Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

הפרוטוקולים הבאים מתארים את הנוהל מפורט לג עור elegans פצע ולמנסה לאמוד את תגובות פצע. 1. מחט פציעת 3,4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תולעי unstarved בריאים על NGM הסטנדרטי (מדיום גידול נמטודות) צלחות עם E. חיידקי coli OP50 כמזון, נשמרו בחממה C ° 20. הערה: שיטות לצלחות אגר NGM וטיפוח שיגרתי של ג ניתן למצוא elegans בשעה 6 www.wormbook.org. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 25 תולעי שלב L4 ליום 1 צלחת טרי נזרע לפני פצעת והתרבות ב 20 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני פצע, למשוך מחטים מנימים באמצעות חולץ מחט. המחטים המשמשות בפציעה זהות לאלה המשמשים לmicroinjection של ג elegans. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכל התולעים נמצאים בשלב בוגר צעיר. מניחים את הצלחת של תולעים על קרח למשך כ -30 דקות. קירור גורם לבעלי החיים להיות איטיים, להקל על פציעת מחט. <br /&gt; הערה: בתוך 5 דקות של ההסרה מהקרח, התולעים יתחילו לנוע בדרך כלל. זה אפשרי אך מאתגר לפצוע תולעים נעו. עם ניסיון, 5 דקות זה מספיק זמן כדי פצע 25 תולעים. לשתק עם תרופות כגון levamisole (כמו בשימוש בליזר פציעה, ראה בהמשך), אם כי בעלי החיים ייקחו זמן רב יותר להתאושש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת אגר מהקרח לסטראו לנתח. באמצעות איסוף תולעת, להעביר 25 תולעים למרכז הצלחת אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט לתוך קצה פיפטה 100 μl להחזיק את המחט בקלות רבה יותר. לנקב את החלק הקדמי או אחורי של הגוף של התולעת עם המחט, הימנעות בלוטת המין. באופן כללי, תנסה לפצוע בין בלוטת מין הלוע האחורי וקדמי, או בין בלוטת המין האחורית ופי הטבעת. מחטי שימוש חוזרים פעמים רבות, עד שהם ישברו. הערה: ודא פצעי דקירות הם קצרות, עדינות שלנקב את הציפורן ועור, חודר ~ 5-10 מיקרומטר לבעלי החיים. המחט צריכה להיכנס לעניםאל בזווית של כ זכות העור. הפצעים לא צריכים לגרום לניזק ברור לאיברים פנימיים, או קרע מיידי של הגוף. שים לב כמות קטנה של ציטופלסמה נוטף החוצה לכמה שניות לאחר שהפצע; עם זאת, אם תוכן סלולארי לדלוף החוצה במשך זמן ממושך בעלי החיים לא ישרדו. עבור הדמיה אופטימלית, פצע syncytium רוחב אפידרמיס (hyp7) או התפר לרוחב. הערה: הליך זה כולל את השימוש במחט זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר תולעים להתאושש בRT אז תרבות ב 20 ° C. לשפוט את ההצלחה של פציעת מחט על ידי מספר מבחני שיתוארו להלן. יותר מ 95% של בעלי חיים מסוג בר לשרוד 24 שעות לאחר המחט פצעה בשלב הבוגר הצעיר. ההשפעה פצע בזחלים בוגרים או מבוגרים טרם ניתחה בהרחבה. </li></ol> 2. לייזר פציעת 3 השתמש בהקרנת לייזר פמטו-שנייה (800 ננומטר) לבצע פציעה מדויקת יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן p אגרמודעות בשקופיות זכוכית עם אגר 2% מותכים 7. ודא הרפידות דומות לרפידות אגר המשמשות להדמית חיה של ג elegans. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 10 תולעים בוגרות צעירות על כרית agarose עם בחירת תולעת, ולהוסיף טיפת 2 μl של 12 מ&quot;מ פתרון levamisole. לכסות את בעלי החיים ואת הנוזל עם להחליק את המכסה. חכה 1-2 דקות לתולעים לשתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף הזכוכית על מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב. הזז את הבמה כדי למצוא את התולעים ולהתמקד באפידרמיס הרוחב הקדמי או האחורי syncytial עם מטרת 100X (NA 1.4-1.46). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הכח של לייזר פמטו-השני ל -140 mW (נמדד לפני האובייקטיבי). השתמש בליזר פמטו-השני בשיעור החזרה של 80 מגה-הרץ. הערה: שתי פעימות של 200 אלפיות שניים כל אחת (מופרדים על ידי 20 אלפיות שני) מספיקות לפציעתם בידיים שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על משטח הפסגה של תאי אפידרמיס ופצע האפידרמיס. שים לב שיבוש מקומי של ציטופלסמה (מבעבעת), או o הלבנה המקומיתf כל סמן פלואורסצנטי משמש. הערה: בצע נהלי בטיחות לייזר מתאימים בעת שימוש בליזר פמטו-השני. סריקות קו או נקודה באמצעות לייזרי femtosecond כגון אלה בשני מיקרוסקופי פוטון אמורות לספק מספיק כוח לפציעת לייזר. הערה: למרות שאין לנו חוויה ישירה של שימוש בלייזרים אחרים, בפציעת עיקרון צריך להיות אפשרי באמצעות לייזרי UV קונבנציונליים (כפי שהוא משמש C. elegans כריתת תא). לחלופין, השתמש בשחזור הקרינה לאחר photobleaching מודול (FRAP) על ספינינג confocal דיסק לפצוע את האפידרמיס (נ Pujol, תקשורת אישית). </li></ol> 3. ויזואליזציה של תגובות 2 + Ca עוריות לפציעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ג המהונדס זני elegans המבטאים Ca 2 + חיישנים (כמו אלה של סדרת GCaMP) באפידרמיס, תחת השליטה של האמרגן הספציפי אפידרמיס המבוגר col-19 (איור 1 א; transgenes מפורטים ב <strong&gt; לוח 1). השתמש transgene לבטא חלבון ניאון אדום כגון tdTomato כבקרה פנימית לרמת ביטוי transgene. הערה: יש לנו להשתמש tdTomato כבקרה פנימית לביטוי transgene כקרינת tdTomato אפידרמיס היא יציבה יחסית ואינו מפריעים להדמית GCaMP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט והן לייזר ופצע את הדק העלאת Ca 2 + באפידרמיס. עם זאת, כפי שפציעת מחט לא ניתן לבצע בקלות על confocal דיסק ספינינג, פציעת לייזר עדיפה לניתוח כמותי של תגובת Ca 2 + (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות זמן לשגות במצב רב-ממדי רכישה (מרווח זמן 2 שניות ל -114 חשיפת לייזר עירור msec) באמצעות דיסק מסתובב confocal עם מטרת 100X (NA 1.4-1.46) ומערכות סינון מתאימות (מסנני GFP יעבדו עבור GCaMP3). הערה: רכישת הזמן לשגות תמונות בכל 30 שניות בערך 2 שעות לבחון את שו&quot;ת Ca 2 +onse לפצע מעל כמובן זמן ארוך יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת ניתוח תמונה למדוד את הקרינה GCaMP הממוצעת בעשרת אזורים מקבילים של עניין (ROI), בם חמש התמקדו בcytosol תא אפידרמיס וחמישה ברקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקרינה בסיס (F 0) על ידי חישוב ממוצע הקרינה ב5 ROIs באפידרמיס אז הפחתה הממוצעת של 5 ROIs ברקע לפני פציעה. הגעה השינוי בΔF הקרינה כיחס בין השינוי ביחס לנקודת ההתחלה [(-f F t 0) / F 0]. </li></ol> 4. ויזואליזציה של F- אקטין Dynamics לאחר הפציעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: בתגובה לפציעת מחט, להתבונן טבעת אקטין באתר הפצע שסוגר בהדרגה סביב הפצע. מבחני סעיף פרוטוקול זה פצע סגירה על ידי מדידת קוטר הטבעת אקטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תולעים מהונדסים המבטאים סמן F- אקטין כגון תחום תסיסנית אקטין moesin מחייב התמזגGFP, הביע תחת שליטתו של אמרגן ספציפי אפידרמיס כגון col-19 (איור 2 א) (transgene juIs352). הערה: יש לנו להשיג תוצאות דומות באמצעות אקטין אחרים מחייבים סמני תחום כגון Lifeact או F-tractin (תוצאות לא פורסמו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מחט פצע על col-19- תולעים מהונדסים GFP-moesin P. לאחר פציעת מחט, להתבונן טבעת של ה- GFP-moesin סביב אתר הפצע על ידי ~ 5 דקות. הטבעת אקטין הופכת להיות קטנה יותר בקוטר וסופו של דבר נסגרה 2-3 שעות שלאחר פציעתם בחיות בר סוג (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן משטח אגר 2% בשקופית זכוכית ולהעביר 10 תולעים על הכרית בפתרון 2 μl 12 מ&quot;מ levamisole. תמונת טבעות GFP-moesin שעה 1 לאחר פצע באמצעות מיקרוסקופ confocal הקונבנציונלי. הערה: מיקרוסקופיה confocal השימוש לרכוש Z- ערימות (13 x 0.5 מיקרומטר) של טבעות אקטין שעה 1 לאחר פציעתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את קוטר טבעת אקטין לאחר פציעתם. כדי לכמת את אפידרמיס GFP-moesin, ראשון לעשות הקרנת עוצמה מקסימלית של Z- המחסנית ולאחר מכן לצייר 4 סריקות קו (ב 45 מעלות זה לזה) על טבעת GFP-moesin. קוטר טבעת מוגדר כשיא הממוצע למרחק שיא של סריקות ארבע קו (איור 2). לטבעות שכבר נסגרו, הקוטר מוגדר כ0 מיקרומטר. הערה: טבעות F- אקטין בנוחות נמדדות לאחר שעה 1 פצעו כמו זה היא כמחצית דרך בתהליך סגירת הפצעים בסוג בר. ניתן גם למדוד טבעות F- אקטין בנקודות זמן מרובות כדי להפיק במהלך סגירת פצע זמן. סרטי זמן לשגות של סגירת פצע ניתן לרכוש באמצעות תולעים-משותק levamisole ומסתובב מיקרוסקופיה confocal דיסק. </li></ol> 5. האינדוקציה Assay של פפטידים Antimicrobial עוריות הערה: פציעה גם מפעילה תגובה חיסונית מולדת בג עור elegans. שעתוק של גני קידוד פפטידים מיקרוביאלית (אמפר) הוא induced באפידרמיס. AMP NLP-29 (החלבון כמו neuropeptide-) מושרה בחום על ידי פצע 4. לassay איך האפידרמיס שולט ביטוי AMP לאחר פציעה, להשתמש כתבים מהונדסים או בזמן אמת PCR לגילוי רמות תמליל AMP בודדים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay כתב המהונדס לתגובה חיסונית מולדת פצע 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע פציעת מחט (כמו בפרוטוקול 1) על בעלי חיים מבוגרים המבטאים את הכתב המהונדס frIs7, המכיל NLP-P 29. GFP וP col-12 DsRed כבקרה פנימית. תצפיות על בעלי חיים מבוגרים unwounded אדומים או כתומים כהים כמו במסנן מסירה ארוכה GFP. הערה: תולעי wild-type פציעה יגרמו NLP-29 -GFP ביטוי P אבל לא ישפיעו col-12 P -dsRed, וכתוצאה מכך תולעים המופיעים כתום, צהוב, ירוק או תחת תאורת מסירה ארוכה GFP. אובדן התפקוד של גנים במסלול MAPK p38, כגון ורוד-1 או nsy-1 יחסום NLP-29 -GFPאינדוקציה לאחר פצע 4. GFP P NLP-29. באו לידי ביטוי ברמות גבוהות בשלבי זחל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מבחני אינדוקציה AMP בבעלי חיים מבוגרים צעירים. ודא שיש לי חיות שליטת unwounded רמות נמוכות של GFP. הערה: NLP-29. ביטוי P GFP גם הנגרם על ידי לחץ האוסמוטי 8, ועלול להיות רגיש ללחצים סביבתיים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 שעות לאחר פציעה, ציון המספרים של תולעים שיש לי NLP-29 -GFP אינדוקציה P (איור 3) 9 באמצעות הקרינה לנתח היקף עם מסנן ארוך לעבור GFP. הערה: בGFP NLP-P 29. לאחר הפציעה-שעה 1 מושרה בעליל, שהגיע לשיא על פוסט פציעה-6 שעות ולאחר מכן נותר גבוהה עד להודעה פציעת 24 שעות. לכמת ביטוי על ידי 4,9 ניקוד חזותי. לחלופין, לכמת רמות ביטוי באמצעות סדרן תולעת הקרינה הופעלה 4. לסדרן התולעת, לפחות 50 בעלי חיים צריכים להיות פצועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן אמת assay PCR לקואהntitating רמות תמליל גני AMP הבודדים. רמות תמליל assay עבור מספר גנים: NLP-29, NLP-30, cnc-1, וcnc-5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מחט פצע על wild-type או תולעי מוטציה (ראה פרוטוקול 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 50 תולעים נפצעו ו -50 תולעים unwounded בזמנים הרצויים (למשל 3, 6, 24 שעות) לאחר פציעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ RNA באמצעות