기술 지원 및 메릴랜드 대학 그린 바움 암 센터의 번역 상 핵심 시설, 특히 박사 부부의 계측. 레나 래피 더스와 Mariola Sadowska은 기꺼이 인정합니다. 이 분석의 개발을 담당 작품은 NIH RO1CA108846, AHA 그랜트 -에 - 보조 GRNT2130014, AP에 VA 공로상에 의해 메릴랜드 담배 배상 기금의 대학 (CRF) 마린 &amp; 스튜어트 제공에 의해 부분적으로 투자되었다 그린 바움 암 센터.

여러 단계가 시간 앞서 수행되는 여러 시약은 절차 이전에 제조 및 저장됩니다 : (1) 세포 배양 및 단백질 분리, (2) 올리고 뉴클레오티드의 준비, (3) 96 - 웰 플레이트의 준비, (4) 핵 추출물 부화 하룻밤. 절차 때문에 DNA 올리고 뉴클레오타이드와 핵 단백질의 하룻밤 배양 2 일이 필요합니다. 1. 버퍼의 준비 1.1 핵 단백질 분리 <ol><li> 저장성 버퍼 : 저장성 버퍼 100 ㎖를 준비하려면, 98.3 ML의 H 2 O 1 ㎖ (1 M HEPES, 산도 7.9), 150 μL (1 M MgCl2를 2), 333 μL (3 M의 KCl)을 추가 최종 농도 10 mM의 HEPES, 1.5 mM의 MgCl2를, 10 mM의 KCl을. 저장성 버퍼 + NP40 (단계 2.11에 사용)의 경우 : 최종 0.5 % NP40 9.5 ml의 저장성 버퍼에 0.5 ㎖ (10 % NP40)를 추가합니다. </li><li> 낮은 소금 버퍼 (단계 2.15에서 사용하기에) 낮은 소금 버퍼 100 ㎖를 준비하려면, 1 ㎖ (1 M HEPES, 산도 7.9), 25m를 추가L의 글리세롤, 150 μL (1 M MgCl2를 2), 666 μL (3 M의 KCl), 40 μL (0.5 M EDTA) 73 ML의 H 2 O에 최종 농도 10 mM의 HEPES, 25 % 글리세롤, 1.5 mM의 MgCl2를 20 밀리미터의 KCl, 0.2 mM의 EDTA. </li><li> 높은 소금 버퍼 (단계 2.15에서 사용하기에) 높은 소금 버퍼 100 ㎖를 준비하려면, 1 ㎖ (1 M HEPES, 산도 7.9), 25 ㎖의 글리세롤, 150 μL (1 M MgCl2를), 26.7 mL를 넣고 (3 M 의 KCl), 40 μL (0.5M EDTA) 47 ML의 H 2 O에 최종 농도 10 mM의 HEPES, 25 % 글리세롤, 1.5 mM의 MgCl2를 2, 800 밀리미터의 KCl, 0.2 mM의 EDTA. </li><li> 10 % NP40 세제 : 10 ㎖ NP40 90 ML의 H 2 O </li><li> 단백질 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제 [저장성 버퍼에 추가 + NP40 (단계 2.11), 저염 버퍼 (단계 2.15)로, 높은 소금 버퍼 (단계 2.15)를 사용하기 바로 전에] : 2.5 μL (1 M DTT)를 추가, 50 0.5 mM의 DTT 및 1X 프로테아제 억제제의 최종 농도에 대한 각 버퍼의 5 ML에 단백질 분해 효소 억제제 (100X)의 μL. 단백질 분해 효소 억제제 100X 주식 혼합물을 포함한다 :불화 나트륨 (SER /의 Thr, 산성 인산 가수 분해 효소), 나트륨 오르토 바나 데이트 (티르, 알칼리 포스 파타 아제), β-글리세로 포스페이트 (SER /의 Thr 포스파타제), 피로 인산 나트륨 (SER /의 Thr 포스파타제), Aprotinin의 (SER 단백질 분해 효소), Bestatin (아미노 펩 티다 ), E64 (시스테인 프로테아제), 류 펩틴 (SER / Cys를 프로테아제), EDTA (메탈로). </li></ol> 분석 플레이트의 1.2 준비 <ol><li> 판 솔루션을 고정 : 용액 500 ㎖를 준비 500 ㎖ H 2 O 5.25 g 나트륨, 탄산을 추가, 잘 ​​섞는다 0.1 M 탄산나트륨의 최종 농도 9.7로 산도를 조정합니다. </li><li> 판 차단 솔루션 : 스톡 폴리를 준비하려면 DI / DC 올리고,에 resuspend 1 단위 (~ 50 mg)의 폴리 디 / DC의 1 ~ 10 mM 트리스 / 염산, 50 μg의 재고 농도 1 mM의 EDTA를 포함하는 pH를 7.9 ㎖ / μL. 주식은 1 ㎍ / ㎕를 사용하기 전에 희석된다. </li></ol> 1.3 세척 버퍼와 항체 희석 참고 : 스트렙 타비 딘 세척 버퍼는<html> 추가 사이에 접시를 씻어 수 있으며, 1 차 및 2 차 항체를 희석하는 데 사용됩니다. <ol><li> 스트렙 타비 딘 세척 버퍼 1 L를 준비하려면, 2.4 g 트리스 / 염산 37.5 ㎖ (4 M의 NaCl), 10 ㎖ (10 % BSA), 5 ㎖ (10 % 트윈 20), 1 L 밀리 포아 멸균 여과 물을 추가 , 산도 7.18. 4 ℃에서 보관 최종 농도 : 20 mM 트리스 / HCl을 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % BSA, 0.05 % 트윈 -20. </li></ol> 1.4 DNA 결합 버퍼 참고 :이 버퍼는 -20 ° C.에 저장된다 <ol><li> DNA 결합 완충액 15 ㎖를 준비하려면, 180 μL (1 M HEPES, 산도 7.9), 300 μL (3 M의 KCl), 12 μL (0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0), 7.5 μL (1 M DTT), 3.0 mL를 넣고 (60 % 글리세롤), 300 μL (50 ㎍ / ㎕의 폴리 디 / DC) 증류 / 탈 H 2 O (12 ㎖)으로 희석. 