L&#39;assistenza tecnica e la strumentazione della University of Maryland Greenebaum Cancer Center traslazionale Nucleo Fondo, in particolare Drs. Rena Lapidus e Mariola Sadowska, sono riconosciuti con gratitudine. Il lavoro di responsabile per lo sviluppo di questo test è stato finanziato in parte dal NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un VA Merit Award per AP, e l&#39;Università del Maryland sigaretta restituzione Funds (CRF) fornita al Marlene &amp; Stewart Greenebaum Cancer Center.

Diverse fasi vengono eseguite in anticipo e diversi reagenti vengono preparate e conservate prima della procedura: (1) cultura e proteine ​​cella di isolamento, (2) preparazione di oligonucleotide, (3) Preparazione di piastre a 96 pozzetti, (4) estratto nucleare notte di incubazione. Procedura prevede due giorni a causa della notte di incubazione della proteina nucleare con oligonucleotidi di DNA. 1. Preparazione del buffer 1.1 isolamento delle proteine ​​nucleari <ol><li> Ipotonica Buffer: Per preparare 100 ml di tampone ipotonico, aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 150 ml (1 M MgCl 2), 333 ml (3 M KCl) a 98,3 ml H 2 O. Concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 1,5 mM MgCl 2, KCl 10 mM. Per tampone ipotonico + NP40 (per l&#39;utilizzo in fase 2.11): Aggiungere 0,5 ml (10% NP40) per 9,5 ml di tampone ipotonico per la finale dello 0,5% NP40. </li><li> Salt Buffer Bassa: Per preparare 100 ml di tampone sale basso (per l&#39;utilizzo in fase 2.15), aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml glicerolo, 150 ml (1 M MgCl 2), 666 ml (3 M KCl), 40 ml (0,5 M EDTA) a 73 ml di H 2 O. Le concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 25% glicerolo, 1,5 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA. </li><li> Buffer di sale: Per preparare 100 ml di tampone sale alto (per l&#39;utilizzo in fase 2.15), aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml di glicerina, 150 ml (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 microlitri (0.5M EDTA) a 47 ml di H 2 O. Concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 25% glicerolo, 1,5 mM MgCl 2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA. </li><li> 10% NP40 detergente: 10 ml NP40 a 90 ml H 2 O </li><li> Gli inibitori della proteasi e fosfatasi [aggiunto al buffer ipotonico + NP40 (passo 2.11), al buffer basso contenuto di sale (punto 2.15), e al buffer di sale (punto 2.15) appena prima dell&#39;uso]: Aggiungere 2,5 microlitri (1 M DTT) e 50 microlitri di inibitori delle proteasi (100x) a 5 ml di tampone per ciascuna concentrazione finale di 0,5 mM DTT e inibitori della proteasi 1x. Il 100x magazzino miscela di inibitori della proteasi comprende:fluoruro di sodio (Ser / Thr, fosfatasi acida), orthovanadate sodio (Tyr, fosfatasi alcalina), β-glicerofosfato (fosfatasi Ser / Thr), pirofosfato di sodio (fosfatasi Ser / Thr), aprotinina (Servizi proteasi), Bestatin (amino-peptidasi ), E64 (proteasi cisteina), leupeptina (proteasi Ser / Cys), EDTA (metalloproteasi). </li></ol> 1.2 Preparazione delle piastre di saggio <ol><li> Piatto soluzione di fissaggio: Per preparare 500 ml di soluzione, aggiungere 5,25 g di carbonato di sodio per 500 ml H 2 O, mescolare bene e aggiustare il pH a 9,7 per una concentrazione finale di 0,1 M di carbonato di sodio. </li><li> Piatto soluzione di blocco: Per preparare magazzino poli dI / dC oligonucleotide, risospendere 1 Unit (~ 50 mg) di poli dI / DC in 1 ml di 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 contenente 1 mM EDTA per una concentrazione di scorta di 50 mg / microlitri. Stock è diluita a 1 mg / mL prima dell&#39;uso. </li></ol> 1.3 tamponi di lavaggio e diluizioni di anticorpi NOTA: tampone di lavaggio Streptavidin è<html> utilizzato per lavare piatti tra aggiunte e per diluire anticorpi primari e secondari. <ol><li> Per preparare 1 L di tampone di lavaggio Streptavidin, aggiungere 2,4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), a 1 L di acqua filtrata Millipore sterile , pH 7.18. Conservare a 4 ° C. Le concentrazioni finali: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20. </li></ol> 1.4 tampone di legame al DNA NOTA: Questo tampone è conservato a -20 ° C. <ol><li> Per preparare 15 ml di DNA binding buffer, aggiungere 180 microlitri (1 M HEPES, pH 7.9), 300 ml (3 M KCl), 12 ml (0.5 M EDTA, pH 8.0), 7.5 ml (1 M DTT), 3,0 ml (60% glicerolo), 300 ml (50 mg / ml poly dI / dC) diluito con acqua deionizzata / distillata H 2 O (12 ml). Concentrazioni finali: 12 mM HEPES / pH 7.9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, DTT 