סיוע טכני והמכשור של מתקן Greenebaum המרכז לחקר סרטן Translational Core אוניברסיטת מרילנד, במיוחד בני הזוג. רינה לפידוס וMariola Sadowska, הם הכירו בהכרת תודה. העבודה אחראית לפיתוח של assay זה מומנה בחלקו על ידי NIH RO1CA108846, AHA GRNT2130014 גרנט-in-Aid, פרס הצטיינות VA לסוכנות הידיעות AP, ועל ידי האוניברסיטה של ​​כספי פיצויי סיגריות מרילנד (CRF) הניתן למרלן וסטיוארט מרכז לחקר סרטן Greenebaum.

כמה צעדים מבוצעים מבעוד מועד וכמה חומרים כימיים מוכנים ומאוחסנים לפני ההליך: (1) בידוד תרבית תאים וחלבונים, (2) הכנת oligonucleotide, (3) הכנת צלחות 96 היטב, (4) תמצית גרעינית לילה דגירה. הליך דורש 2 ימים בגלל הדגירה הלילה של חלבון גרעיני עם oligonucleotides ה-DNA. 1. הכנת חוצצים 1.1 בידוד חלבון גרעיני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hypotonic הצפת: כדי להכין של חיץ hypotonic 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 150 μl (1 M MgCl 2), 333 μl (3 M KCl) ל98.3 מיליליטר H 2 O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ&quot;מ, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 10 מ&quot;מ KCl. לחיץ hypotonic + NP40 (לשימוש בשלב 2.11): הוסף 0.5 מיליליטר (NP40 10%) ל9.5 חיץ hypotonic מיליליטר לNP40 0.5% סופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלת מלח הצפת: כדי להכין של חיץ נמוך מלח (לשימוש בשלב 2.15) 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 25 מגליצרול ליטר, 150 μl (1 M MgCl 2), 666 μl (3 M KCl), 40 μl (0.5 M EDTA) ל73 מיליליטר H 2 O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ&quot;מ, 25% גליצרול, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 20 מ&quot;מ KCl, 0.2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלח גבוה הצפת: כדי להכין של חיץ מלח גבוה (לשימוש בשלב 2.15) 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 25 מיליליטר גליצרול, 150 μl (1 M MgCl 2), 26.7 מיליליטר (3 M KCl), 40 μl (0.5M EDTA) ל47 מיליליטר H 2 O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ&quot;מ, 25% גליצרול, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 800 מ&quot;מ KCl, 0.2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% דטרגנט NP40: NP40 ל10 מיליליטר 90 מיליליטר H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [+ NP40 (שלב 2.11), לחיץ מלח נמוך (שלב 2.15), וחיץ מלח גבוה (שלב 2.15) רק לפני השימוש מתווסף למאגר hypotonic] מעכבי פרוטאז ו phosphatase: הוסף 2.5 μl (1 M DTT) ו50 μl של מעכבי פרוטאז (100x) עד 5 מיליליטר של מאגר זה לריכוז סופי של 0.5 מ&quot;מ DTT ומעכבי פרוטאז 1x. תערובת מניית 100x מעכבי פרוטאז כוללת:פלואוריד הנתרן (Ser / Thr, phosphatases חומצי), orthovanadate נתרן (Tyr, phosphatases אלקליין), β-glycerophosphate (phosphatases Ser / Thr), pyrophosphate נתרן (phosphatases Ser / Thr), Aprotinin (פרוטאזות Ser), Bestatin (אמינו-peptidases ), E64 (פרוטאזות ציסטאין), leupeptin (פרוטאזות Ser / Cys), EDTA (metalloproteases). </li></ol> 1.2 הכנת צלחות assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת תיקון פתרון: כדי להכין 500 מיליליטר של תמיסה, להוסיף סודיום קרבונט 5.25 גרם ל500 מיליליטר H 2 O, ומערבב היטב ולהתאים את ה-pH ל 9.7 לריכוז סופי של M 0.1 סודיום קרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת חסימת פתרון: כדי להכין פולי מניית די / DC oligonucleotide, יחידת resuspend 1 (~ 50 מ&quot;ג) של פולי די / DC ב 1 מיליליטר של 10 מ&quot;מ טריס / HCl, pH 7.9 מכיל 1 mM EDTA לריכוז מניות של 50 מיקרוגרם / μl. המניה מדוללת ל1 מיקרוגרם / μl לפני השימוש. </li></ol> 1.3 מאגרים לשטוף ודילולי נוגדן הערה: לשטוף חיץ Streptavidin הוא<html> נהג לשטוף את הצלחות בין תוספות ולדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 1 ליטר של חיץ לשטוף Streptavidin, להוסיף 2.4 גרם טריס / HCl, 37.5 מיליליטר (4 M NaCl), 10 מיליליטר (BSA 10%), 5 מיליליטר (10% Tween-20), עד 1 ליטר מים מסוננים Millipore סטרילי , PH 7.18. חנות ב 4 ° C. ריכוזים סופיים: 20 מ&quot;מ טריס / HCl, 150 mM NaCl, BSA 0.1% Tween-20 0.05%. </li></ol> 1.4 חיץ-DNA מחייבת הערה: חיץ זה מאוחסן ב -20 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 15 מיליליטר של חיץ מחייב DNA, להוסיף 180 μl (1 M HEPES, pH 7.9), 300 μl (3 M KCl), 12 μl (0.5 M EDTA, pH 8.0), 7.5 μl (1 M DTT), 3.0 מיליליטר (גליצרול 60%), 300 μl (50 מיקרוגרם / μl פולי די / DC) בדילול מלא עם H deionized / מזוקק 2 O (12 מיליליטר). ריכוזים סופיים: 12 HEPES מ&quot;מ / pH 7.9, 60 מ&quot;מ KCl, 0.4 mM EDTA, 0.5 מ&quot;מ DTT, גליצרול 12%, 1 מיקרוגרם / μl פולי די / DC. </li></ol> 2. תרבית תאים ובידוד חלבון גרעיני t &quot;&gt; הערה: ההכנה דורשת שעות על 3 גירוי של תאים יהיה תלויה בניסוי מספר התאים המשמשים עבור כל ניסוי ישתנה וכל הכרכים משקפים ניסוי טיפוסי באמצעות 3 x 10 7 תאים / נקודה התאם כרכים כדי להכיל... מספר התא למעשה השתמש בניסוי 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין חלבון גרעיני למבחנים מחייבים DNA, תאים אנושיים תרבות המבטאים Runx2 (אנדותל, אוסטאוסרקומה, תאי סרטן השד) בתקשורת המתאימה 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאים subconfluent עם nocodazole (0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ל16 hr) לעצור את התאים בגבול מחזור תא G2 / M 6. בתנאים אלה, חלבון Runx2 הוא התייצב וה-DNA מחייב המקסימאלי מושגת. בדרך זו, חלבון גרעיני מספיק זמין עבור ניתן להשוות מבחני ומעכבים מרובים מאותה ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שלב, מראש לקרר את צנטריפוגות כדי 4 מעלות צלזיוס ולהכין מאגרים ולצנן 20 דקות ב 4 ° C לפני קציר תא.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צ&#39;יל (4 מעלות צלזיוס) ונהלי התנהגות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 1,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות בצינור מסביב לתחתית 15 פוליפרופילן מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1x עם PBS קר כקרח (Ca 2 + ו Mg 2 + חינם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב צנטריפוגה ולהשליך supernatant PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ hypotonic ללא מעכבי פרוטאז, להיות זהיר, כדי resuspend התא גלולה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התוכן לצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד צנטריפוגות ב 5,500 סל&quot;ד 5.5 דקות, לבטל את supernatant ולשמור על התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב μl 500 של חיץ hypotonic המכיל NP40 0.5%. הוספת פרוטאז ומעכבי phosphatase ו0.5 מ&quot;מ DTT (כמתואר בשלב 1.1.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר המדגם לנוח על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 13,000 סל&quot;ד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant (מכיל חלבוני cytosolic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור הגרעיני ב60 μl כל אחד מסאל הנמוךחיץ לא (שלמעכבי פרוטאז ו0.5 מ&quot;מ DTT נוספו מהצעד 1.1.5) וחיץ מלח גבוה (שלמעכבי פרוטאז ו0.5 מ&quot;מ DTT נוספו מהצעד 1.1.5) עבור סכום כולל של 120 μl. הוסף 60 μl של חיץ מלח נמוך לגלולה ראשונה ו resuspend, לאחר מכן להוסיף 60 μl של חיץ מלח גבוה. מערבולת בגלולה כדי לסייע בresuspension. </li></ol> הערה: שלב זה עוזר להיפטר מכמה מחלבוני קרום הגרעין ולהגדיר עבור שלב תמוגה: מלח נמוך הראשונה (גלולה resuspend, מערבולת), ולאחר מכן מלח גבוה (מערבולת) מייעל את הצעד הזה. שמור על תמצית על קרח למשך 30 דקות, עם vortexing אחרי הראשון 10 דקות. <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 12,000 סל&quot;ד במשך 15 דקות, לשמור את supernatant המכיל חלבון הגרעיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז חלבון (מנסה לשמור על דגימות ב2-5 מ&quot;ג / מיליליטר), aliquot בכמויות מתאימות (10 μl / צינור) ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol> הערה: תשואה משוערת: 30 x 10 6 cells יניבו 5 מיקרוגרם / μl חלבון ב120 μl. 5 x 10 6 תאים יניבו 2.2 מיקרוגרם / μl חלבון ב40 μl. 3. הכנת הגדילים הכפול Oligonucleotide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב oligonucleotides משלימה עם חצי אתרים תואמים בקצותיו. לRunx2 אלה הם: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-ביוטין (תחושה) ו5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-ביוטין (antisense). </li></ol> הערה: ניסויי פיילוט קבעו כי שלושה אתרי קישור Runx2 וביוטין שכותרתו חד הסוף הניבו את התוצאות לשחזור ביותר. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ חישול 5x: הוסף 300 μl (1 M טריס-HCl, pH 7.6), 30 μl (1 M MgCl 2), 10 μl (1 M DTT) ל260 μl H 2 O (μl 600 הסופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 pmol של כל olig חד גדיליםonucleotide (3 μl), להוסיף 12 μl של חיץ חישול 5x ו45 μl H 2 O עבור סכום כולל של 60 μl (200 pmol/60 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום ב-C ° 95 ל5-10 דק בבלוק חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב 65 מעלות צלזיוס לאט (על ידי הגדרת הטמפרטורה ל 65 מעלות צלזיוס, זה לוקח 15 דקות), ואז להתקרר לטמפרטורת חדר באיטיות על ידי כיבוי כוחו של בלוק החימום (או על ידי הצבת ב50 מיליליטר של המים 65 מעלות צלזיוס בכוס בקרח, זה לוקח 15-20 דק &#39;). </li></ol> 4. הכנת צלחות 96 היטב הערה: אל תשתמש בחלבוני חלב במאגרים לשטוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הצלחת עם פתרון תיקון (M 0.1 סודיום קרבונט): להוסיף 300 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 2 על ידי נדנדה בטמפרטורת חדר (RT), או שלא מתנדנדים על 4 מעלות צלזיוס (O / N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x צלחת עם חיץ לשטוף streptavidin (WB): להוסיף 300 μl / טוב בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת oligonucleotide שכותרתו ביוטין פעמיים תקועים (3 קונסנסוס אתרי קישור לכל נוקלאוטיד) במשך שעה 2 wה-i נדנדה (1.25 nmol / טוב; 100 μl / טובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם WB הקר: להוסיף 300 μl / טוב ולאחר מכן להפוך באופן מיידי את הצלחת לתוך כיור ולמחוק את הקצוות על מגבת נייר לאחר כל הוספה. </li></ol> הערה: אל תשתמש בטיפי פיפטה כדי להסיר נוזל מהצלחות כמו זו עלולה לגרד avidin: ביוטין: מתחמי ה-DNA מהבארות. האם זה עבור כל הצעדים לשטוף לאחר מכן. 5. דגירה עם תמצית גרעינית הערה: אין תחליף סלמון או DNA זרע הרינג לפולי מאגר חסימת di / DC. למנוע חסימת צלחות עם חלבוני חלב. שני סוכני חסימה אלה לגרום לערכי רקע גבוהים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם גורם שעתוק ספציפי שהוכן מתמצית גרעינית (90 μl / טוב). הכן תערובת אב המכילה תמצית גרעינית (חלבון קושר DNA; 3-9 מיקרוגרם / טוב) + פולי די / DC (מיקרוגרם / μl 1 מ מיקרוגרם / מניית ul 50) ב1x-DNA מחייב חיץ. נפח נדרש כלמספר הכולל שלבארות הנדרשות (90 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מעכב פוטנציאלי, כגון ויטמין D3 (איור 2) או תרכובת CADD 5,221,975 (איור 3), או הדילול המתאים של שליטת הממס, כגון אתנול, הוא הוסיף בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מניח על הנדנדה פלטפורמה, O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם WB: להוסיף 300 μl / טוב </li></ol> 6. תוספת של נוגדן הראשוני הערה: צריכים להיות מוכנים טריים דילולים נוגדן ראשוניים - האחסון אינו מומלץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים חד שבטיים Runx2 הספציפי (מיקרוגרם / μl מניות 1) 1/5, 000 בStreptavidin לשטוף חיץ. הכן מספיק לתוספת היטב בכל הצלחת 96 היטב (90 μl / טוב) בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם WB; להוסיף 300 μl / טוב. </li></ol> 7. תוספת של נוגדנים משני הערה: דילולים נוגדנים משני יכולים להיות stoאדום ב 4 ° C למשך הלילה במידת צורך ביום שלמחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים מצומדות (7.1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות) F ab ספציפי זיקה מטוהרת-HRP ל1:1,400 בStreptavidin לשטוף חיץ: לשטוף חיץ מיליליטר antibody/5.0 3.5 μl. הכן מספיק לתוספת היטב בכל הצלחת 96 היטב (90 μl / טוב) בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6x עם WB על ידי היפוך צלחת לכיור (300 μl / טוב). </li></ol> 8. HRP תשתית ופיתוח מוצרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של מצע TMB לכל גם ישירות מבקבוק מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 10-20 דקות ב RT בחושך (להפסיק שיטת תגובה) או למדוד את הספיגה ישירות (ניטור רציף קינטית). </li></ol> 9. מדידת תגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק שיטת תגובה: לתגובת ראייה תחנה, לבדוק לשינוי צבע ברור לכחולים ולהפסיק תגובה עם 50 חומצה גופרתית μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הספיגה ב ננומטר 450 עםספקטרופוטומטר Biotrak השני צלחת גלויה הקורא (Biosciences Amersham; GE Healthcare Biosciences קורפ Piscataway ניו ג&#39;רזי, ארה&quot;ב) או מכשיר דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה רציפה הקינטית ניטור: הוסף מצע לאחר השטיפה האחרונה ורק לפני הצבת בספקטרופוטומטר (לא לעצור את התגובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הספיגה ב ננומטר 635 עם ספקטרופוטומטר Bio-Tek Synergy HT Multi-תגובת microplate הקורא (Bio-Tek מכשירים, Inc; Winooski, VT, ארה&quot;ב) או מכשיר דומה. </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

מבחני ה-DNA מחייב משמשים למדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים כוללים משמרת electrophoretic ניידות (EMSA) 1 וimmuneprecipitation הכרומטין (שבב) מבוסס מבחני 3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב 4 כגון מבחני chemiluminescent 2. EMSA הוא שא...

יש מבחני ה-DNA מחייבת שירות במדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים לכלול מבחני electrophoretic משמרת ניידות (EMSA) שתלויים בoligonucleotides radiolabeled 1 או מבחני chemiluminescence 2. מבחני מבוססים immuneprecipitation הכרומטין (שבב) 3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב 4 גם תוארו. עם זאת, EMSA הוא assay שאינו כמותיים הדורש את השימוש של oligonucleotides רדיואקטיבי. כאשר חלבונים גרעיניים לקשר עם רצפי אמרגן נוקלאוטיד הספציפיים, מתחמי מחייבים הם מפגרים בג&#39;לים polyacrylamide וגורמים שעתוק הספציפי יכול להיות מאומת עם &quot;supershift&quot; נוגדן. פיתחנו assay-DNA מחייבת כמותית באמצעות פורמט צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA), אשר מסוגל למדוד את האינטראקציה של Runx2 עם רצפי ה-DNA מחייבת המתאימים לאלמנטי אמרגן מוגדרים iגנים מטרת Runx2 n. שימוש בנוגדן אנטי Runx2 מספק סגוליות לassay וחוסר radiolabel להבחין assay זה מassay משמרת ג&#39;ל המסורתי 5. איתור של מתחמים מחייבים אפשרי עם השימוש בנוגדנים משני מצמידים את חזרת peroxidase (HRP), אשר ממיר מצע HRP, tetramethyl benzidine (TMB) למוצר בצבע לניתוח spectrophotometric. Assay דיווח כאן ניתן לשלב את השימוש של oligonucleotides DNA מוטציה שולטת ויכול לשמש לזיהוי של מעכבים תחרותיים או לא תחרותיים של ה-DNA המחייב. ההקרנה של תרכובות אנטי סרטניים רומן אפשרי גם עם assay זה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