최종 농도 : 12 mM의 HEPES / pH가 7.9, 60 밀리미터의 KCl, 0.4 mM의 EDTA, 0.5 mM의 DTT, 12 % 글리세롤, 1 ㎍ / ㎕의 폴리 디 / DC. </li></ol> 2. 세포 배양 및 핵 단백질 분리 t &quot;&gt; 참고 :.. 준비는 각 실험에 사용되는 세포의 수는 달라질 세포의 자극이 실험에 따라 달라집니다 약 3 시간을 필요로하고 모든 볼륨은 3 × 10 7 세포 / 포인트를 사용하여 일반적인 실험을 반영 수용하기 위해 볼륨을 조정합니다. 실제로 실험 6에서 사용한 셀 번호. <ol><li> DNA 결합 분석, 적절한 용지 6 RUNX2 (내피, 골육종, 유방암 세포)를 표현하는 문화를 인간의 세포 핵 단백질을 준비합니다. </li><li> G2 / M 세포주기의 경계 6시에 세포를 체포하기 위해 노 코다 졸 (16 시간 0.2 ㎍ / ㎖)으로 subconfluent 세포를 치료. 이러한 조건 하에서, RUNX2 단백질 안정화와 최대 결합 DNA가 달성된다. 여러 분석 및 억제제는 같은 준비에서 비교 될 수있다이 방식으로, 충분한 핵 단백질을 사용할 수 있습니다. </li><li> 각 단계, 4 ° C에 원심 분리기를 사전 냉각 및 버퍼를 준비하고 세포 수확하기 전에 4 ° C에서 20 분을 진정.</li><li> 칠 세포 (4 ℃)와 얼음에 실시 절차. </li><li> 15 ㎖의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 관에서 5 분간 1,000 rpm으로 원심 분리기 세포. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS로 세척 1X (칼슘 2 + 및 Mg를 2 + 무료). </li><li> 다시 원심 분리기와 PBS의 상층 액을 버린다. </li><li> 완전 세포 펠렛을 재현 탁주의하면서, 단백질 분해 효소 억제제없이 저장성 버퍼 500 μl를 추가합니다. </li><li> 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 내용을 전송합니다. </li><li> 즉시 5.5 분 동안 5,500 rpm에서 원심 분리, 상층 액을 버리고 세포 펠렛을 유지합니다. </li><li> 0.5 % NP40을 함유 저장성 완충액 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 단백질 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제와 0.5 mM의 DTT을 (단계 1.1.5에 설명 된대로)를 추가합니다. </li><li> 샘플이 30 분 동안 얼음에 휴식 할 수 있습니다. </li><li> 10 분 동안 13,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 상층 액 (세포질 단백질을 포함)을 폐기하십시오. </li><li> 60 ㎕의 낮은 샐 각 핵 펠렛을 재현 탁T 버퍼 (되는 단백질 분해 효소 억제제와 0.5 mM의 DTT 단계 1.1.5에서 추가되었습니다), 120 μL의 총에 대한 높은 소금 버퍼 (되는 단백질 분해 효소 억제제와 0.5 mM의 DTT 단계 1.1.5에서 추가되었습니다.) 첫 번째 펠릿을 Resuspend 낮은 소금 버퍼의 60 μl를 추가하고 높은 소금 버퍼의 60 μl를 추가합니다. 재 부상에 도움이 펠렛을 소용돌이. </li></ol> 참고 :이 단계는 핵 막 단백질의 일부​​를 제거하는 데 도움이 용해 단계 설정 : 저 염분 처음 (에 resuspend 펠렛, 소용돌이), 다음 높은 소금 (소용돌이)이 단계를 최적화합니다. 처음 10 분 후 소용돌이로 교반과 함께 30 분 동안 얼음 추출 보관하십시오. <ol start="16"><li> 15 분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리기, 핵 단백질을 포함하는 상층 액을 유지합니다. </li><li> C. ° -80 단백질 농도 (2-5 ㎎ / ㎖에서 샘플을 유지하려고), 적절한 양 (10 μL / 관)에서 나누어지는 및 저장을 측정 </li></ol> 참고 : 예상 수익률 : 30 X 10 6 CELLS는 120 μL의 5 ㎍ / ㎕의 단백질을 얻을 것입니다. 5 × 10 6 세포는 40 μL에서 2.2 ㎍ / ㎕의 단백질을 얻을 것입니다. 3. 