0,5 mm, 12% glicerolo, 1 mg / ml poly dI / DC. </li></ol> 2. Coltura cellulare e isolamento proteina nucleare t &quot;&gt; NOTA: La preparazione richiede circa 3 ore La stimolazione di cellule dipenderà esperimento Il numero di cellule utilizzate per ciascun esperimento varierà e tutti i volumi riflette un tipico esperimento utilizzando 3 x 10 7 cellule / punto Regolare volumi per accogliere... il numero di cellule effettivamente utilizzato nell&#39;esperimento 6. <ol><li> Per preparare proteina nucleare di DNA saggi di legame, le cellule umane cultura che esprimono RUNX2 (endoteliali, osteosarcoma, le cellule del cancro al seno) nelle matrici appropriate 6. </li><li> Trattare le cellule subconfluenti con nocodazole (0,2 mg / ml per 16 ore) per arrestare le cellule al confine ciclo cellulare G2 / M 6. In queste condizioni, la proteina RUNX2 viene stabilizzato e vincolante DNA massimali si ottengono. In questo modo, proteina nucleare sufficiente è disponibile per analisi multiple e inibitori possono essere confrontati dalla stessa preparazione. </li><li> Per ogni passo, pre-raffreddare la centrifuga a 4 ° C e preparare buffer e chill 20 min a 4 ° C prima della raccolta delle cellule.</li><li> Cellule freddo (4 ° C) e le procedure condotta su ghiaccio. </li><li> Centrifugare le cellule a 1000 rpm per 5 minuti in 15 ml di polipropilene tubo tondo a fondo. </li><li> Lavare 1x con PBS freddo (Ca 2 + e Mg 2 + libero). </li><li> Centrifuga di nuovo e scartare PBS surnatante. </li><li> Aggiungere 500 ml di tampone ipotonico senza inibitori della proteasi, facendo attenzione a risospendere completamente il pellet cellulare. </li><li> Trasferire contenuto in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Subito centrifugare a 5.500 rpm per 5,5 min; scartare il surnatante e mantenere il pellet di cellule. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di tampone ipotonico contenente 0,5% NP40. Aggiungi proteasi e gli inibitori della fosfatasi e DTT 0.5 mM (come descritto al punto 1.1.5). </li><li> Lasciare il campione a riposo in ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare a 13.000 rpm per 10 min. </li><li> Scartare il surnatante (contiene le proteine ​​citosoliche). </li><li> Risospendere il pellet nucleare in 60 ml ciascuna di bassa saltampone t (per cui gli inibitori della proteasi e DTT 0,5 mM sono stati aggiunti dal punto 1.1.5) e tampone salina (a cui gli inibitori della proteasi e DTT 0,5 mM sono stati aggiunti dal punto 1.1.5) per un totale di 120 microlitri. Aggiungere 60 ml di tampone sale basso per il pellet e risospendere prima, quindi aggiungere 60 ml di tampone di sale. Agitare il pellet per facilitare la risospensione. </li></ol> NOTA: Questo passaggio aiuta a sbarazzarsi di alcune delle proteine ​​di membrana nucleare e predisposto per la fase di lisi: basso contenuto di sale per primo (risospendere pellet, vortex), poi di sale (vortex) ottimizza questo passo. Mantenere estratto in ghiaccio per 30 min, con vortex dopo i primi 10 min. <ol start="16"><li> Centrifugare a 12.000 rpm per 15 min; conservare il surnatante contenente la proteina nucleare. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​(cercare di mantenere i campioni a 2-5 mg / ml), aliquota in quantità adeguate (10 ml / tubo) e conservare a -80 ° C. </li></ol> NOTA: rendimento stimato: 30 x 10 6 cells produrranno 5 mg / ml di proteine ​​in 120 microlitri. 5 x 10 6 cellule produrranno 2,2 mg / ml di proteine ​​in 40 microlitri. 3. Preparazione di Double Stranded oligonucleotide <ol><li> Progettare oligonucleotidi complementari con siti metà compatibili alle estremità. Per RUNX2 questi sono: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-biotina (senso) e 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-biotina (antisenso). </li></ol> NOTA: esperimenti pilota determinato che tre siti di legame Runx2 e single-end biotina marcata hanno prodotto i risultati più riproducibili. <ol start="2"><li> Preparare buffer di ricottura 5x: Aggiungere 300 ml (1 M Tris-HCl, pH 7.6), 30 ml (1 M MgCl 2), 10 ml (1 M DTT) a 260 ml H 2 O (finale di 600 microlitri). </li><li> Per 200 pmol di ogni olig singolo filamentoonucleotide (3 ml), aggiungere 12 ml di tampone 5x ricottura e 45 ml H 2 O per un totale di 60 microlitri (200 pmol/60 microlitri). </li><li> Riscaldare a 95 ° C per 5-10 minuti su una piastra riscaldante. </li><li> Raffreddare a 65 ° C lentamente (impostando la temperatura a 65 ° C, ci vogliono 15 min), poi raffreddare lentamente a temperatura ambiente spegnendo l&#39;alimentazione del