ערכה מסחרית הבא הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שעתוק לאחור כדי לקבל כולל cDNA 20 μl באמצעות ערכת transcriptase הפוכה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לRT-PCR, להשתמש 0.2 μl cDNA (1/40) מכל מדגם בשילוב עם Supermix ירוק עם העמסה ו -0.2 מיקרומטר פריימרים. כדי להשוות איכות RNA, להשתמש ama-1 או SNB-1 RT-PCR כהתייחסות; להשוות את רמת הביטוי היחסית AMP ידי נרמול לבקרה פנימית (AMA-1 או SNB-1), או להשוות לאחר פציעת אינדוקציה לקפל (אינדוקציה AMP בתולעים פצועים / תולעי unwounded) על ידי נורמהalizing לבקרה פנימית. הערה: cnc-1 וcnc-5 הן caenacin פפטידים מיקרוביאלית משפחת השעתוק שמופעל על ידי פצע 10. בדרך כלל, פציעת מחט גורמת ביטוי (~ 500 פי לcnc-1) על קורס של 4 שעות 10 זמן. Primers המשמש בעבודה שפורסמה שמותיהם מופיעים בטבלה 2. </li></ol> 6. Assay הישרדות לאחר הפציעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: פציעה מפעילה לפחות שני מסלולים עצמאי איתות באפידרמיס: מסלול Ca 2 + פצע תלוי תיקון ומסלול התגובה חיסוני המולדת. שני המסלולים נדרשים להישרדות מלאה של פציעת סטרילי. כדי לבדוק אם מוטציה או טיפול RNAi משפיע ריפוי פצע, למדוד הישרדות בהודעת פציעה 24-48 שעות. לחלופין, להשתמש במבחני תוחלת חיים מקובלים על מנת לקבוע את ההשפעה של פצע על אריכות ימים 4,9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מחט פצעה במבוגרים צעירים (L4 + 24 שעות) תולעים (50 תולעים, seve חוזרפעמים RAL) בעקבות פרוטוקול 1 לעיל. לשמור על מספר שווה של תולעי unwounded כפקדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו הישרדות בכל שעה 24 (תולעים פצועים העברה לצלחת אגר חדשה בכל שעה 24). שים לב ~ 50% הישרדות 24 שעות לאחר פציעתם במוטציות שהם פגומים תיקון פצע כגון GTL-2 או טיר-1, כאשר מנורמל לבעלי חיים שליטה unwounded. מוות מוגדר כחוסר התגובה של תנועה לגעת ידי בחירת תולעת. </li></ol>

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses.">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G&#945;q-Ca2++signaling+pathway+promotes+actin-mediated+epidermal+wound+closure+in+C.+elegans.">A G&#945;q-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans.</a> Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Chisholm, A. D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II:+differentiation+and+physiological+roles.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology.</a> 48, 225-250 .</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, (2008).</li><li>Tong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Caenorhabditis+elegans+epidermal+damage+responses+by+death-associated+protein+kinase.">Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).</li><li>Zugasti, O., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+of+antimicrobial+peptide+expression+by+a+noncanonical+TGF-beta+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+epidermis.">Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis.</a> Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip-based+C.+elegans+microinjection+system+for+investigating+cell-cell+communication+in+vivo.">Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo.</a> Biosensor., &amp; Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).</li><li>Jansson, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants.">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li><li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bacterial+pathogen,+Microbacterium+nematophilum,+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans.">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

