NIH P40 OD010952, Korein Vakfı, SLC Miami Arkadaş Grubu bir üniversite ve ATK bir Maytag burs tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar minnetle Aplysia yanı sıra Lauren Simonitis ve bir rakam için mikroskop sağlanan Hannah Peck, için Ulusal Kaynak personeli kabul.

1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Gün 1, tartmak ve hayvan uyutmak. <ol><li> Bir 30 g kg-1 hayvan tartılır. Izotonik MgCl: 1:1 Uygulama deniz suyu 5-10 hayvan hacimlerde anestezisi. Bu ekli airstone ile elektrikli akvaryum hava pompası gibi havalandırma ile 1 saat 6H 2 0. </li></ol></li><li> Diseksiyon malzemeleri hazırlayın. <ol><li> Bu kumaş işaretçilerine olarak paslanmaz çelik düz iğne, temiz diseksiyon tepsi birleştirin. + Penisilin / streptomisin (P / S).; Birkaç Petri yapay deniz suyu içeren yemekler (Tablo 1 ve 3&#39;e bakınız ASW) monte </li><li> Hazır bir düşük güç mikroskop var. Temiz diseksiyon aletleri gibi nervürlü burun ve ince cerrahi forseps gibi, hazır, ve ince ve büyük cerrahi makas var. Kullanmadan önce% 70 isopropol alkol ile araçlar Sprey ve kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Diseksiyon tepsi konumu hayvan. <ol><li> Diseksiyon tepsiye pozisyonu hayvan ventral tarafı. Pin hayvangövde duvarı ve parapodial sınırları, ancak dorsal yüzeyini ortaya çıkaracak şekilde, yükleme ve baş önlemek ve genital oluğun kenarları boyunca </li><li> Yavaş dönen soğuk musluk suyunda dorsal yüzeyi durulayın. Genital kanal boyunca bir sıkmak şişe ve başın üstünden 70% isopropol alkol hafif akışı uygulayın. </li></ol></li><li> Ilk kesi yapmak. <ol><li> Sığ bir kırpma sırasında düşük güç mikroskop kullanarak (bkz. Tablo 2) ve genital oluk ön kabuk marjı kaynaklanan noktaya gözlemlemek için yansıyan ışık, gerili, yivli-burun forseps Bu kökenli solunda doku kat ile tutun sadece iyi açılı makas ile genital oluk sağındaki vücut duvarının düzgün, düzlük tüm yol boyunca delik. </li><li> Hemolimf bazen ile karın ganglion ve mide taşıyan, delikten dökmek için dikkat edilmelidir. </li></ol></li><li> Kesi genişletin. <ol><li> Inci genişletmek için büyük makas kullanınöne rhinophores arasında bir noktaya e kesi, alt bıçak ile yukarı çekerken bağırsak nicklemek önlemek için. Iç organların kesi dışarı dökmek için gözlenecektir. </li></ol></li><li> Ganglionlar çıkarın. <ol><li> Tepsiyi yeniden konumlandırmak ve baş bölgeye mikroskop yönlendirmesi. </li><li> Temiz forseps ve ince makas kullanarak, bir noktada bir grup olarak plevra-pedalı ve serebral ganglionlar kaldırmak için yemek borusu etrafında bir halka içine baş ganglionlar oluşturan sinirler kesilmesinin tarafından baş ganglionlar çıkarın. </li><li> Yemek borusu ventral tarafına yapışır yanak ganglion çıkarın. </li><li> Bu ganglion gelen 4 büyük sinir bağlaçlar bu konuda keserek karın ganglion çıkarın. </li></ol></li><li> Ilgi ganglion izole edin. <ol><li> Ganglion en az çapına eşit olan her bir ilgi gangliyon bağlanmış bağlayıcılar arasında bir uzunluğa bırakarak, ayrı baş ganglion Trim; bu enzim geciktirir aşırı sindirimBir sonraki adım, ilgi hücre. </li><li> ASW 2 durulama + temiz forseps ile durulama arasında hareket P / S, ile her hedef ganglion koyun. </li><li> PVC hücreleri hedef, doğru pedal hemiganglion bağlı sağ plevral hemiganglion bırakın ve benzer şekilde sol pedal hemiganglion bağlı sol plevral hemiganglion bırakın. </li><li> Istenmeyen ganglionlar ve kabul edilen araştırma uygulama göre hayvanın geri kalanını atın. </li></ol></li><li> Enzimatik ganglionlar sindirmek. <ol><li> Her gangliyon için, 3.75 mg dispaz, 1 mg hiyaluronidaz ve DSH ml&#39;si başına 0.3 gr kollajenaz tip XI oluşan enzim çözeltisi, 1 ml hazırlanması 15 ml polipropilen konik tüpe +, P / S. </li><li> Yeri enzim çözüm ganglionlar durulanır ve kapağını sıkıca takın. Yaklaşık 23 saat boyunca 13-5 gece boyunca yavaş bir hızda döner çalkalayıcı üzerinde (bakınız Tablo 2) üzerinde yan tüp yerleştirin ° C (oda sıcaklığı). </li></ol></li><li> Hazırlayınkültür kaplarına. <ol><li> Mikrodiseksiyon önce (Gün 2), poli-D-lisin (PDL) kaplı bir doku kültürü kaputu kültür yemekleri hazırlamak. ~ 25 dakika süre ile, 35 mm tabağın merkezine ~ 0.5 ml PDL (0.2 mg / ml &#39;lik steril su) ilave edilir. </li><li> Steril su ile 3x PDL durulayın. Kurumasını bekleyin. Kalıpları UV-sterilize. </li></ol></li><li> 2. Gün nöronlar izole edin. <ol><li> PDL kaplı ve başka kuru bir tabak içinde medya bir ada oluşturmak için ASW + P / S yaklaşık 0.5 ml steril UV vardı 35 mm yemekleri ortasına doldurun. Bu doku kültürü kaputu dışında, bankta yapılabilir. Bir çanak hemiganglion kaynaklanan her hücre küme için hazırlanmalıdır. </li><li> Sylgard kaplama tarafından yapılan ve (bkz. Tablo 3) işaretçilerine ve sondalar olarak kullanılmak üzere çeşitli boyutlarda ince diseksiyon işaretçilerine ile donatılmış bir 5 mm derin diseksiyon yüzey, kür hazır bir 100 mm çapında diseksiyon çanak var. ASW ile + P / S, ve son olarak fi sonra,% 70 isopropol alkol ile bu çanak durulayınbu ASW + P / S ile ll </li></ol></li><li> Sindirilmiş gangliyon mikrodiseksiyon hazırlayın. <ol><li> Diseksiyon çanak içine sindirmek plevra-pedalı ve yanak ganglion içeren enzim çözeltisi dökün. </li><li> Yansıyan ışık altında siyah bir yüzeye karşı mikroskop sahnede çanak yerleştirin. </li><li> Ekli bağ dokusu kullanarak, her plevra-pedal hemiganglion sırt tarafında yukarı aşağı pin. Yumuşak doku ve germe hoşgörüsüz olacaktır. </li></ol></li><li> PVC nöronlar Microdissect. <ol><li> Temiz ince forseps 2 çift kullanarak ve bir prob olarak forseps bir çift bir ince diseksiyon iğne tutan, bir plevral hemiganglion gelen PVC hücreleri izole. Enzim sindirim kaldırıldı veya PVC küme kapsayan bağ dokusu kılıf dağıldığına, henüz hücreleri birbirine yapışır olacak. </li><li> Pedal-plevral bağ 18 bu hücreleri ayırmak için prob kullanın, sonra diseksiyon altına hücre küme düşmesine