blocco riscaldante (o mettendo in 50 ml di acqua 65 ° C in un becher su ghiaccio; questo richiede 15-20 min). </li></ol> 4. Preparazione di piastre con 96 pozzetti NOTA: non utilizzare proteine ​​del latte nei buffer di lavaggio. <ol><li> Fissare la piastra con la soluzione di fissaggio (0.1 M carbonato di sodio): aggiungere 300 microlitri / pozzetto. </li><li> Incubare per 2 ore agitando a temperatura ambiente (RT), o nessuna dondolo a 4 ° C (O / N). </li><li> Lavare 3x piastra con tampone di lavaggio streptavidina (WB): aggiungere 300 microlitri / bene ogni volta. </li><li> Aggiungi a doppio filamento oligonucleotide marcato con biotina (3 consensus siti di legame per nucleotide) per 2 ore wesimo dondolo (1,25 nmol / e; 100 microlitri / pozzetto). </li><li> Lavare 3x con freddo WB: aggiungere 300 microlitri / bene e poi invertire immediatamente la piastra in un lavandino e macchia i bordi su un tovagliolo di carta dopo ogni aggiunta. </li></ol> NOTA: non utilizzare puntali delle pipette per rimuovere il liquido dalle piastre in quanto ciò potrebbe raschiare avidina: biotina: complessi di DNA dai pozzetti. Fate questo per tutte le fasi di lavaggio successive. 5. Incubazione con estratto nucleare NOTA: Non sostituire salmone o aringa DNA di sperma per la poli tampone di bloccaggio dI / dC. Evitare di bloccare piatti con proteine ​​del latte. Entrambi questi agenti bloccanti come risultato valori di fondo alti. <ol><li> Incubare con fattore di trascrizione specifico elaborato da estratto nucleare (90 microlitri / pozzetto). Preparare una master mix contenente estratto nucleare (DNA binding protein; 3-9 mg / pozzetto) + poly dI / DC (1 mg / mL da un mcg / magazzino ul 50) nel DNA 1x tampone di legame. Volume è come necessario per il numero totale dipozzetti necessari (90 microlitri / pozzetto). </li><li> Qualsiasi inibitore potenziale, come la vitamina D3 (figura 2) o CADD composto 5.221.975 (Figura 3), o la diluizione appropriata di controllo solvente, come etanolo, viene aggiunto in questa fase. </li><li> Luogo piastra su piattaforma oscillante, O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare 3x con WB: aggiungere 300 microlitri / pozzetto </li></ol> 6. L&#39;aggiunta di anticorpo primario NOTA: diluizioni anticorpo primario deve essere preparato fresco - lo stoccaggio non è raccomandato. <ol><li> Diluire specifico RUNX2 anticorpo monoclonale (magazzino 1 mg / mL) 1/5, 000 in Streptavidin tampone di lavaggio. Preparare sufficiente per aggiunta a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti (90 microlitri / pozzetto) in triplicato. </li><li> Incubare per 1 ora a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. </li><li> Lavare 3x con WB, aggiungere 300 ml / pozzetto. </li></ol> 7. L&#39;aggiunta di anticorpo secondario NOTA: diluizioni di anticorpi secondari possono essere STOrosso a 4 ° C durante la notte se necessario il giorno successivo. <ol><li> Diluire F ab-specifica affinità purificato HRP-anticorpo coniugato (7,1 mg / ml di magazzino) per 1:1,400 in Streptavidin lavare buffer: buffer di 3,5 microlitri antibody/5.0 ml lavaggio. Preparare sufficiente per aggiunta a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti (90 microlitri / pozzetto) in triplicato. </li><li> Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. </li><li> Lavare 6x con WB invertendo piastra nel lavandino (300 microlitri / pozzetto). </li></ol> 8. HRP substrato e Sviluppo Prodotti <ol><li> Aggiungere 50 ml di substrato TMB per pozzetto direttamente dal magazzino bottiglia. </li><li> Incubare 10-20 min a RT al buio (fermata metodo di reazione) o misurare l&#39;assorbanza direttamente (monitoraggio cinetica continuo). </li></ol> 9. Misura di reazione <ol><li> Fermare metodo della reazione: Per la reazione di arresto visiva, verificare la presenza di cambiamento di colore dal chiaro al blu e smettere di reazione con 50 ml di acido solforico. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 450 nm conil Biotrak II lettore di piastre visibile Spettrofotometro (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp. Piscataway NJ, USA) o uno strumento simile. </li><li> Continuo metodo di monitoraggio cinetico: Aggiungere substrato dopo l&#39;ultimo lavaggio e appena prima messa in spettrofotometro (non fermare la reazione). </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 635 nm con il Bio-Tek Synergy HT Multi-reazione lettore di micropiastre spettrofotometro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) o uno strumento simile. </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

