מומן על ידי NIH P40 OD010952, קרן Korein, אוניברסיטת מיאמי המלגה לSLC ואחוות Maytag לATK. המחברים תודה להכיר את צוות של המשאבים הלאומי לAplysia, כמו גם לורן Simonitis וחנה פק, שסיפק micrographs לדמות.

1. הכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, לשקול ולהרדים בעלי חיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 30 ק&quot;ג חיה G-1. הרדימי במחזורי 5-10 בעלי חיים של 1:1 מי ים: MgCl איזוטוני. 6 שעות 2 0 במשך שעה 1 עם אוורור כגון משאבת אוויר אקווריום חשמלית עם airstone המצורף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדאי להכין ציוד לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מגש חיתוך נקי עם סיכות ישרות מנירוסטה, כגון סיכות בד. להרכיב כמה צלחות פטרי המכילות מי ים מלאכותי (ASW; ראה לוחות 1 ו -3) + פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש מיקרוסקופ חשמל נמוך מוכן. יש מכשירי חיתוך נקיים מוכנים, כגון האף מצולעים ומלקחי כירורגיות בסדר, ובסדר ומספריים כירורגיות גדולים. לרסס את המכשירים עם 70% אלכוהול isopropol לפני השימוש ולאפשר לו להתייבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים עמדו על מגש לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדת חיה צד למטה הגחון במגש לנתיחה. בעלי חיים פיןדרך קצוות של קיר גוף וגבולות parapodial, אך להימנע מזנב וראש, כדי לחשוף את פני השטח הגבי וחריץ איברי המין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המשטח הגבי במים ברז קרים והאיטי בריצה. החל זרם אור של 70% אלכוהול isopropol מבקבוק לחיץ לאורך חריץ איברי המין ועל החלק העליון של הראש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החתך הראשוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ כוח נמוך (ראה טבלה 2) ובא לידי ביטוי באור כדי לראות את הנקודה שבה חריץ המין נובע ממרווח הקליפה הקדמי, מתיחות להחזיק עם מלקחיים מצולע האף קיפול של רקמה בצד השמאל של מקור זה, תוך חיתוך רדוד חור לאורך כל הדרך החלק, האזור השטוח של קיר גוף רק בצד ימין של חריץ איברי המין עם מספריים בזווית משובחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemolymph יש לשים לב לשפוך מהחור, לעתים נושא עימה גנגליון בטן והבטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב את החתך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים גדולים כדי להרחיב את החתך דואר anteriorly לנקודה בין rhinophores, תוך משיכת כלפי מעלה עם הלהב התחתון, כדי למנוע גניבת ציוד המעיים. האיברים הפנימיים יקויימו לשפוך מתוך החתך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגרעינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את המגש ולמקד את המיקרוסקופ באזור הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים נקיים ומספריים עדינים, הסר את גרעיני הראש על ידי ניתוק בנקודה אחת את העצבים היוצרים את גרעיני הראש לתוך טבעת סביב הוושט כדי להסיר צדר-דוושה ומוחות גרעיני כקבוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גנגליון buccal ששומר על צד הגחון של הוושט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גנגליון הבטן על ידי חיתוך 4 connectives העצב גדול שהנושא מגנגליון זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הגרעינים של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך גרעיני ראש בנפרד, ומשאיר באורך של connectives מחובר זה לזה גנגליון של עניין ששווה לפחות הקוטר של גנגליון, זה יהיה לעכב אנזים יתר מערכת העיכולשל התאים של עניין בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים את כל גנגליון היעד באמצעות 2 שטיפות של ASW + P / S, נע בין שטיפות עם מלקחיים נקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מיקוד תאי PVC, השאר את hemiganglion צדר הזכות צמודה לhemiganglion הדוושה הימנית, ובאופן דומה לעזוב את hemiganglion צדר השמאלי מחובר לhemiganglion הדוושה השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך הגרעינים לא רצויים ושאר בעלי החיים על פי נוהג מקובל במחקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enzymatically לעכל את הגרעינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל גנגליון, להכין 