بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة P40 OD010952، ومؤسسة Korein، في جامعة ميامي زمالة إلى SLC وزمالة مايتاغ إلى ATK. المؤلفين الامتنان موظفي الموارد الوطنية للAplysia، وكذلك لورين Simonitis وهانا بيك، الذين قدموا الميكروسكوب لشخصية.

1. إعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 1، وتزن تخدير الحيوان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 30 جم، 1 كجم الحيوان. تخدير في حجم الحيوان 5-10 1:1 مياه البحر: MgCl متساوي التوتر. 6H 2 لمدة 1 ساعة مع تحريك مثل مضخة الهواء حوض السمك الكهربائية مع airstone المرفقة 0. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوازم تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع علبة تشريح نظيفة مع الفولاذ المقاوم للصدأ الدبابيس المستقيمة، مثل المسامير النسيج. تجميع عدة أطباق بتري تحتوي على مياه البحر الاصطناعي (ASW؛ انظر الجدولين 1 و 3) + البنسلين / الستربتوميسين (P / S). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هل لديك استعداد لمجهر ضوئي بقوة خفيفة. هل لديك أدوات تشريح نظيفة جاهزة، مثل الأنف مضلع وملقط جراحي غرامة، والغرامة ومقص جراحي كبير. رش الصكوك مع 70٪ isopropol الكحول قبل استخدام والسماح ليجف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حيوان موقف على علبة تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف الحيوان الجانب البطني أسفل في علبة تشريح. الحيوان دبوسمن خلال حواف جدار الجسم والحدود parapodial، ولكن تجنب الذيل والرأس، لفضح السطح الظهري والأخدود الأعضاء التناسلية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف السطح الظهري في بطء تشغيل ماء الصنبور البارد. تطبيق تيار ضوء من 70٪ isopropol الكحول من زجاجة ضغط على طول الأخدود الأعضاء التناسلية وعلى الجزء العلوي من الرأس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الأولي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر منخفضة الطاقة (انظر الجدول رقم 2) والضوء المنعكس لمراقبة نقطة حيث ينشأ أخدود الأعضاء التناسلية من الهامش قذيفة الأمامي، عقد بانشداد مع ملقط مضلع الأنف أضعاف من الأنسجة إلى اليسار من هذا الأصل، بينما القص ضحل حفرة على طول الطريق من خلال، مساحة الشقة السلس للجدار الجسم فقط إلى يمين الأخدود الأعضاء التناسلية مع مقص الزاوية غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي مراعاة الدملمف لتصب من الحفرة، تحمل أحيانا معها العقدة في البطن والمعدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيع شق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص كبير لتوسيع اله شق الأمامية إلى نقطة بين rhinophores، في حين سحب التصاعدي مع انخفاض شفرة لتجنب الخدش القناة الهضمية. وسيراعى في الأعضاء الداخلية لسفك للخروج من شق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العقد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الدرج وإعادة تركيز المجهر على منطقة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط نظيفة ومقص غرامة، وإزالة العقد رئيس بقطع عند نقطة واحدة في الأعصاب التي تشكل العقد رئيس في حلقة حول المريء لإزالة الجنبي-دواسة والدماغية العقد كمجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العقدة الشدق أن تلتزم الجانب البطني من المريء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العقدة في البطن عن طريق قطع 4 أدوات الوصل العصبية الكبيرة هذه المسألة من هذه العقدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل العقد من الفائدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم العقد الرأس بعيدا، وترك طول من حروف العطف تعلق على كل عقدة من الفائدة التي تساوي على الأقل القطر من العقدة، وهذا سوف تؤخر انزيم الإفراط في الهضممن الخلايا من الفائدة في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل العقدة الهدف من خلال 2 يشطف من ASW + P / S، والانتقال بين يشطف مع ملقط نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا استهداف الخلايا PVC، وترك hemiganglion الجنبي حق تعلق على حق hemiganglion دواسة، وترك بالمثل hemiganglion الجنبي اليسار تعلق على hemiganglion دواسة اليسار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل العقد غير المرغوب فيها وبقية الحيوانات وفقا للممارسة البحوث المقبولة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم إنزيمي في العقد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عقدة، وإعداد 1 مل من محلول أنزيم تتألف من 3.75 ملغ dispase، 1 ملغ هيالورونيداز و 0.3 غرام كولاجيناز نوع الحادي عشر لكل مل من ASW + P / S في 15 مل أنبوب البولي بروبلين المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تشطف العقد في حل الانزيم ونعلق الغطاء بإحكام. وضع أنبوب على جانبها على شاكر دوارة (انظر الجدول رقم 2) على سرعة بطيئة ل13-5 ساعة بين عشية وضحاها في حوالي 23 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعدادأطباق الثقافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تسليخ مجهري (يوم 2)، وإعداد بولي-D-يسين (PDL) المغلفة أطباق الثقافة في نسيج الثقافة هود. إضافة ~ 0.5 مل PDL (0.2 ملغ / مل من الماء المعقم) إلى وسط صحن 35 ملم ل~ 25 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف PDL 3x مع الماء المعقم. السماح ليجف. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم لوحات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 عزل الخلايا العصبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء وسط 35 ملم الأطباق التي كانت PDL المغلفة والأشعة فوق البنفسجية معقم مع ما يقرب من 0.5 مل من ASW + P / S لإنشاء جزيرة وسائل الإعلام داخل صحن جاف خلاف ذلك. ويمكن أن يتم هذا على مقاعد البدلاء، خارج نسيج الثقافة هود. وينبغي إعداد طبق واحد عن كل مجموعة الخلايا التي تنشأ من hemiganglion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هل لديك استعداد ل100 مم طبق تشريح أدلى به sylgard طلاء وعلاج لمدة 5 مم عميق سطح تشريح، تجهيزه مع دبابيس تشريح غرامة من عدة أحجام لأن تستخدم الدبابيس وتحقيقات (انظر الجدول 3). شطف هذا الطبق مع 70٪ isopropol الكحول، ثم مع ASW + P / S، وأخيرا فايليرة لبنانية مع ASW + P / S. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تسليخ مجهري من العقد هضمها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حل الانزيم الذي يحتوي على هضمها الجنبي-دواسة والشدق العقد في طبق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الطبق على مرحلة من مراحل المجهر ضد السطح الأسود تحت الضوء المنعكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام النسيج الضام المرفقة، أحدد كل الجنبي-دواسة hemiganglion الجانب الظهري تصل. فإن الأنسجة تكون لينة وغير متسامحة من التمدد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissect الخلايا العصبية PVC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 2 أزواج من ملقط غرامة نظيفة، وعقد دبوس تشريح غرامة في زوج واحد من ملقط باعتباره التحقيق، عزل الخلايا PVC من hemiganglion الجنبي. انزيم الهضم سيكون قد إزالة أو تمزق غلاف النسيج الضام الذي يغطي كتلة PVC، ومع ذلك فإن الخلايا سوف تلتزم واحد آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مسبار لفصل هذه الخلايا من الضام دواسة الجنبي 18، ثم السماح للسقوط كتلة الخلية إلى الجزء السفلي من تشريحطبق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا العصبية إلى صحن الثقافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الكتلة الخلية إلى المعدة 35 مم طبق الثقافة عن طريق مص بلطف صعودا الكتلة إلى غيض من النار قليلا مصقول ماصة باستير الزجاج القابل للتصرف، ثم الاستغناء ببطء في الجزيرة وسائل الاعلام في صحن الثقافة، والحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء في ماصة. تكرار العزلة من الكتلة PVC من hemiganglion وأماكن أخرى في طبق ثقافة منفصلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissect ونقل الخلايا العصبية BSC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعلقون بها على الشدق العقدة الجانب البطني أعلى، مع الحرص على تجنيب خلايا الفائدة. كرر الخطوة 1.12 مع 2 BSC مجموعات الخلايا من العقدة الشدق 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف عزل PVC وBSC الخلايا العصبية تنتج 4 أطباق الثقافة التي تحتوي على مجموعات الخلايا العصبية: 2 الأطباق التي تحتوي على مجموعات BSC و 2 الأطباق التي تحتوي على مجموعات PVC. تجاهل بقية العقد وتوضع جانبا على طبق 100 ملم تشريح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DissocIATE المجموعات الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق الثقافة التي تحتوي على خلايا في مرحلة مجهر ضوئي بقوة خفيفة وإزالة الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الكتلة PVC بواسطة عبها بلطف الجزء السفلي من صحن الثقافة المتاخمة للكتلة الخلية مع دبوس تشريح غرامة