DNA-binding saggi vengono utilizzati per misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame per DNA includono spostamento elettroforetico mobilità (EMSA) 1 e immuneprecipitation cromatina (ChIP) saggi basati 3 nonché saggi occupata formati da 96 pozzetti 4 come saggi chemiluminescenti 2. L&#39;EMSA è non-quantitativa e utilizza radioattivo (32 P) oligonucleotidi. Questi sono incubati con proteine ​​nucleari e comple...

DNA-binding saggi hanno utilità nel misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame al DNA includono elettroforetici saggi mobility shift (EMSA) che dipendono da oligonucleotidi radioattivi 1 o saggi chemiluminescenza 2. Saggi cromatina immuneprecipitation (chip) basate 3 e saggi che impiegano formati da 96 pozzetti 4 sono state descritte. Tuttavia, l&#39;EMSA è un&#39;analisi non quantitativa che richiede l&#39;uso di oligonucleotidi radiomarcati. Quando le proteine ​​nucleari associano con le specifiche sequenze promotrici nucleotide, complessi vincolanti sono ritardati su gel di poliacrilammide e il fattore di trascrizione specifico possono essere convalidati con un anticorpo &quot;supershift&quot;. Abbiamo sviluppato un saggio di legame al DNA quantitativa utilizzando un formato di immunoassorbimento enzimatico (ELISA-D), che è in grado di misurare l&#39;interazione di RUNX2 con DNA-binding sequenze corrispondenti ad elementi promotori definiti igeni bersaglio n Runx2. Uso di un anticorpo anti-RUNX2 fornisce specificità per il dosaggio e la mancanza di radiotracciante distinguere questo saggio dal tradizionale saggio di spostamento gel 5. Rilevamento di complessi di legame è possibile con l&#39;uso di un anticorpo secondario accoppiato a perossidasi di rafano (HRP), che converte un substrato HRP, tetrametil benzidina (TMB) in un prodotto colorato per l&#39;analisi spettrofotometrica. Il saggio qui riportato può incorporare l&#39;uso di oligonucleotidi di DNA mutati i controlli e può essere utilizzato per il rilevamento di inibitori competitivi e non competitivi di DNA vincolanti. Lo screening di nuovi composti antitumorali è possibile anche con questo test.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

