו -2.5 CaCl 2. לפני התוספת של CaCl 2, גז הפתרון עם carbogen (95% O 2 ו 5% CO 2) להקים apמשקעים סידן H של 7.4 ולהימנע (עננות). להקפיא את הפתרון במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, כך שנוצר תרחיף קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק לטשטש את העכברים עם קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) (פרנל, אלכסנדריה, אוסטרליה) באמצעות זריקה תוך הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהרפלקסים קמצוץ אחורי-גפיים הם עכברים לערוף נעדרים באמצעות מספריים נירוסטה חדים ולעשות חתך בעור sagittal באמצעות סכין גילוח (מעוגל # 22) כדי לחשוף את הגולגולת. בשלב זה ובשלבים 2.3-2.8 קמרון הגולגולת, המוח ומנגנון שיווי משקל בסיסי צריכים להישמר כקריר ככל האפשר על ידי יישום רגיל של ACSF קר כקרח על הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הזרוע המחודדת של מספריים דפוס רגילים (FST, צפון ונקובר, קנדה) לעשות חתך קטן בגולגולת במבדה ולחתוך לאורך תפר sagittal. להבטיח כי המוח אינו &quot;נגרר&quot; על ידי להב הגזירה במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקלף את העצמות הקודקודית מרחק רוחבי והעצם posterio העורפיrly באמצעות רדוד עיקול פירסון rongeurs (FST). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרית נירוסטה קטנה לאחר מכן נעשה שימוש כדי להרים את המוח בעדינות מפני השטח של גולגולת fossae האמצעית והאחורי, ואת העצב החשוף vestibulocochlea (CNVIII) באמצע הדרך בין האוזן הפנימית וגזע המוח עם זוג המספריים איריס בסדר לחתוך. חיתוך עצב זה ממזער מתח מיותר על האקסונים של afferents הראשונית וקשריהם עם תאי שיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות חיתוך רוחב של CN VIII מוח מוסר בטוטו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוך שיווי המשקל הוא כעת בבירור בפוסה גולגולתי באמצע, עם השבלול מצביע anteromedially. Rongeur שני צדי מבוך שיווי המשקל לפני שמוציא בעדינות על ידי אחיזה בתעלת חצי עגולה הקדמית ומושך רוחבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המבוכים הניכרים (איור 1) בצלחת ניתוחים המכילות ACSF המתואר בסעיף 2.1 קר כקרח, הומתו בגז ברציפות. תחת stereomicroscope, להחזיק את המבוך כדיהבסיס של המנה על ידי אחיזה בשבלול האוזן. שימוש במלקחיים בסדר לגרד ממנו על העצם שמעל תעלת חצי עגול ampulla הקדמי. ברגע שחור קטן בעצמות מושגת מתחיל קפיצי העצם מampulla. יש לנקוט זהירות לא לדחוף את המלקחיים באמצעות העצם כמו זה יכול לגרום נזק למבוך הקרומי הבסיסי והאפיתל החושי. המשך הליך זה עד ששתי קדמי וצינוריות קרומיות בצורה חצי עיגול אופקית סמוכות וampullae נחשפים (איור 2). </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> איור 1. מבוך עכבר שיווי המשקל המבודד. א לוח שמאלי) ייצוג סכמטי של מבוך שיווי משקל העכבר הבודד. נקודות חשובות של התייחסות לגישה האפיתל החושית שיווי המשקל, בתעלות בצורה חצי עיגול השבלול, קדמית, ואופקיים הן מעבדהeLED. כוכביות מצביעות ampulla תעלת חצי עגול המכיל את האפיתל החושי שיווי המשקל. ב &#39; פנל) Photomicrograph זכותו של מבוך שיווי המשקל המבודד מעכבר בן חודש 1. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> איור 2. החשיפה של שיווי משקל המבוך הקרומי. העצם שמעל תעלת ampullae חצי עגול הקדמי והאופקי כבר גרד משם כדי לחשוף את ampullae הקרומי השחור / חום מנומר ועצבי ampullary נלווים (CNVIII). סכמטי בפנל התחתון מייצג את המבנים באזור המסומן של photomicrograph ומציג את מערכת היחסים של צינורות תעלת החצי העגולים לampullae וCNVIII. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות להרים ampullae וutricle המשויך מן המבוך הגרמי, על מנת להבטיח שהאזור המרכזי של ampullae (containing האפיתל החושית) לא ניזוק. בחלק מהמקרים את החלק הפרוקסימלי של הצינור הקרומי חצי עגול ייתכן שיהיה הצורך לגזור במספריים איריס לשחרר ampullae מהעצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השלישייה המכילה ampullae שתיים וutricle לתוך צלחת פטרי מלאה במדיום התרבות של ליבוביץ L-15 (סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי). השתמש בסיבים אופטיים ל&quot; תאורה אחורית &quot;את הרקמה. זה מאפשר הדמיה ברורה של Crista המכילה האפיתל החושית בתוך ampullae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך בזהירות חתך ב&quot; גג &quot;המנומר של utricle עם המספריים איריס המשובחים. המשך דרך חתך זה הגג הקדמי ולאחר מכן ampullae האופקי. הפוך את החתך קרוב לקצה של האפיתל החושית ככל האפשר מבלי ליצור קשר עם אותו (איור 3 א). ודא שאין חתיכות של קרום שמעל האפיתל החושית (איור 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ההכנה השלמה למחצה המבודדת בגלאס קטןחדר הקלטה של ​​בעל תחתית מלא בתקשורת L-15. להכביד הכנה באמצעות רשת של סיבי ניילון עדינים המובטחים לחוט פלטינה בצורת U שטוחה (איור 3). באופן אידיאלי, את הסיבים של הרשת לא צריכים לשכב על האפיתל החושית, עם זאת בחלק מהמקרים שבם נדרש יותר יציבות, סיב בודד transecting האפיתל החושית אולי עדיפה. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> איור 3. ההכנה למחצה ללא פגע המבודדת של ייצוג שיווי המשקל החושי האפיתל. א סכמטי של ההכנה למחצה ללא פגע ותצורת אלקטרודה. Ampulla שמעל Crista כבר &quot;דה גג&quot; לחשוף את פני השטח של האפיתל החושית (ירוק). ב Photomicrograph של ההכנה למחצה ללא פגע &#39;השלישייה&#39; מראה Crista (HC) הקדמי (AC) והאופקי (utricle טשטש להיותאחורי AC). שימו לב לסיבי הניילון משמשים לאבטחת ההכנה לבסיס של חדר ההקלטה. בר סולם:. 100 מיקרומטר ג האלקטרודה הקלטה ממוקמת בתא שיער שיווי משקל פרט. בר סולם: 15 מיקרומטר. 3. Electrophysiology <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse ההכנה למחצה השלמה עם חומץ ברציפות L-15 בינוניות. התקשורת מכילה אינדיקטור pH (פנול אדום) וצבע של המדיום צריך להיות במעקב לאורך כל ההקלטות. ה-pH עם חמצן צריך להיות 7.3-7.4 ומתאימה לצבע אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן pipettes הקלטה מ -1.5 מ&quot;מ (1.19 מזהה מ&quot;מ) זכוכית ורוסיליקט באמצעות פרוטוקול שני שלבים (שלב 1 חום: 72; וחום צעד 2: 50) על חולץ micropipette (Narishige, יפן, דגם PP-830) כדי להשיג עכבה סופית של 3-4 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שוק של פיפטה עם 3-4 מ&quot;מ של פתרון הפנימי מבוסס אשלגן המכיל פלואוריד (מ&quot;מ) 110 KF, 12 KCl, KOH 27, NaCl 1, 10 HEPES, 10 EGTA, 1.8 MgCl 2,3 D-גלוקוז, ו2 Na-ATP; pH 7.4 עם KOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עטוף את השוק של 2-3 פעמים טפטפו והכי למטה ועד לקצה ככל האפשר עם רצועה דקה של parafilm כדי לבודד את האלקטרודה ולהקטין קיבול פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את פיפטה מעל האפיתל החושית בהגדלה צריכת חשמל נמוכה (5X) במיקרוסקופ זקוף (אולימפוס BX51). לעבור למתח גבוה (40X) ולדמיין תאי שיער שיווי המשקל בודדים עם מצלמת CCD מצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עמדה על הממברנה של תא שיער דמיינו (איור 3 ג) באמצעות micromanipulator (סאטר מכשירים, קליפורניה, ארה&quot;ב). ברגע שחותם gigaohm מושגת, קרע קרום התא עם כמות קטנה של לחץ שלילי מיושם דרך יציאת יניקה על בעל פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הקלטות מהדק מתח כל התא בשימוש בטכניקות סטנדרטיות 8-9. </li></ol> 4. שני פוטונים במיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח 0.9% מכילות 5 מ&quot;מ אורגון גרין488 BAPTA-1 (OGB-1; מלח hexapotassium; Invitrogen, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם עדיין מתחת למים, מניח את ההכנה &quot;דה הגג&quot; חצי השלמה השלישייה על גבי פיסה קטנה של נייר סינון (4X4 מ&quot;מ, 0.8 מיקרומטר עבה; Millipore, גרמניה) להבטיח כי האפיתל החושית היא בלא הפרעה מלמעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את נייר הסינון והעריכה על גבי האלקטרודה מלוחה כיסתה בסיס הפלטינה (7 μl) של electroporator בהיקף של שילוב של גנרטור ודופק מגבר בפס רחב, ולכסות עם 5 μl נוסף של פתרון 5 מ&quot;מ של הסיד הסינטטי מחוון הצבע אורגון גרין 488 BAPTA-1 (איור 4). </li></ol><img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> איור 4. electroporation גורפת. א סכמטי המציג חתך של תצורת electroporation. ההכנה למחצה ללא פגע (*) מונחת על פיסת נייר סינון שקועה בdy הסידדואר (אורגון גרין 488 BAPTA-1) ולהחיל נוכחי בין 2 אלקטרודות פלטינה. מעובד מתוך Briggman ואוילר, 2011 10. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא במקביל האלקטרודה הפלטינה העליונה עם אלקטרודה הבסיס במרחק של כ 2 מ&quot;מ, נזהר שלא לשבש את הכיוון של ההכנה, כאשר קשר עם פתרון BAPTA-1 אורגון גרין 488 הוא עשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור דופק נוכחי קצר על פני ההכנה (פרמטרים לנוכחיים; 13 V, 10 רוחב פולס אלפיות שני, תדירות הרץ 1, 10 פעימות כיכר גל) 10-11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלק התחתון של תא הקלטת תחתית זכוכית מלא עם מדיום L-15, מקום טיפה קטנה של שמן סיליקון ועמדת ההכנה למחצה השלמה של עליה, שוב על מנת להבטיח כי האפיתל החושית היא בלא הפרעה מלמעלה. כדי להבטיח יציבות לאורך הדמיה, להחליף את רשת הניילון על ההכנה כפי שתואר לעיל (נקודת 2.13 ראה מסגרת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לבצע הקלטות אופטיות של ספונטניפעילות בסידן שונה מס, אגרות האפיתל החושית (איור 7) תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים להדמית 10-11. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses.">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li><li>Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+pre-+and+post-synaptic+recording+from+the+peripheral+vestibular+calyx+and+its+included+type+I+hair+cell.">Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell.</a> , (2009).</li><li>Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+dependent+currents+in+type+I+and+II+hair+cell+and+calyx+terminals+of+primary+afferents+in+an+intact+in+vitro+mouse+vestibular+crista+preparation.">Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation.</a> , (2009).</li><li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista.">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> , (2010).</li><li>Songer, J. E., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+the+mammalian+saccule.">Transduction in the mammalian saccule.</a> , (2010).</li><li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear.">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li><li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista.">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li><li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro.">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li><li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons.">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li><li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals.">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris.">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מנגנוני תחושת האיזון שלנו זכו לתשומת לב מוגבלת בהשוואה למערכות חושיות אחרות, למשל את מערכות ראייה ושמיעה. מהמחקרים שחקרו שינויים בתפקוד שיווי משקל או איזון, רוב התמקדו באמצעים התנהגותיים כולל את רפלקס vestibulo-העיני, עם ידע לא שלם מאבני הבניין הבסיסיים של מאזן תאי ?...