מבחני ה-DNA מחייבת רבים כגון מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA), מבחני chemiluminescent, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) המבוסס על מבחני, ומבחנים מבוססי multiwell משמשים למדידת פעילות גורם שעתוק. עם זאת, מבחני אלה הם nonquantitative, חסרי ייחוד, עשוי להיות כרוכים בשימוש בoligonucleotides רדיואקטיבי, ולא יכולים להיות ישים להקרנה של מעכבים של ה-DNA המחייבים. מצד השני, באמצעות assay כמותיים-DNA מחייבת צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA) assay, אנחנו מדגימים אינטראקציות חלבון גרעיניות עם ה-DNA באמצעות גורם שעתוק Runx2 שתלוי בקשר ספציפי עם רצפי ה-DNA מחייבת קונסנסוס נוכחי ביוטין oligonucleotides שכותרתו. הכנת תאים, מיצוי של חלבון גרעיני, ועיצוב של oligonucleotides גדילים הכפולה מתוארים. צלחות 96 היטב מצופה Avidin קבועות עם חיץ אלקליין וטופחו עם חלבונים גרעיניים במאגר נוקלאוטיד חסימה. Follבשל שטיפה נרחבת של הצלחות, נוגדן ראשוני ספציפי וincubations נוגדנים משני ואחריו התוספת של מצע חזרת peroxidase ופיתוח של תגובת colorimetric. מצב תגובת עצירה או ניטור רציף הקינטית שימש למדידת אינטראקציה חלבון עם DNA כמותית. אנחנו דנים בבקרות ספציפיות מתאימות, כוללים טיפול עם IgG אינו ספציפי או בלי חלבון או נוגדן ראשוני. יישומים של assay מתוארים כוללים השירות שלה בהקרנת סמים ותוצאות חיוביות ושליליות נציג הם דנו.

שיטת D-ELISA היא מאוד ספציפית לחלבון קושר DNA המיועד עוד, oligonucleotide פעמיים תקוע רצף ספציפי המכיל שלושה עותקים של אתר קישור Runx2 הקונצנזוס (ACACCA) משמש. הנוגדן הראשוני הכרה בגורם החלבון גם משפר את הספציפיות. הנוגדנים משני מכילים peroxidase חזרת קוולנטית צמודה (HRP) שממיר מצע ברור (tetrameth...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents at JoVE.c

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת.

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

a-quantitative-assay-to-study-proteindna-interactions-discover

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K Views.  University of Maryland School of Medicine.  פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת. 

Video: A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.