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드의 제조 <ol><li> 끝 호환 절반 사이트와 보완 올리고 뉴클레오티드를 디자인합니다. RUNX2 이러한 위치 : 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-비오틴 (감각)과 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-비오틴 (안티센스). </li></ol> 참고 : 세 RUNX2 결합 부위와 단일 엔드라는 비오틴이 가장 재현성 결과를 굴복 것으로 판단 파일럿 실험. <ol start="2"><li> 배 어닐링 버퍼를 준비 260 μL의 H 2 O (최종 600 μL)에 300 μL (1 M 트리스 - 염산, 산도 7.6), 30 μL (1 M MgCl2를 2), 10 μL (1 M DTT)를 추가합니다. </li><li> 각각의 단일 가닥 olig 200 pmol의에onucleotide (3 μL), 배 어닐링 버퍼의 12 μL, 60 μL (200 pmol/60 μL)의 총 45 μL의 H 2 O를 추가합니다. </li><li> 가열 블록에 5 ~ 10 분 동안 95 ° C에서 가열한다. </li><li> 65 ° 쿨 천천히 가열 블록 (또는 65 ° C의 물 50 ㎖에 배치하여의 전원을 끄기 천천히 실온으로 냉각 한 후, (65 ° C로 온도를 설정함으로써, 15 분 소요) C 얼음에 비커에,이) 15 ~ 20 분입니다. </li></ol> 4. 준비 96 - 웰 플레이트 참고 : 세척 버퍼에 우유 단백질을 사용하지 마십시오. <ol><li> 수정 플레이트 고정 용액 (0.1 M 탄산나트륨) : 추가 300 μL / 잘. </li><li> 실온 (RT)에서 락, 또는 더 4 ° C (O / N)에 락을 2 시간 동안 품어. </li><li> 스트렙 타비 딘 세척 버퍼 (WB)와 함께 접시에 배를 세척 : 300 μL / 잘 때마다 추가 할 수 있습니다. </li><li> 추가 비오틴 표지 이중 가닥 올리고 뉴클레오타이드 (3 합의 결합 부위 당 뉴클레오티드)에 대한 2 시간 wi 번째 (1.25 nmol의 /도, 100 μL / 잘) 락. </li><li> 차가운 WB 씻을 배는 300 μL / 잘 추가 한 다음 바로 싱크대에 접시를 반전하고 각 첨가 한 후 종이 타월에 가장자리를 얼룩. </li></ol> 참고 :이 아비딘을 긁어 수 있으므로 판에서 유체를 제거하기 위해 피펫 팁을 사용하지 마십시오 비오틴 : 우물에서 DNA 복합체. 이후의 모든 세척 단계에 대해이 작업을 수행합니다. 5. 핵 추출물과 함께 배양 참고 : 폴리 디 / DC 차단 버퍼에 연어 나 청어 정자 DNA를 대체하지 않습니다. 우유 단백질과 번호판을 차단하지 마십시오. 이러한 블로킹 제는 모두 높은 배경 값을 초래한다. <ol><li> 핵 추출물 (90 μL / 웰)에서 제조 된 특정 전사 인자에 품어. 핵 추출물을 포함하는 마스터 믹스를 준비 (DNA 결합 단백질을, 3-9 ㎍ / 웰) + 폴리 디 / DC 1X DNA에 (50 ㎍ / UL 재고 1 ㎍ / μL)의 버퍼를 바인딩. 볼륨 등의 총 수에 필요한필요한 우물 (90 μL / 웰). </li><li> 비타민 D3 (그림 2) 또는 CADD 화합물 5,221,975 (그림 3), 또는 에탄올과 같은 용매 컨트롤의 적절한 희석 등의 잠재적 억제제,이 단계에서 추가됩니다. </li><li> 4 ° C에서 O / N, 플랫폼 락에 장소 접시 </li><li> WB와 세척 배는 300 μL / 잘 추가 </li></ol> 6. 차 항체의 추가 참고 : 1 차 항체 희석 신선한 준비를해야합니다 - 저장하지 않는 것이 좋습니다. <ol><li> RUNX2 특정 단일 클론 항체 (주 1 ㎍ / μL) 2 / 10, 스트렙 타비 딘에 000 버퍼를 씻어 희석. 96 - 웰 플레이트 (90 μL / 웰) 세중의 각 웰에 추가를 위해 충분히 준비합니다. </li><li> 락을 플랫폼에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> WB 씻을 배는, 300 μL / 잘을 추가합니다. </li></ol> 7. 이차 항체의 추가 참고 : 2 차 항체 희석 STO이 될 수 있습니다다음날 필요 하룻밤 경우 4 ° C에서 빨간색. <ol><li> 스트렙 타비 딘에 1:1,400에 F AB-특이 적 친 화성 정제-HRP 결합 된 항체 (7.1 ㎎ / ㎖ 주식) 희석 버퍼를 씻어 : 3.5 μL의 antibody/5.0 ml의 세척 버퍼. 96 - 웰 플레이트 (90 μL / 웰) 세중의 각 웰에 추가를 위해 충분히 준비합니다. </li><li> 락을 플랫폼에서 RT에서 30 분 동안 품어. </li><li> 싱크 (300 μL / 웰)로 반전 판에 의해 WB 씻을 6 배. </li></ol> 8. HRP 기질 및 제품 개발 <ol><li> 주식 병에서 잘 직접 당 TMB 기판의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 20 분 알을 품다 (반응 법을 중지) 또는 직접 (연속 운동 모니터링)의 흡광도를 측정한다. </li></ol> 9. 반응 측정 <ol><li> 반응 법을 중지 시각 정지 반응, 푸른 분명에서 색상 변화를 확인하고 50 ㎕의 황산과 반응을 중지합니다. </li><li> 450 nm에서 흡광도를 측정한다Biotrak II 보이는 플레이트 리더의 분광 광도계 (아머 샴 바이오 사이언스, GE 헬스 케어 생명 과학 주식 피츠 카타 웨이 NJ, USA) 또는 유사한 악기. </li><li> 지속적인 운동 모니터링 방법 : 마지막 세척 후 기판을 추가하고 직전 분광 광도계에 배치하는 (반응을 정지하지 않는다). </li><li> 바이오 테크 시너지 HT 멀티 반응 마이크로 플레이트 리더 분광 광도계로 635 nm에서 흡광도를 측정한다 (바이오 테크 악기, Inc의,보기 Winooski, VT, USA) 또는 유사한 악기. </li></ol>