למרות התרומה המשמעותית של מערכת שיווי המשקל לחיי היומיום שלנו, יש הבנה ברורה של התהליכים האחראים לירידה שנצפתה בתפקוד שיווי משקל עם גיל נשארת חמקמקה. אחת סיבות לחוסר הידע הזה הוא שהירידה בתפקוד שיווי משקל יש באופן בלעדי כמעט נחקרה באמצעות מבחני התנהגות, כוללים רפלקס vestibulo-העיני (VOR), חיווי מדויק של תפקוד שיווי משקל חיצוני, אך מספקת תובנות מוגבלות לשינויים של מרכיבים מהותיים . זהו מכשול עיקרי להבנה שלנו של תפקוד תא שיער שיווי משקל בבריאות, מחלה, או הזדקנות. אמנם יש כבר מחקרים רבים של תאי שיער שיווי המשקל בודדים, חסרון גדול היה ההסתמכות על הכנות תא שיער חריפות, שבו תאי שיער ומסופים מביא אפילו גביע יוסרו מהסביבה הרגילה שלהם באמצעות טיפול מכאני ו / או האנזימטית. inevita גישות כגוןבליי לשבש את ארכיטקטורה העדינה בין תאי שיער וגביע, ושיער של תא ותא תמיכה. עם התפתחותה של הכנות למחצה ללא פגע 1-5, והכנת מבוך עכבר מבודדת 6, עכשיו יש הזדמנות ללמוד את הצורות השונות של תקשורת הסינפטית בתנאים שנראה דומה יותר לin vivo. ואכן, Lim et al. (2011) הראה הבדלים בולטים בכל זרמים סלולריים נרשמו מסוג החריפות מבודד אני תאי שיער שיווי המשקל בהשוואה לאלה שנשארו מוטבעים בתוך neuroepithelium. באופן ספציפי, הוא חשב אשלגן להצטבר בחלל בין התאית, בין תא השיער וגביע עצבים ולשנות באופן משמעותי תגובת תא שיער 7. מידע מסוג זה יהיה בלתי אפשרי להשגה ללא הכנה למחצה השלמה של האפיתל החושי שיווי המשקל שתואר כאן. אנו מדגימים את ההכנה למחצה השלמה של עכבר Crista 3, ולהראות תוצאות נציג המתקבלות מכל תא התיקון electrophysiology, וסידן הדמיה שני פוטונים.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz medium L-15</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L4386-10X1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA-1-oregon green</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>O6806 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereo microscope</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>A60S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>BX51WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two-photon microscope</td>
 <td>Olympus/La Vision</td>
 <td>BX51WI/ TriMScope II</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 SF Forceps</td>
 <td>FST</td>
 <td>11252-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
 <td>FST</td>
 <td>16221-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>14001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>InstraTECH A-D converter</td>
 <td>HEKA</td>
 <td>ITC-18</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sutter Micromanipulator</td>
 <td>Sutter</td>
 <td>MP-225/M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>multiclamp amplifier</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 <td>700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data acquisition software (electrophysiology)</td>
 <td>Axograph</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imspector Data acquisition software (two-photon)</td>
 <td>Max Planck innovation</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy

לתפקד תאי שיער שיווי המשקל הבנה בתנאים רגילים, או איך טראומה, מחלה, הזדקנות ולשבש את הפונקציה הזו היא צעד חיוני בהתפתחות של גישות ו / או אסטרטגיות טיפוליות חדשניות מונעת. עם זאת, הרוב המכריע של מחקרים שמסתכלים על תפקוד שיווי משקל נורמלי לא היה ברמה התאית, אבל התמקד בעיקר במבחני התנהגות של תפקוד שיווי משקל כגון הליכה וניתוח ביצועי רפלקס vestibulo-עיניים. אמנם עבודה זו הניבה נתונים יקרי ערך לגבי מה שקורה כאשר דברים משתבשים, מעט מידע שלקט בנוגע לגורמים הבסיסיים של בעיות בתפקוד. מהמחקרים שיתמקדו בתהליכים התאיים וsubcellular העומדים בבסיס תפקוד שיווי משקל, רוב הסתמכו על החריפות בודדו תאי שיער, נטולי הקשרים סינפטיים ואת סביבת תאי תמיכה. לכן, אתגר טכני גדול כבר גישה לתאי שיער שיווי המשקל הרגישים להפליא בהכנהaration ששבש לפחות, מבחינה פיזיולוגית. כאן אנו מדגימים הכנה למחצה שלמה של האפיתל חושי שיווי משקל העכבר ששומר על מיקרו הסביבה המקומית הכולל תא שיער / מתחמים מביא עיקריים.