عقد في ملقط. عبها يتم حفر غيض من دبوس في البلاستيك من الجزء السفلي من طبق كما لو تحاول انتشال البقعة من البلاستيك. عندما الاحتكاك مع البلاستيك تطلق نقطة دبوس، وينتج موجة قرع من خلال وسيلة أن ينهار في أجمة القريبة من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون هناك حاجة إلى ما يقرب من 5-10 نقرات تنأى تماما الخلايا، ولكن من الأفضل أن تترك مجموعات صغيرة من الخلايا بدلا من نفض الغبار كثيرا لئلا يتم تدمير الخلايا عن طريق محض الميكانيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محل تغطية وكرر مع أطباق ثقافة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الثقافات الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الأطباق الثقافة التي تحتوي على الجزر وسائل الإعلام في مراكزهم مع فصل الخلايا فيوعاء كبير أن يسمح دوران الهواء، مثل × 25 ملم جولة البلاستيك طبق بتري 150، ووضع هذا الطبق في مجموعة حاضنة إلى 17 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت في غرفة مفتوحة طبق من الماء كمصدر للرطوبة. ترك بين عشية وضحاها دون عائق. الخلايا سوف تتمسك طلاء بولي-D-يسين في وسط الطبق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطباق ثقافة الفيضانات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3، والفيضانات بلطف الأطباق مع 2.5 مل من ASW + P / S. دراسة وعد الخلايا باستخدام المجهر مقلوب خلية ثقافة. متجر في 17 درجة مئوية الحاضنة. </li></ol></li></ol> 2. الكهربية الأسلوب هو معيار التصحيح لقط التي تم وصفها في النصوص العديدة (مثل Sakmann وNeher، 1995) 16. سوف يشكل هذا البروتوكول يعمل على خلايا ≤ 100 السعة PF، أو خلايا &lt;60 ميكرومتر في القطر خلال أيام 3 و 4 من البروتوكول. الخلايا دون العمليات هي الأمثل للتسجيل. وconsiderat الخاصة التاليةتطبيق أيونات: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن استيعاب الخلايا أكبر مع إعداد التكوين على مكبر للصوت 200B Axopatch لتعيين β = 0.1. تفعيل تيارات كبيرة جدا قد يسبب الخلايا للهروب المشبك الجهد. حلول ASW بديلا عن محتوى الملح (على سبيل المثال جزء من كلوريد الصوديوم كلوريد استبداله مع كتيمة N-methy-D-glucamine) يمكن استخدامها للحد من كامل السعة الحالية الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الألياف المليئة ماصات التصحيح البورسليكات سحبت على مجتذب ماصة وردم في منتصف الطريق مع الحل داخل الخلايا (ICS)، ويتألف من 450 ملي بوكل والأملاح الأخرى (انظر الجدول 1) هي مناسبة، وينبغي أن يكون مقاومة من حوالي 0.5-1 MOhms. إذا كان المطلوب عزل التيارات الأيونية محددة، على سبيل المثال، نا + يمكن استبدال التيارات في غياب التيارات K، K + في هذا الحل مع الأيونات الأخرى مثل جيم +. هناك ما يبرر استبدال ICS مع أنيون impermeant أيضا إذا هو المطلوب ICS أكثر طبيعية - CL9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كانت الخلايا قوية مع&gt; 1 تسجيلات لمدة ساعة ممكن في درجة حرارة الغرفة. تسجيل هو الأمثل في أيام 3 و 4 من البروتوكول، أي ما يعادل 24-48 ساعة في الثقافة. بعد 48 ساعة هناك صعوبة تشكيل الأختام gigaOhm، ربما بسبب وضع الكنان السكري على سطح الخلية، والمشاكل الناجمة عن المشبك الفضاء ثمرة عملية. الخلايا هي مفيدة، ولكن لدراسات المشبك غير التصحيح، مثل علم السموم، والتي يمكن الانتهاء منها في &lt;14 د. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASW وغيرها من الحلول إلى الاستغناء عن بالجاذبية جهاز حل، فضلا عن حل داخل الخلايا، يجب أن تتم تصفيته من خلال حقنة محمولة على 0.2 ميكرومتر Acrodisk مرشح (الجدول 3) للقضاء على الجسيمات الدقيقة التي تتداخل مع gigaOhm تشكيل الختم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحدث الحساسية عند استخدام منبهات مثل D-الأسبارتات (D-ASP)، ولذلك ~ 1-2 دقيقة بين التطبيقات من منبهات ويوصى. وعلى العكس، وغالبا ما لوحظ التقوية مع تطبيق صحيفة السريع المتكررةالموجبة للمنبهات مثل L-الغلوتامات (L-غلو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ناهض التيارات تفعيلها مثل L-غلو يمكن دراستها عن طريق تطبيق منبهات مع picospritzer ماصة. يتم سحب هذه ماصة نفس ماصة التصحيح ويحتوي ناهض في ASW. عندما يتم وضع هذا غيض من ماصة تحت أنبوب تدفق خطورة الاحتياطي الفيدرالي جهاز حل، وعلى زاوية 45 درجة من أنبوب تدفق (الشكل 2F)، وناهض غسلها بسرعة بعيدا عن الخلية، وسوف يكون الحد الأدنى الحساسية. يجب ماصة ناهض خلق بزاوية 90 درجة أو أكثر نسبة إلى ماصة التصحيح. </li></ol>

<ol>
	<li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl(-)+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP(B)+and+FMRFamide.">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li><li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li><li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica.">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li><li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica.">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li><li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Na++and+Ca2++currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica.">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li><li>Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging.">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li><li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+in+Aplysia:+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology.">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li><li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia:+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation.">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li><li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia.">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular basis of behavior. , (1976).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialog+between+nerves+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li><li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase.">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li><li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transcriptome+of+Aplysia:+neuronal+compartments+and+circuitry.">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li><li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons.">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-channel recording. , (1995).</li><li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+Ca2++current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons.">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li><li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture:+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment.">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li><li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections.">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li><li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+Ca(2+)-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons.">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li><li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia.">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li><li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities.">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

التقنيات تفارق الموصوفة هنا تسفر الثقافات الخلايا العصبية الحسية التي تحتوي على الخلايا العصبية معزولة 50-100 تتخللها أعداد صغيرة من الخلايا الدبقية والخلايا الأخرى مجهولة الهوية. الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي المرة تبقى العقد في حل الانزيم، والتحريك، وتفار?...

كان الرخوي opistobranch البحرية، Aplysia، وهذا نموذج العصبية الحيوية مفيدة لعدة عقود. ومن المعروف أنها نموذج من التعود وتكييف الكلاسيكية 7، 8. فاز دراسات عن التعلم والذاكرة في هذا النموذج على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 2000 لاريك كاندل R.، في الجائزة التي تقاسمها مع أرفيد كارلسون وبول غرينغارد 10. دراسات شملت التسجيلات الكهربائية من انخفاض الاستعدادات، التي يتم تشريح عناصر الجهاز العصبي من هذه اللافقاريات من الحيوان مع الأعصاب والعضلات غادر المرفقة، وقد ساعدت توضيح أدوار الخلايا العصبية الفردية في Aplysia. تحديد الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشكل التعلم في Aplysia ومع ذلك، غالبا ما تستخدم أسلوب آخر، على المدى الطويل المشترك الثقافات من الخلايا العصبية الحسية والعصبون الحركي، التي تم الحصول عليها واحدا تلو الآخر من الحيوانات المانحة الفردية وسمح لتشكيل المشبك في صحن الثقافة 21 . نحن وغيرنا 1، 3، 6، 14، 15، 16 لقد استغل السهولة التي تم تحديدها يمكن استهداف الخلايا العصبية في هذا النموذج، وكذلك قدرتهم على التحمل في تجارب طويلة الأمد لجعل الثقافات المدى القصير فصلها من مجموعات من الخلايا العصبية المتجانسة أبعاده التي ندرس التيارات الأيونية تحت المشبك الجهد في تكوين المشبك التصحيح. العديد من الخلايا العصبية Aplysia الوقوف في جولات متكررة من التصحيح لقط لإتاحة الوقت للالتلاعب التجريبية طويلة الأمد. هذه التقنية مفيدة للخلايا العصبية مثل الخلايا الإفرازية العصبية كيس من العقدة في البطن، والخلايا العصبية الحسية في العقد الجنبي والشدق التي تفارق وصفنا هنا، ولكن ليس لالخلايا العصبية كبيرة جدا&gt; 60 ميكرومتر في القطر، مثل L7 أو R2 من العقدة في البطن. نحن لا توظف Aplysia المصل في ثقافاتنا، على عكس الحسية العصبون الحركي المشترك الثقافات صفه في مكان آخر. ومعظم الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء أن يكون من دون عمليات لركان أول الموارد البشرية 48 في الثقافة، وتسهيل كامل الخلية تسجيل الجهد، ولكن بعد ذلك سوف تنبت وبلورة المحاور وغيرها من العمليات لحوالي 14 يوما قبل أن يموت من نقص المواد الغذائية و / أو عوامل النمو. هذه التقنية تنتج الثقافات الأولية من 50-100 الخلايا العصبية في طبق من مناطق موثقة من الناحية الفسيولوجية من العقد الشدق والجنبي. هذا البروتوكول هو مفيد للباحثين دراسة جوانب من علم وظائف الأعضاء خلية واحدة في التجارب التي تتطلب العديد من التجارب مكررات لكل حيوان. وتنتج زوج متطابق من الثقافات بسبب الفصل التشريحي للخلايا المستهدفة في hemiganglia اليسار واليمين، والسماح الدراسات التي تستفيد من العلاج الملائمة والثقافات السيطرة. بروتوكول يستهدف الشدق S الكتلة (BSC) الخلايا العصبية من العقدة الشدق، والجنبي ventrocaudal (PVC) الخلايا العصبية من العقدة الجنبي. هذه الخلايا هي الحجم المناسب للتسجيلات كله جهد الخلية وrobus العرضر استجابات الجلوتاميرجي. المنهجية التي نوقشت هي مناسبة لمعظم العقد في الجهاز العصبي Aplysia.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Artificial seawater ASW</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100</td>
 <td>Lonzo Walkersville, Inc.</td>
 <td>17-603E</td>
 <td>5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral dispase II</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>10165859001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>hyaluronidase</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4272</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>collagenase type XI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C9407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamate (L-Glu)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49601-100G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Aspartate (D-Asp)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>11200-10G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
 <td>Biomol</td>
 <td>100002-268</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Asp</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6683-25G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6816-5MG</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glu R antagonists</td>
 <td>various</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>kynurenate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>61250</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>APV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-propanol</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>BDH1133</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloriding solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard silicone 2-part polymer</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>Provides pin-out surface for small dissection dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0-40x zoom magnification microscope for dissections</td>
 <td>Wild</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator</td>
 <td>Microoptics of Florida</td>
 <td>TQ FOI-150</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RotoMix 50800 orbital mixer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) &amp; 40x objectives</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>Eyelink II</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tektronix digital oscilloscope</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp 10 data acquisition and analysis software</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PC with Windows XP or higher operating system</td>
 <td>PC Solutions</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown P87 micropipette puller</td>
 <td>Sutter Instruments, Novato, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>CV203BU</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1200 A/D converter</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration</td>
 <td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TMC Micro-G Vibration isolation table</td>
 <td>Ametek</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators</td>
 <td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>presently PCS-5000; -6000 series + mounts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 inch length</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl half cell</td>
 <td>WPI</td>
 <td>EP4</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Angled Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15006-09</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumostar Fine forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-00</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm falcon tissue culture dishes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>25382-064</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>1013</td>
 <td>also can be made into small dissection dishes with sylgard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sylgard</td>
 <td>WPI</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>animal dissection tray</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>For 6-bore gravity-fed perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum clips with screw hole ends</td>
 <td>hardware store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 gauge needles (manually file off points)</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>one-way valves</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps 1 &mu;l</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 gauge needles for suction (filed off points)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing</td>
 <td>Cole Parmer</td>
 <td>4.27436E+11</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>fine dissection pins</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>26002-20</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>capillary tubes</td>
 <td>Kimble 71900-100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>modeling clay</td>
 <td>craft store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dish holder for microscope stage with isolated ground bath</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pasteur pipettes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>14672-412</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipette bulbs</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>53283-911</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>acrodisk syringe filters</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>28144-040</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150F-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

isolation of sensory neurons of aplysia californica for patch clamp recordings of glutamatergic currents

البحرية بطني الأرجل الرخويات Aplysia californica لديها تاريخ الجليلة كنموذج من وظيفة الجهاز العصبي، مع أهمية خاصة في دراسات التعلم والذاكرة. التحضيرات نموذجية لمثل هذه الدراسات هي تلك التي يتم ترك الحسية والعصبونات الحركية سليمة في تشريح الحيوان الحد الأدنى، أو تفصيلا تقنيا العصبية الثقافة المشتركة الحسي للفرد والعصبونات الحركية. أقل شيوعا هو إعداد الخلايا العصبية معزولة في الذي مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية المتجانسة أبعاده هي نأت إلى خلايا مفردة في الثقافة على المدى القصير. مثل هذه الخلايا المعزولة هي مفيدة لتوصيف البيوفيزيائية من التيارات أيون باستخدام تقنيات المشبك التصحيح، وتعديل المستهدفة من هذه المواصلة. يوصف بروتوكول لإعداد مثل هذه الثقافات. بروتوكول يستفيد من التعرف عليها بسهولة الخلايا العصبية الحسية الجلوتاميرجي من العقد الجنبي والشدق، ويصف التفكك والحد الأدنى من الصيانة طثقافة ن لعدة أيام دون المصل.

مواقع الخلايا العصبية الحسية في العقد التي تستهدف في هذا البروتوكول، وتظهر الخلايا العصبية BSC وPVC في الشكل 1. توجد الخلايا العصبية BSC في 2 مجموعات متناظرة البيضاوي على الجانب البطني من العقدة الشدق، والسطح الذي يواجه بعيدا عن الكتلة الشدق في العقدة سليمة ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents at JoVE.com

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

نحن تصف تشريح الجهاز العصبي من الأرنب البحر البحرية<em&gt; Aplysia</em&gt; بعد التخدير، وعزل الخلايا العصبية للثقافة الأجل القصير الأنسجة، وتسجيلات لاحد التيارات ايون خلية عبر تقنية المشبك التصحيح.

عزل الخلايا العصبية الحسية من<em&gt; Aplysia californica</em&gt; للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

12.2K Views.  University of Miami. نحن تصف تشريح الجهاز العصبي من الأرنب البحر البحرية Aplysia بعد التخدير، وعزل الخلايا العصبية للثقافة الأجل القصير الأنسجة، وتسجيلات لاحد التيارات ايون خلية عبر تقنية المشبك التصحيح.

Video: Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

تصنيع وزرع قطب كهربائي في Aplysia californica لتسجيلات متعدد القنوات العصبية والعضلات في الحيوانات ، ويتصرف بحرية سليمة

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

تسجيلات المشبك التصحيح في الأذن الداخلية خلايا الشعر المعزولة من اسماك الزرد

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

تحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية لعضلة حمام سباحة للسيارات في<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

التحت خلوية تسجيلات التصحيح، المشبك من المجال Somatodendritic من سودائي الدوبامين العصبية

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.