השיטות שהוצגו כאן למחט ופציעת לייזר לספק גישות משלימות להערכת היכולת של האפיתל אפידרמיס לתקן את הנזק. פציעת לייזר היא יחסית מקומית ו( בהתאם לתצורת לייזר) יכול להיות מוגבל לאפידרמיס, ואילו פציעת מחט משבשת את האפידרמיס, ציפורן, וקרומים מרתף פנימיים סביר. פציעת מחט עשוי?...

מנגנוני ריפוי עור פצע הם עניין ביולוגי בסיסי ורלוונטיים לבריאות אדם. ריפוי פצעים בבעלי חוליות ויונקים כולל סדרה מורכבת של תגובות מתואמות של רקמות רבות ואיתות 1. אורגניזמים מודל גנטי פשוטים רבים הם גם מסוגלים ריפוי פצעי עור 2. לכן זה עניין לנתח מודלים גנטיים צייתנים של תיקון פצע עור. אנו ואחרים החלו להשתמש elegans Caenorhabditis כמודל חדש לפצע עור ריפוי 3,4. המטרה של פרוטוקול זה היא לאפשר למגוון רחב יותר של חוקרים להשתמש בג elegans ככלי לחקור מנגנונים מולקולריים ותאיים של ריפוי הפצע באפידרמיס. ג עור elegans כולל את האפידרמיס (הידוע גם בבהיפודרמיס) וציפורן תאית 5. האפידרמיס המבוגר נוצר ממספר קטן של syncytia multinucleate, מתוכם הגדול ביותר הוא k syncytiumnown כhyp7. האפידרמיס הוא אפיתל פשוט שמפריש לציפורן על משטח הפסגה שלה. העור יכול באופן פעיל בהגנה מפני פתוגנים-חודר עור ולתקן פצעים קטנים 4. תיקון פצע של ג עור elegans הוא איתן, שכן כמעט כל בעלי החיים מהסוג בר לשרוד יכולים לשרוד פצעי דקירה קטנים הנגרמים על ידי מחטים, או נזק לעור מקומי הנגרם על ידי קרינת לייזר. ג פציעת עור elegans מפעילה חבילה של תגובות, כולל תגובת אפידרמיס מולדת חיסונית, סגירת פצע, והיווצרות צלקת 4. האפידרמיס המבוגר הוא שלאחר mitotic-, וריפוי פצעים כרוך תגובות הסלולר מקומיות בניגוד לריבוי אפידרמיס או נדידת תאים. הראינו כי פציעת העור גורמת עלייה גדולה ומתמשכת באפידרמיס Ca 2 +, המחייבת את ערוץ TRPM קרום GTL-2 וCa 2 + חנויות פנימיות 3. אות אפידרמיס 2 + Ca נדרשת להיווצרות וסגירת טבעות F- אקטין בוואתר und. פציעה גם גורמת תגובה חיסונית מולדת המפעילה את השעתוק של מגברים כגון NLP-29. השעתוק מושרה פציעתם של אמפר תלוי בTIR-1 מפל kinase MAP p38 / PMK-1 פועל באופן עצמאי באפידרמיס 4. פגמים באו מסלול איתות Ca 2 + או בתגובה החיסונית המולדת יובילו להישרדות נמוכה לאחר פציעה. המבנה פשוט יחסית של ג elegans האפידרמיס, נְהִילוּת הגנטית ויתרונות לin vivo הדמיה לעשות את זה מערכת מצוינת ללמוד היבטים רבים של תיקון פצע. כאן אנו מציגים פרוטוקולים לשתי שיטות נפוצות של פציעה: פציעת מחט ופציעת לייזר. פציעת מחט לא דורשת ציוד מיוחד (למעט חולץ המחט), ועם ניסיון יכולה להתבצע על מאות תולעים בכל יום. פציעת מחט מתבצעת על בעלי חיים גדלו על צלחות אגר. בניגוד לכך, פציעת לייזר מבוצעת על anesבעלי החיים thetized רכובים על אגר כריות מתחת coverslip, והוא מתאים להדמית חיה של התגובות התאיות לנזק.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Name</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:227px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:227px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:227px;">CA3510-8</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Plastic Petri plate</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">T3308</td>
			<td style="width:227px;">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Levamisole</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">L9756</td>