1 מ&quot;ל של תמיסת אנזים בהיקף של 3.75 מ&quot;ג dispase, hyaluronidase 1 מ&quot;ג ו0.3 גרם collagenase הסוג XI לכל מ&quot;ל של ASW + P / S בצינור פוליפרופילן חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום נשטף הגרעינים בפתרון אנזים ולצרף את הכובע בחוזקה. מניחים את הצינור על צידו על שייקר סיבובי (ראה טבלה 2) במהירות איטית לשעה 13-5 בלילה כ 23 מעלות צלזיוס (טמפרטורת חדר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכןמנות התרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני microdissection (יום 2), להכין מנות התרבות במכסת מנוע בתרבית רקמת פולי-D-ליזין (PDL) מצופים. הוסף ~ 0.5 מ&quot;ל PDL (0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מים סטריליים) למרכז צלחת 35 מ&quot;מ ל~ 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את PDL 3x עם מים סטריליים. לאפשר לו להתייבש. UV-לעקר את הצלחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 בודד תאי עצב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מרכז 35 מנות מ&quot;מ שהיו PDL מצופה וUV מעוקר עם כ 0.5 מ&quot;ל של ASW + P / S כדי ליצור אי של מדיה בתוך הצלחת אחרת היבשה. ניתן לעשות זאת על הספסל, מחוץ למכסת מנוע בתרבית הרקמה. צלחת אחת צריכה להיות מוכנה לכל אשכול של תאים שמקורם hemiganglion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש צלחת לנתיחה בקוטר 100 מ&quot;מ מוכן שנעשתה על ידי sylgard ציפוי וריפוי משטח 5 מ&quot;מ עמוק נתיחה, לבוש עם סיכות לנתיחה קנס של כמה מידות כדי לשמש כסיכות ובדיקות (ראה טבלה 3). יש לשטוף את המנה הזו עם 70% אלכוהול isopropol, ולאחר מכן עם ASW + P / S, ולבסוף Fill עם ASW + P / S. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן microdissection של הגרעינים מעוכל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התמיסה המכילה אנזים צדר-הדוושה וbuccal הגרעינים מתעכלים לתוך הצלחת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ כנגד משטח שחור תחת אור מוחזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברקמת החיבור המצורפת, להצמיד כל צד הגבי hemiganglion צדר-דוושה למעלה. הרקמות תהיה רכות ולא סובלניים של מתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissect נוירונים PVC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 2 זוגות של מלקחיים עדינים נקיים, ומחזיק את סיכת נתיחת קנס בזוג אחד של מלקחיים כמו בדיקה, לבודד את תאי PVC מhemiganglion פלאורלי. אנזים עיכול יהיה הוסר או שבורה מנדן רקמת חיבור המכסה את אשכול PVC, אך התאים ידבק אחד לשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הבדיקה לנתק את התאים הללו מחיבור דוושת פלאורלי 18, אז תן אשכול סתיו התא לחלק התחתון של הנתיחהמנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הנוירונים לצלחת התרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אשכול התא לצלחת תרבות 35 מ&quot;מ שהוכנה על ידי בעדינות מתחנף האשכול לתוך קצה מעט אש מלוטשת חד פעמית זכוכית פיפטה פסטר, ולאחר מכן מחלק אותו לאט לתוך האי התקשורת בצלחת התרבות, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך פיפטה. חזור על בידוד של אשכול PVC של hemiganglion האחרים והמקום לתוך צלחת תרבות נפרדת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissect ולהעביר נוירונים BSC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את צד הגחון גנגליון buccal למעלה, בזהירות כדי לא לפגוע בתאים של עניין. חזור על שלב 1.12 עם 2 צבירי תאי BSC של גנגליון buccal 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של נוירונים PVC וBSC יהיה לייצר 4 מנות התרבות המכילות צבירי נוירונים המכילות: 2 מנות אשכולות BSC ו -2 מנות המכילים צבירי PVC. מחק את שאר הגרעינים ומניחים בצד הצלחת לנתיחה 100 מ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissociate את צבירי התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת תרבות המכילה תאים על הבמה של מיקרוסקופ כוח הנמוך ולהסיר את הכיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את אשכול PVC בעדינות על ידי מצליף את תחתית צלחת התרבות בסמוך לאשכול התא עם סיכת נתיחת קנס שנערכה במלקחיים. מצליף