את המאפיינים אלקטרו של תאי שיער שיווי המשקל תלויים בארכיטקטורה המורכבת שבתוכה הם משובצים 7. ניתן לראות בתרשים 5, כי הכנת האפיתל שיווי המשקל חצי שלמותם ניתן להשתמש כדי להבדיל בין סוג I תאי שיער (איור 5 א), תאי שיער מסוג II (איור 5), וגביע עיק?...

Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy at JoVE.com

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

ניתוח של תפקוד תא שיער שיווי משקל הוא מסובך בשל מיקומם העמוק בתוך החלק הקשה ביותר של הגולגולת, העצם הטמפורלית petrous. רוב מחקרי תא שיער פונקציונליים השתמשו בחריפות תאי שיער מבודד. כאן אנו מתארים הכנה למחצה שלמה של האפיתל שיווי משקל עכבר למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרו ושני פוטונים.

הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Views.  University of Sydney. ניתוח של תפקוד תא שיער שיווי משקל הוא מסובך בשל מיקומם העמוק בתוך החלק הקשה ביותר של הגולגולת, העצם הטמפורלית petrous. רוב מחקרי תא שיער פונקציונליים השתמשו בחריפות תאי שיער מבודד. כאן אנו מתארים הכנה למחצה שלמה של האפיתל שיווי משקל עכבר למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרו ו?...

Video: An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.