			<td style="width:227px;">12 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;"><a name="RANGE!A5">Borosilicate Glass Capillary&#160;</a></td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:227px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Needle puller</td>
			<td style="width:227px;">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:227px;">P-2000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Worm pick (Platinum wire)</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">PT-9010</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:227px;">M9 solution</td>
			<td style="width:227px;">Home-made</td>
			<td colspan="2" style="width:453px;">3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Trizol</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:227px;">15596026</td>
			<td style="width:227px;">Use 500 ml for 50 worms</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">iQ SYBR Green</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:227px;">1708882</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">SuperScript III</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:227px;">18080-051</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">PCR machine</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">C1000/CFX96</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">96-well PCR tubes</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">MLL9601</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:227px;">Metamorph</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

ג elegans האפידרמיס וציפורן ליצור שכבת עור אך מתוחכמת פשוטה שיכול לתקן את הנזק מקומי כתוצאה מפציעתם. מחקרים של תגובות פצע ותיקון במודל זה מואר ההבנה של cytoskeletal ותגובות הגנומי לנזק לרקמות שלנו. שתי השיטות הנפוצות ביותר לפצע ג עור בוגר elegans הם דקירות במחטי microinjection, והקרנת לייזר מקומית. מחט פצעה מקומי משבשת את הציפורן, האפידרמיס, ומטריצת חוץ-תאית הקשורים, וגם עלול לגרום נזק לרקמות פנימיות. תוצאות קרינת לייזר בנזק יותר מקומי. פציעה מפעילה רצף של תגובות assayed בקלות כולל אפידרמיס הגבוה Ca 2 + (שניות-דקות), היווצרות וסגירת טבעת המכיל אקטין באתר הפצע (1-2 שעות), שעתוק מוגבר של גני פפטיד מיקרוביאלית (2-24 שעה), והיווצרות צלקת. בעיקרו של דבר את כל בעלי החיים המבוגרים הסוג בר לשרוד פציעה, שבוכמוטציות פגומות תיקון פצע או תגובות אחרות מראים ירידה בהישרדות. פרוטוקולים מפורטים למחט ופציעת לייזר, ומבחנים לכימות והדמיה של תגובות פצע ותהליכי תיקון (דינמיקת Ca, אקטין דינמיקה, אינדוקציה פפטיד מיקרוביאלית, והישרדות) מוצגים.

לייזר או פציעת מחט יפעיל העלאה מהירה ומתמשכת ברמות Ca אפידרמיס, כמו דמיין עם חיישני Ca כגון GCaMPs (איור 1). העלאת Ca מתרחשת תוך שניות, ונשארה גבוה במשך עשרות דקות. מחט פצעה reproducibly תוצאות בהיווצרות של טבעות F- אקטין באתרי פצע (איור 2); אלה מופיעים בתוך דקות, ובה...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans at JoVE.com

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.2K Views.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Video: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

פרדיגמות אפיון תרופתי של C. elegans מוטאנטים הילוכים Synaptic

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...