<ol>
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DNA-결합 분석은 DNA와 상호 작용하는 전사 인자의 능력을 측정하기 위해 사용된다. 바인딩 DNA에 대한 분석은 전기 이동성의 변화 (EMSA) 1 염색질 immuneprecipitation (칩)을 기준으로 분석 3뿐만 아니라 96 - 웰 형식에게 이러한 화학 발광 분석법 2와 4를 사용 분석을 포함한다. EMSA가 아닌 정량적이고 방사성 동위 원소 (32 P) 올리고 뉴클레오티드를 사용합니다. 이러한 핵 단...

DNA-결합 분석은 DNA와 상호 작용하는 전사 인자의 능력을 측정하는데 유용성을 갖는다. 바인딩 DNA에 대한 분석은 방사성 동위 원소 표지 된 올리고 뉴클레오타이드 1 또는 화학 발광 분석법에 달려있는 전기 이동성 이동 분석 (EMSA) 등이 있습니다. 96 - 웰 형식 4를 사용 염색질 immuneprecipitation (칩)을 기준으로 분석 3뿐만 아니라 분석도 기재되어있다. 그러나 EMSA는 방사성 표지 된 올리고 뉴클레오티드의 사용을 필요로 비 정량 분석​​법이다. 핵 단백질이 특정 염기 프로모터 서열에 연결할 때, 바인딩 단지는 폴리 아크릴 아마이드 젤에 지체하고 특정 전사 인자가 항체 &quot;supershift&quot;로 유효성을 검사 할 수 있습니다. 우리는 정의 된 프로모터 요소에 대응하는 DNA 결합 서열과 RUNX2의 상호 작용을 측정 할 수있는 효소 - 결합 면역 포맷 (D-ELISA)을 이용하여 정량적 인 DNA-결합 분석을 개발 IN 개의 RUNX2 표적 유전자. 반대로 RUNX2 항체의 사용은 분석 특이성을 제공하고, 방사선 표지의 부족은 전통적인 겔 쉬프트 분석이 분석에서 5 구별. 바인딩 착물의 검출은 분광 광도 분석을위한 착색 된 제품에 HRP 기질, 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)을 변환 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 결합 된 이차 항체를 이용하여 가능하다. 여기에보고 된 분석은 컨트롤과 같은 변이 된 DNA 올리고 뉴클레오티드의 사용을 포함 할 수 있으며 DNA 결합의 경쟁적 또는 비 경쟁적 억제제의 검출을 위해 사용될 수있다. 새로운 항 종양 화합물의 심사는이 분석도 가능하다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