Molti legano il DNA test come test di spostamento mobilità elettroforetica (EMSA), saggi chemiluminescenti, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) a base di saggi e saggi pozzetti-based sono utilizzati per misurare attività del fattore di trascrizione. Tuttavia, questi saggi sono nonquantitative, mancano di specificità, possono comportare l&#39;uso di oligonucleotidi radiomarcati, e non possono essere adattabile per lo screening di inibitori di legame al DNA. D&#39;altra parte, utilizzando un saggio quantitativo di legame al DNA immunoenzimatico (ELISA-D) Test, dimostriamo interazioni proteina nucleare con DNA utilizzando il fattore di trascrizione RUNX2 che dipendono specifica associazione con consenso DNA-binding sequenze presenti sulla biotina- oligonucleotidi etichettati. Preparazione delle cellule, estrazione di proteine ​​nucleari, e la progettazione di oligonucleotidi a doppio filamento sono descritti. Piastre a 96 pozzetti rivestite di avidina sono fissati con tampone alcalino e incubate con proteine ​​nucleari a nucleotide tampone di bloccaggio. Follgrazie lavaggio estensivo delle piastre, l&#39;anticorpo primario specifico e incubazioni anticorpi secondari sono seguiti dall&#39;aggiunta di substrato perossidasi di rafano e lo sviluppo della reazione colorimetrica. Modalità di reazione di arresto o il monitoraggio continuo cinetica sono stati utilizzati per misurare quantitativamente l&#39;interazione delle proteine ​​con il DNA. Discutiamo adeguati controlli specificità, compreso il trattamento con i non-IgG specifiche o senza proteine ​​o anticorpo primario. Applicazioni del saggio sono descritte compresa la sua utilità in screening di farmaci e risultati positivi e negativi rappresentativi sono discussi.

Il metodo D-ELISA è altamente specifico per la proteina legante il DNA designato finché viene utilizzato un oligonucleotide a doppio filamento sequenza-specifica, contenente tre copie del sito di legame consenso RUNX2 (ACACCA). L&#39;anticorpo primario che riconosce la proteina che migliora anche la specificità. L&#39;anticorpo secondario contiene covalentemente legata perossidasi di rafano (HRP) che converte un substrato trasparente (tetrametil benzidina) per un prodotto colorato per facilità di rilevamento <strong...

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A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale.

Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell&#39;espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

a-quantitative-assay-to-study-proteindna-interactions-discover

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JoVE Journal

Biology

18.5K Views.  University of Maryland School of Medicine.  Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale. 

Video: A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents