עבודה זו נתמכה על ידי טרשת נפוצה החברה הלאומית מענק RG4595A1 / T ל DD ו-NIH / NINDS מענקים NS051470, NS052189 ו NS066361 נתוני KA וסרטים מותאם ו / או נדפס מ Davalos et al. J שיטות Neurosci. 2008 מרס 30, 169 (1) :1-7 זכויות יוצרים 2008, באישור Elsevier.

1. מבנה המכשיר ייצוב עמוד השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצו STS-Narishige Clamps קומפקטי חוט השדרה MA-6N Narishige מחזיק מתאם ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב מותאם אישית ולעשות צלחת נירוסטה בסיס פלדה להחזיק את שני חלקי Narishige יישור כך שהראש של החיה נתמכת תוך עמוד השדרה שלו וזנבו הם הידק. זכור כי המכשיר כולו צריך להתאים תחת עדשת המיקרוסקופ בדרך כלל על הבמה מיקרוסקופ הוריד. </li></ol> 2. בעלי חיים ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את החדר מיקרוסקופ עם מכשיר חימום אוויר ולתחזק אותו ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את החיה לעשות את לערבב חומר הרדמה באמצעות 100 מ&quot;ג קטמין, 15 מ&quot;ג ו xylazine acepromazine 2.5 מ&quot;ג לכל ק&quot;ג ממשקל הגוף, בדילול מלא בתמיסה NaCl 0.9% בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה על ידי הזרקת חומר הרדמה תמהיל (KXA) intraperitoneally. צובט הבוהן רגיל יש לבצע על מנת להבטיח הרדמה עמוקה בכלאת הניסוי. מוסף עם מינון חצי שעה המקורי או לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פנקס קטן לחימום החיה כדי לספק תמיכה תרמית תוך ביצוע הליך כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מלאכותי משחה דמעות על העיניים על מנת למנוע התייבשות נזק הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את החלק האחורי של החיה הראשונה עם מכשיר חיתוך ואז עם סכין חדה כדי להסיר לחלוטין את השיער מאזור סביב החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער מגולח לחטא את פני העור מגולח עם כרית אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קטן (~ 1.5 ס&quot;מ) האורך של העור מעל לרמה הרצויה השדרה (חוליות החזה המוצג כאן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את שרירי הגב על ידי retracting בעיון את רקמת חיבור תת עורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד את השרירים paravertebral מ עמוד השדרה ברמה הרצויה. ביצוע חתכים ספורות ביותר לנתק את השרירים משני הצדדים של כל תהליך spinous ואז לגרד את השרירים מנותקיםהדרך מפני השטח למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את lamina כי יוסרו ולהכין את האתרים של כניסה עבור מהדק השדרה משני צדי עמוד השדרה, מקורי מיד הזנב כדי laminectomy. בזהירות את מקומו של רקמת השריר לבצע ארבעה כיסים שבהם מלחציים יתווסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את עמוד השדרה עם קצה שיניים, מלקחיים ישר, כדי לאפשר הכנסה בטוחה של קצה קהה מספריים מעוקל תחת lamina בלי לגעת בחוט השדרה. בצע את laminectomy ידי לאט חיתוך העצם בצד אחד ולאחר מכן בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מטלית כותנה או להכניס שנחתך מראש פוזרו חתיכות קטנות gelfoam נספגים ספוג הג&#39;לטין לצד חתכים להגביל דימום מינורי. השתמש cauterizer כלי קטן כדי לשלוט דימום נוסף במידת הצורך. השתמש שחומם מראש נוזל סטרילי מלאכותי השדרה (ACSF) לשטוף רקמות. </li></ol> 3. ייצוב של עמוד השדרה הכנה עבור הדמיה in vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Plac<html> דואר החיה על כרית הגבהה על צלחת הבסיס של המכשיר ייצוב השדרה לאבטח את ראש מתאם ראש מחזיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את מהדק השדרה של המכשיר STS-A בציר הקדמי, האחורי של החיה בתוך מוכנה מראש כיסים משני צדי laminectomy (איור 1). שני מלחציים צריך להיות ממוקם בזווית של 45 ° ~ יחסית לציר של החיה rostro-הזנב כדי לאפשר מספיק מקום להורדת עדשה טבילה במים על חוט השדרה חשוף (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את מהדק השלישי של המכשיר STS-A בבסיס הזנב כך הגוף של בעל החיים יכול להיות תלוי באוויר לאחר הסרת כרית הגבהה למשך הניסויים הדמיה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנה גם קטן Gelseal (Amersham Biosciences קורפ) סביב חוט השדרה חשוף כדי להקל על התחזוקה של חוט השדרה ב ACSF ואת טבילה של עדשת מיקרוסקופ בפתרון זה עבור הדמיה vivo. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. הדמיה vivo של חוט השדרה עם העכבר מיקרוסקופיה שני הפוטונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החיה על המכשיר ייצוב עמוד השדרה בתוך החדר שחומם מראש המכסה את המיקרוסקופ לאבטח אותו על הבמה מיקרוסקופ הוריד הצבת laminectomy ישר תחת העדשה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחתון עדשת מים טבילה בזהירות לתוך הפתרון ACSF לוודא שזה לא לגעת מלחציים השדרה או Gelseal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש epifluorescence לזהות את שטח של עניין ולהתמקד בו. מעבר למצב סריקת לייזר ולבצע הדמיה vivo באמצעות עירור מתאים שני פוטונים באורך גל לייזר, dichroics ו bandpass מסננים עבור fluorophores הנוכחי ברקמת הדמיה. </li></ol> 5. הדמיה חוזרות לאחר הניתוח טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף ניסויים הדמיה, להסיר את העכבר מהמכשיר ייצוב עמוד השדרה ובזהירות לנגב את Gelseal מאזור סביב laminectomy.נקו היטב את האזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור תפר את שרירי הגב על laminectomy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור תפר את העור מעל laminectomy, ספוגית זה בבטאדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספקו 1 Lactated מ&quot;ל האצבעות פתרון (Baxter Healthcare) כתוסף תזונה ועל לחות, כמו גם טיפול משכך כאבים תת עורי (0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג עצירות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול intraperitoneally טיפול חיטוי (0.03 מ&quot;ל לכל עכבר, 2.27% פתרון להזרקה enrofloxacin אנטיבקטריאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום חיה על כרית חימום עד להחלמה מלאה מן ההרדמה ולאחר מכן בבית זה בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הממשל חיטוי יומיומי של 3-5 הימים הראשונים לאחר הניתוח טיפול משכך כאבים כל 8-12 שעות במשך 2-3 ימים לאחר הניתוח. צג בעל חיים יומיומי, כדי להבטיח התנהגות נורמלית להחלמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה מחדש באמצעות laminectomy זאת, מחדש את העור והשרירים sutured וחזור על הפעולות המתוארות בסעיפים 2 - 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש לאתר את previצילמו מבישה שטח באמצעות vasculature דם כמפה כפי שתואר לעיל 10. </li></ol> 6. נציג תוצאות הנהלים כל חיה בוצעו לפי הנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות השתמש באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו והם בהתאם לתקנות הפדרלי. תמונה של המכשיר ייצוב השדרה סכמטית המראה את המיקום של העכבר על המכשיר תחת עדשת המיקרוסקופ מוצג באיור 1. מתן מקום הולם תנועות נשימה מתחת לגוף של חיה מבטיח יציבות בתחום ההדמיה vivo בחוט השדרה. איור 2 מראה את הקשר ההדוק בין microglia ואת vasculature כפי שהיה הדמיה in vivo בחוט השדרה של Cx3cr1 GFP / + העכברים הטרנסגניים 18, שבו microglia מסומנים endogenously עם GFP. איור 3 מציג דוגמאות חוזרותבתחום ההדמיה vivo כפי שהיא בוצעה על אותם אזורים בחוט השדרה אצל עכברים לבטא חלבון פלואורסצנטי ב אקסונים השדרה (YFP-H שורה 3) ו microglia (ב Cx3cr1 GFP / + העכברים). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" /> באיור 1. ייצוב עמוד השדרה של העכבר בתחום ההדמיה vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. (א) מחוייט בסיס פלדה משמשת תמיכה ליישר את STS-מהדק קומפקטי Narishige חוט השדרה ואת MA-6N Narishige ראש מחזיק מתאם כפי שמוצג כאן. (ב) מיצוב נכון של העכברים הטרנסגניים מבוגר הרדים עם הרדמה KXA במכשיר ייצוב עמוד השדרה. הכנס מציג את המיקום של מלחציים השדרה מיד rostrally ו caudally כדי laminectomy לבין רקמת חוט השדרה חשוף. &lt;img alt = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg&quot; /&gt; באיור 2. הדמיה vivo של תאים צפיפות גבוהה microglial וכלי דם בחוט השדרה של עכברים בהרדמה. תחזית אך הבלתי מזדהות Z-ערימות של (A) צפופה מאוד GFP חיובי microglia (ירוק) בחוט השדרה של עכבר-GFP CX3CR1 + / בסמיכות עם כלי הדם (אדום, בתווית עם הזרקה iv של rhodamine dextran). (ב) התמונה בהגדלה גבוהה שכותרתו כמו (A) של תא microglial יחיד המחובר לקיר של כלי דם עם תהליכים המורחבת סביב כלי וכלפי parenchyma חוט השדרה. סולם ברים, 10μm. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" /> באיור 3. חוזרות בתחום ההדמיה vivo של מגזרים axonal אותו microglia כפי שהם הועברו ו reimaged בחוט השדרה של עכברים הרדים בימים שונים. (א) YFP-במעבדה<html> אקסונים eled בימים 0 ו 5. (B). המבנים בכלי הדם והתאים אותו microglial סביבם הדמיה in vivo בחוט השדרה של Cx3cr1 GFP / עכברים + בימים 0 ו -1. סולם ברים, 10μm. 1. סרט נציג רצף timelapse רכשה in vivo מחוט השדרה העכבר. רצף זה מראה בסדר פרט דינמיקה תהליך microglial (ירוק) ואת האינטראקציות שלהם עם כלי הדם (אדום, בתווית עם iv הזרקת rhodamine dextran) לאורך זמן בתוך הרקמה מאוכלס בצפיפות עם מבנים ניאון. התמונות גלם תוקנו רק רעש הבהירות, הניגודיות הרקע הסרט timelapse נבנה על ידי Z-ערימות מקרין תמונה רכשה ברצף, ללא יישור התמונה, ממוצע או Z-מבחר של מטוסים בודדים. כלי דם עוברים מגוון דומה של מטוסים z כמו תמונות של microglia. Z עומק המטוס: 38 מיקרומטר.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov &quot;&gt; לחץ כאן כדי לראות את הסרט. 2. סרט רצף Timelapse הוכחת יציבות הגלם של שיטת הדמיה ברמה של מטוס-z אחת. רכישה מהירה של המטוס-z אותו יחיד בחוט השדרה של עכברים CX3CR1 GFP / + דגש על המכשיר ייצוב עמוד השדרה בהרדמה KXA, ממחיש תזוזה מינימלית בין מסגרות תמונה ברציפות בקצב סריקה של 1 מסגרת / s זה מהר יותר קצב הנשימה של העכבר. עקירה שיורית קטין כנראה בשל פעימות הלב. <a alt="Movie 2" href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">לחץ כאן כדי לראות את הסרט.</a>

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex.">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420, 812-816 (2002).</li><li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385, 161-165 (1997).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Ca2++signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo.">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li><li>Christie, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+arrest+of+individual+senile+plaques+in+a+model+of+Alzheimer's+disease+observed+by+in+vivo+multiphoton+microscopy.">Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy.</a> J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).</li><li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches.">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2++signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion.">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo.">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li><li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure.">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

השיטה המתוארת כאן מאפשר יציבה חוזרות בתחום ההדמיה vivo של מבנים מאוכלסים בצפיפות הסלולר פלורסנט בחוט השדרה של עכברים הרדים באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. היציבות הושגה היא תוצאה של התקן מחוייט ייצוב השדרה משטר ההרדמה המפחיתה הנשימה הנגרמת חפץ בתנועה. המכש?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Rhodamine B dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, בדילול מלא ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> קטמין HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC לא: 67457-001-10 </td><td> בזריקות, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> לויד Labs </td><td> נדא לא: 139-236 </td><td> Xylazine להזרקה, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> נדא לא: 117-531 </td><td> בזריקות, 10mg/ml </td></tr><tr><td> דמעות מלאכותיות משחה </td><td> פניקס התרופות </td><td> NDC לא: 57319-760 - 25 </td><td> חומר סיכה </td></tr><tr><td> בבטאדין </td><td> דיג </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> מקפרסון, ווסטקוט מספרים </td><td> העולם Precision מכשירים </td><td> 555500S </td><td> עקום, קצה קהה מספרים </td></tr><tr><td> סטרייט מלקחיים </td><td> העולם Precision מכשירים </td><td> 555047FT </td><td> טיפ מלקחיים שיניים </td></tr><tr><td> כלי שיט קטנים לצרוב </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, פייזר </td><td> מיקסר מיל MM400 </td><td></td></tr><tr><td> חוט השדרה קומפקט מלחציים </td><td> Narishige </td><td> STS- </td><td></td></tr><tr><td> ראש מחזיק מתאם </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences קורפ </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated האצבעות </td><td> בקסטר בריאות &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit בנקיזר פרמצבטיקה בע&quot;מ </td><td> NDC לא: 12496 - 6757-1 </td><td> עצירות, להזרקה </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> באייר </td><td> נדא 140-913 </td><td> Enrofloxacin, אנטיבקטריאלי להזרקה 2.27% (20ml) </td></tr><tr><td> כרית חימום - גדול </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy

בשנת vivo הדמיה באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה 1 בעכברים שעברו הנדסה גנטית כדי לבטא חלבונים ניאון 2-3 סוגים מסוימים תא הרחיבה באופן משמעותי את הידע שלנו על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברקמות רבים in vivo 4-7. במחקרים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), יש כבר יישום נרחב בתחום ההדמיה vivo במוח, אשר יצר שפע של הרומן ממצאים בלתי צפויים לעתים קרובות על התנהגותם של תאים כגון נוירונים, האסטרוציטים, microglia, תחת מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים 8-17. עם זאת, סיבוכים טכניים בעיקר מוגבל ליישום בתחום ההדמיה vivo במחקרים של חוט השדרה עכבר חי. בפרט, הקרבה האנטומית של חוט השדרה אל הריאות והלב חפץ מייצר תנועה משמעותי שעושה הדמיה חוט השדרה חי משימה מאתגרת. </p&gt; פיתחנו שיטה חדשה אשר מתגבר על מגבלות מובנות של הדמיה בעמוד השדרה על ידי מייצב את עמוד השדרה, הפחתת הנשימה הנגרמת תנועות ובכך להקל את השימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים לתמונה חוט השדרה עכבר in vivo. זו מושגת על ידי שילוב של מכשיר מותאם אישית ייצוב עמוד השדרה בשיטה של ​​הרדמה עמוקה, וכתוצאה מכך לירידה משמעותית של דרכי הנשימה הנגרמת תנועות. זה פרוטוקול הוידאו מראה כיצד לחשוף אזור קטן של חוט השדרה החיים שאפשר לקיים בתנאים פיסיולוגיים יציבה לאורך פרקי זמן ארוכים על ידי שמירה על פגיעה ברקמות ודימום למינימום. תמונות גולמיות נציג רכשה בפירוט vivo ברזולוציה גבוהה את הקשר ההדוק בין microglia ואת כלי הדם. רצף timelapse מראה את התנהגות דינמית של תהליכים microglial בחוט השדרה עכבר חי. יתר על כן, סריקה רציפה של אותו z מסגרת להפגיןשל יציבות יוצאת דופן, כי בשיטה זו ניתן להשיג לייצר ערימות של תמונות ו / או סרטים timelapse שאינן דורשות יישור התמונה שלאחר הרכישה. לבסוף, אנו מראים כיצד בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבקר ו Reimage באותו אזור של עמוד השדרה בבית timepoints מאוחר יותר, ומאפשר מחקרים ארוכי טווח של תהליכים פיזיולוגיים או פתולוגי מתמשך in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy at JoVE.com

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

פרוטוקול פולשנית כדי לייצב את עמוד השדרה העכבר ולבצע חוזרות<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה בעמוד השדרה באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה מתואר. שיטה זו משלבת מכשיר ייצוב השדרה משטר ההרדמה כדי למזער את הנשימה הנגרמת תנועות להפיק נתונים הדמיה גלם הדורשים אין יישור או אחרים שלאחר עיבוד.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

in-vivo-imaging-of-the-mouse-spinal-cord-using-two-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

23.7K Views.  University of California, San Francisco. פרוטוקול פולשנית כדי לייצב את עמוד השדרה העכבר ולבצע חוזרות In vivo הדמיה בעמוד השדרה באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה מתואר. שיטה זו משלבת מכשיר ייצוב השדרה משטר ההרדמה כדי למזער את הנשימה הנגרמת תנועות להפיק נתונים הדמיה גלם הדורשים אין יישור או אחרים של?...

Video: In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...