이러한 전기 영동 이동성 이동 분석 (EMSA), 화학 발광 분석법, 크로 마틴 면역 침전 (칩) 기반의 분석 및 멀티 웰 기반의 분석과 같은 많은 DNA-결합 분석은 전사 인자의 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 분석은, nonquantitative 있습니다 특이성이 부족, 방사성 동위 원소 표지 된 올리고 뉴클레오티드의 사용을 포함 할 수 있으며, 바인딩 DNA의 억제제의 검사에 대한 적응력이되지 않을 수 있습니다. 한편, 정량적 DNA 결합 효소 결합 면역 분석법 (D-ELISA) 분석을 이용하여, 우리는 바이오틴에 존재 컨센서스 DNA 결합 서열과 특정 관계에 의존 RUNX2 전사 인자를 사용하여 DNA와 핵 단백질 상호 작용을 보여 표지 올리고 뉴클레오티드. 세포의 제조, 핵 단백질, 및 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드의 디자인의 추출 기술되어있다. 아비딘 코팅 된 96 - 웰 플레이트는 알칼리성 버퍼 고정 염기 차단 버퍼의 핵 단백질로 배양된다. FOLL플레이트의 광범위한 세정 특정 일차 항체 및 이차 항체 배양을 인해서 비색 반응 냉이 퍼 옥시 다제 기질과 발전 첨가하여된다. 정지 반응 키네틱 모드 또는 연속 모니터링 정량적 DNA와 단백질의 상호 작용을 측정하기 위해 사용되었다. 우리는 비 특이 IgG 또는 단백질 또는 일차 항체없이 치료 등의 적절한 특이성 컨트롤을 설명합니다. 분석의 응용 프로그램은 그 약물 검사에서 유틸리티 대표 긍정 및 부정적인 결과를 설명하는 등의 설명되어 있습니다.

D-ELISA 방법은 한 합의 RUNX2 결합 부위 (ACACCA) 3 부작을 포함하는 일련의 별, 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드를 사용으로 지정된 DNA 결합 단백질에 대한 매우 구체적인입니다. 단백질 인자를 인식 차 항체는 특이성을 향상시킨다. 차 항체 검출의 용이성 (그림 1)에 대한 착색 된 제품에 명확한 기판 (테트라 메틸 벤지딘)를 변환 공유 결합 된 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)가 포함되어 있습?...

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A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

우리는 DNA 전사 인자와의 상호 작용을 측정하는 정량적 DNA-결합, ELISA 기반 분석법을 개발 하였다. RUNX2 단백질에 대한 높은 특이성은 합의 DNA 인식 올리고 뉴클레오티드 및 특정 단일 클론 항체를 달성했다. 효소 결합 항체 반응 기질과 발색 검출은 실시간으로 모니터링 하였다.

유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

a-quantitative-assay-to-study-proteindna-interactions-discover

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K 조회수.  University of Maryland School of Medicine.  우리는 DNA 전사 인자와의 상호 작용을 측정하는 정량적 DNA-결합, ELISA 기반 분석법을 개발 하였다. RUNX2 단백질에 대한 높은 특이성은 합의 DNA 인식 올리고 뉴클레오티드 및 특정 단일 클론 항체를 달성했다. 효소 결합 항체 반응 기질과 발색 검출은 실시간으로 모니터링 하였다. 

비디오: A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.