הוא לחפור את הקצה של הסיכה לתוך הפלסטיק של תחתית הצלחת כאילו מנסה לחפור את כתם מפלסטיק. כאשר חיכוך עם הפלסטיק משחרר את נקודת הסיכה, גל כלי הקשה מופק באמצעות המדיום שמפרק הגוש הסמוך של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנועות 05-10 מאי תהיה צורך כמעט לנתק את התאים לחלוטין, אבל עדיף להשאיר את האשכולות קטנים של תאים ולא לקפיציים יותר מדי פן ייהרסו את התאים על ידי צרופה מכאני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלפת מכסים ולחזור עם מנות התרבות אחרות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן תרביות תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מנות התרבות המכילות איי תקשורת במרכזים שלהם עם תאים ניתק לתוךמיכל גדול המאפשר זרימת אוויר, כגון צלחת 25 מ&quot;מ x 150 סיבוב פטרי פלסטיק, ומניח את המנה הזו בסט חממה עד 17 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקין בתא צלחת פתוחה של מים כמקור ללחות. לעזוב ללא הפרעה בין לילה. התאים ידבק בציפוי פולי-D-ליזין במרכז הצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות תרבות מבול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, בעדינות להציף את המנות עם 2.5 מ&quot;ל של ASW + P / S. לבחון וספירת התאים באמצעות מיקרוסקופ תרבית תאים הפוך. חנות ב17 ° C החממה. </li></ol></li></ol> 2. Electrophysiology השיטה היא תיקון סטנדרטי הידוק שתואר בטקסטים רבים (למשל סאקמן ונהר, 1995) 16. פרוטוקול זה יעבוד על תאי ≤ קיבול 100 PF, או תאים &lt;קוטר 60 מיקרומטר בימים 3 ו 4 לפרוטוקול. תאים ללא תהליכים הם אופטימליים להקלטה. Considerat המיוחד הבאיונים להחיל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לאכלס תאים גדולים יותר עם הגדרת התצורה במגבר 200B Axopatch מוגדר β = 0.1. הפעלה של זרמים גדולים מאוד עלולה לגרום לתאים כדי להימלט מהדק מתח. פתרונות ASW תחליף לתוכן מלח (לדוגמה: חלק של NaCl להחליף עם כלוריד N-methy-D-glucamine בלתי חדיר) עשויים לשמש כדי להפחית את כל משרעת נוכחית תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pipettes תיקון ורוסיליקט מלא סיבים משך על חולץ פיפטה וbackfilled אמצע הדרך עם פתרון תאי (ICS) בהיקף של 450 מ&quot;מ KCl ומלחים אחרים (ראה טבלת מס &#39;1) הם מתאים, וצריך להיות התנגדות של כ 0.5-1 MOhms. אם בידוד של זרמים יוניים ספציפיים הוא רצוי, למשל, Na + זרמים יכולים להיות מוחלפות בהיעדר זרמי K, K + בפתרון זה עם יונים אחרים כגון מדעי המחשב +. Cl - החלפה של מעגלים משולבים עם אניון impermeant גם אם מוצדק ICS טבעי יותר הוא רצוי9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הם חזקים עם&gt; 1 הקלטות ארוכות-HR אפשריים בטמפרטורת חדר. הקלטה היא אופטימלית בימים 3 ו -4 לפרוטוקול, המקביל ל 24-48 שעות בתרבות. לאחר 48 שעות יש קושי להרכיב חותמות gigaOhm, אולי בגלל הפירוט של glycocalyx על פני התא, ובעיות שנגרמו על ידי מהדק חלל תולדת תהליך. התאים שימושיים, עם זאת, ללימודים שאינם תיקון מהדק, כגון רעלים, שיכולים להתבצע ב&lt; 14 ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASW ופתרונות אחרים כדי להימכר מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, כמו גם פתרון תאי, צריכים להיות מסוננים באמצעות מזרק רכוב 0.2 מיקרומטר Acrodisk מסנן (לוח 3) לחסל את החלקיקים קטנים שמפריעים להיווצרות חותם gigaOhm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחתת רגישות מתרחשת בעת שימוש באגוניסטים כגון D-Aspartate (D-ASP), ולכן ~ 1-2 דקות בין יישומים של אגוניסטים מומלץ. לעומת זאת, potentiation הוא נצפה לעתים קרובות עם appli חזר מהירקטיון של אגוניסטים כגון L-גלוטמט (L-Glu). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגוניסט זרמים הופעלו כגון L-Glu ניתן ללמוד על ידי יישום אגוניסטים עם פיפטה Picospritzer. פיפטה זה משך את אותו הדבר כמו פיפטה את התיקון והוא מכיל אגוניסט בASW. כאשר קצה פיפטה זו ממוקם מתחת לצינור היציאה של מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, ובזווית של ° 45 מצינור יצוא (איור 2F), אגוניסט יהיה שטף במהירות מתא, והפחתת הרגישות תהיה ממוזער. פיפטה אגוניסט צריכה ליצור זווית של 90 מעלות או יותר יחסית לפיפטה את התיקון. </li></ol>

<ol>
	<li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl(-)+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP(B)+and+FMRFamide.">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li><li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li><li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica.">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li><li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica.">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li><li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Na++and+Ca2++currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica.">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li><li>Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging.">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li><li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+in+Aplysia:+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology.">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li><li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia:+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation.">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li><li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia.">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular basis of behavior. , (1976).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialog+between+nerves+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li><li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase.">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li><li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transcriptome+of+Aplysia:+neuronal+compartments+and+circuitry.">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li><li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons.">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-channel recording. , (1995).</li><li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+Ca2++current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons.">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li><li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture:+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment.">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li><li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections.">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li><li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+Ca(2+)-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons.">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li><li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia.">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li><li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities.">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

טכניקות דיסוציאציה מתוארות כאן יניבו תרבויות נוירון חושיות המכילות 50-100 נוירונים בודדים וביניהם מספר קטן של תאי גליה ובלתי מזוהים אחרים. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם זמן הגרעינים יישארו בפתרון אנזים, והמצליף, ניתוק מצבירי התאים מתעכלים להתפרק האשכול לתוך תאי?...

רכיכת opistobranch הימית, Aplysia, כבר מודל הנוירוביולוגי שימושי במשך עשורים רבים. הוא ידוע בעיקר כמודל של התרגלות והתניה קלסית 7, 8. מחקרים על למידה וזיכרון במודל זה זכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 2000 לאריק ר &#39;קנדל, בפרס הוא משותף עם Arvid Carlsson ופול גרינגרד 10. מחקרים שכלל הקלטות חשמל מהכנות מופחתות, שבו אלמנטים של מערכת העצבים של חסר חוליות זה הם גזורים מבעלי החיים עם עצבים ושרירים עזבו מצורף, סייעו להבהיר את התפקידים של נוירונים בודדים בAplysia. זיהוי של מנגנונים מולקולריים מדויקים המהווים למידה בAplysia עם זאת, לעתים קרובות מועסק טכניקה אחרת, לטווח ארוך שיתוף תרבויות של נוירון חושי וmotoneuron, השיגה אחד אחד מבעלי החיים תורמים בודדים ואפשרו ליצירת סינפסה בצלחת תרבות 21 . אנחנו ואחרים 1, 3, 6, 14, 15, 16, ניצלו את הקלות שבי זיהה יכולים להיות ממוקדים נוירונים במודל זה, כמו גם הסיבולת שלהם בניסויים לטווח ארוך כדי להפוך את תרבויות טווח קצרות ניתקות של צבירי נוירונים להלכה הומוגניות שבו אנחנו לומדים זרמים יוניים תחת מהדק מתח בתצורת תיקון המהדק. נוירונים רבים Aplysia לעמוד לסיבובים חוזרים ונשנים של תיקון הידוק כדי לאפשר זמן למניפולציות ניסיוני לטווח ארוך. הטכניקה שימושית לתאי עצב, כגון תאי neurosecretory השקית של גנגליון הבטן, ואת עצב סנסורי של גרעיני צדר וbuccal דיסוציאציה שאנו מתארים כאן, אבל לא לתאי עצב גדולים מאוד&gt; קוטר 60 מיקרומטר, כגון L7 או R2 של גנגליון הבטן. אנחנו לא מעסיקים Aplysia סרום בתרבויות שלנו, בניגוד לשיתוף התרבויות חושי motoneuron המתוארת במקום אחר. רוב הנוירונים שהושגו באמצעות הליך זה יהיו ללא תהליכים עבור tאז הוא ראשון 48 שעות בתרבות, בהנחיית שלמה הקלטת מתח תא, אלא יצמח ולפרט אקסונים ותהליכים אחרים למשך כ 14 ימים לפני שמת ממחסור בחומרים מזין ו / או גורמי גדילה. טכניקה זו מייצרת תרבויות העיקריות של 50-100 נוירונים לכל צלחת מאזורים שתועדו פיסיולוגיים של גרעיני buccal וצדר. פרוטוקול זה שימושי לחוקרים לומדים היבטים של פיזיולוגיה של תא בודד בניסויים הדורשים ניסיון רב משכפל לכל בעלי חיים. הוא מייצר זוג תואם של תרבויות בשל ההפרדה האנטומי של תאי המטרה לhemiganglia ימין ועל שמאל, ומאפשר שתועלת ממחקרי הטיפול מתאים ותרבויות בקרה. פרוטוקול מטרות מצרר buccal S (BSC) הנוירונים של גנגליון buccal ופלאורלי ventrocaudal (PVC) הנוירונים של גנגליון פלאורלי. תאים אלה הם גודל מתאים לכל הקלטות מתח תא וRobus התצוגהתגובות glutamatergic t. המתודולוגיה דנה מתאימה לרוב הגרעינים במערכת העצבים Aplysia.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Artificial seawater ASW</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100</td>
 <td>Lonzo Walkersville, Inc.</td>
 <td>17-603E</td>
 <td>5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral dispase II</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>10165859001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>hyaluronidase</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4272</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>collagenase type XI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C9407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamate (L-Glu)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49601-100G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Aspartate (D-Asp)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>11200-10G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
 <td>Biomol</td>
 <td>100002-268</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Asp</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6683-25G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6816-5MG</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glu R antagonists</td>
 <td>various</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>kynurenate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>61250</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>APV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-propanol</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>BDH1133</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloriding solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard silicone 2-part polymer</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>Provides pin-out surface for small dissection dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0-40x zoom magnification microscope for dissections</td>
 <td>Wild</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator</td>
 <td>Microoptics of Florida</td>
 <td>TQ FOI-150</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RotoMix 50800 orbital mixer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) &amp; 40x objectives</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>Eyelink II</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tektronix digital oscilloscope</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp 10 data acquisition and analysis software</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PC with Windows XP or higher operating system</td>
 <td>PC Solutions</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown P87 micropipette puller</td>
 <td>Sutter Instruments, Novato, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>CV203BU</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1200 A/D converter</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration</td>
 <td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TMC Micro-G Vibration isolation table</td>
 <td>Ametek</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators</td>
 <td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>presently PCS-5000; -6000 series + mounts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 inch length</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl half cell</td>
 <td>WPI</td>
 <td>EP4</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Angled Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15006-09</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumostar Fine forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-00</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm falcon tissue culture dishes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>25382-064</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>1013</td>
 <td>also can be made into small dissection dishes with sylgard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sylgard</td>
 <td>WPI</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>animal dissection tray</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>For 6-bore gravity-fed perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum clips with screw hole ends</td>
 <td>hardware store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 gauge needles (manually file off points)</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>one-way valves</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps 1 &mu;l</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 gauge needles for suction (filed off points)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing</td>
 <td>Cole Parmer</td>
 <td>4.27436E+11</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>fine dissection pins</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>26002-20</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>capillary tubes</td>
 <td>Kimble 71900-100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>modeling clay</td>
 <td>craft store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dish holder for microscope stage with isolated ground bath</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pasteur pipettes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>14672-412</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipette bulbs</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>53283-911</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>acrodisk syringe filters</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>28144-040</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150F-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

isolation of sensory neurons of aplysia californica for patch clamp recordings of glutamatergic currents

יש חלזון הרכיכה הימי Aplysia californica היסטוריה מכובדת כמודל של תפקוד מערכת עצבים, עם משמעות מיוחדת במחקרים של למידה וזיכרון. ההכנות האופייניות למחקרים מסוג זה הן אלה שבי חושיים ונותרו ללא פגע motoneurons בבעלי חיים גזורים מינימאלי, או תרבות משותפת עצבית טכני משוכללת של חושי וmotoneurons פרט. פחות נפוץ היא ההכנה העצבית המבודדת שבו אשכולות קטנים של תאי עצב להלכה הומוגניות הם ניתקו לתוך תאים בודדים בתרבות בטווח קצרה. תאים מבודדים כאלה שימושיים לאפיון biophysical של זרמי יונים באמצעות טכניקות מהדק תיקון, ואפנון ממוקד של conductances אלה. פרוטוקול להכנת תרבויות כאלה מתואר. הפרוטוקול מנצל את עצב סנסורי glutamatergic בקלות לזיהוי של גרעיני צדר וbuccal, ומתאר את הניתוק שלהם ותחזוקה המינימאליתתרבות n במשך כמה ימים ללא סרום.

את מיקומם של תאי העצב התחושתיים בתוך הגרעינים שממוקדים בפרוטוקול זה, הנוירונים BSC ו-PVC מוצגים באיור 1. הנוירונים BSC נמצאים ב2 אשכולות סגלגלים סימטריים בצד הגחוני של גנגליון buccal, את פני השטח שפונה מגוש buccal בגנגליון שלם (איור 1 א). הנוירונים PVC יצירת צבירי...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents at JoVE.com

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת הימית<em&gt; Aplysia</em&gt; אחרי הרדמה, הבידוד של תאי עצב לתרבות לטווח קצר, ברקמות ובהקלטות של זרמי יון תא בודדים באמצעות טכניקת מהדק התיקון.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

12.2K Views.  University of Miami. אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת הימית Aplysia אחרי הרדמה, הבידוד של תאי עצב לתרבות לטווח קצר, ברקמות ובהקלטות של זרמי יון תא בודדים באמצעות טכניקת מהדק התיקון.

Video: Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.