izinçanak. </li></ol></li><li> Kültür çanak nöronlar aktarın. <ol><li> Yavaşça hava kabarcıkları tanıtan önlemek için dikkatli olmak, sonra bir kültür çanak medya ada haline yavaş yavaş dağıtım, biraz yangın cilalı tek cam Pasteur pipet ucu içine küme emerek hazırlanmış bir 35 mm kültür çanak hücre küme aktarın pipet içine. Ayrı bir kültür çanak içine diğer hemiganglion ve yerin PVC küme izolasyonu tekrarlayın. </li></ol></li><li> BSC nöronlar Microdissect ve transfer. <ol><li> Ilgi hücreleri yedek dikkatle, kadar yanak ganglion ventral yan Pin. Yanak ganglion 10 2 BSC hücre kümeleri ile adım 1.12 tekrarlayın. </li><li> PVC kümeleri içeren BSC kümeleri ve 2 yemekleri içeren 2 yemekler: PVC ve BSC nöronların izolasyonu nöron kümeleri içeren 4 kültür kaplarına üretecek. Ganglion geri kalanı atın ve 100 mm diseksiyon çanak kenara koyun. </li></ol></li><li> Dissochücre kümeleri iate. <ol><li> Düşük güç mikroskop sahnede hücreleri içeren bir kültür çanak yerleştirin ve kapağı çıkarın. </li><li> Hafifçe forseps düzenlenen bir ince diseksiyon iğne ile hücre küme bitişik kültür çanak alt getirerek PVC küme ayırmak. Flicking rağmen plastik bir nokta kazmak için çalışıyor gibi çanak alt plastik içine iğne ucu kazma olduğunu. Plastik sürtünme pin nokta serbest bıraktığında, bir perküsyon dalga ayrı hücrelerin yakındaki yığın tatili vasıtasıyla üretilmektedir. </li><li> 5-10 sinema neredeyse tamamen hücreleri ayırmak için gerekli, ancak hücreleri mekanik sırf tarafından yok edilmesi diye çok fazla fiske yerine hücre küçük kümeler bırakmak daha iyidir olabilir. </li><li> Kapak ve diğer kültür yemekleri ile tekrar değiştirin. </li></ol></li><li> Hücre kültürleri saklayın. <ol><li> Ayrışmış hücreleri ile merkezlerinde medya adaları içeren kültür kaplarına yerleştirinBöyle bir 150 x 25 mm yuvarlak plastik Petri kabı gibi hava sirkülasyonu, izin verir, ve 17 ° C bir kuluçka set Bu yemeğin yer geniş bir kap </li><li> Odasında nem kaynağı olarak su açık bir tabak yükleyin. Gece rahatsız bırakın. Hücreler çanak merkezinde poli-D-lizin kaplama uyacaktır. </li></ol></li><li> Sel kültür kaplarına. <ol><li> Gün 3, yavaşça ASW 2.5 ml yemekleri sel + P / S Incelemek ve ters bir hücre kültürü mikroskop kullanarak hücreleri saymak. 17 ° C inkübatör saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Elektrofizyoloji Yöntemi (örnein, Sakmann ve Neher, 1995), pek çok metinde 16 tarif edilmiştir sıkıştırma standardı yamadır. Bu protokol hücreleri üzerinde ≤ 100 pF kapasitans, ya da hücreler &lt;Protokolün gün 3 ve 4 sırasında 60 mikron çapında çalışacaktır. Süreçleri olmadan Hücreler kayıt için uygun olan. Aşağıdaki özel de İngiltere&#39;deiyonları geçerlidir: <ol><li> Büyük hücreleri β = 0.1 olarak ayarlanmış Axopatch 200B amplifikatör yapılandırma ayarı ile yerleştirilebilir. Çok büyük akımlar aktivasyonu hücre gerilim kelepçe kaçmaya neden olabilir. ASW çözümleri (geçirimsiz bir N-metil-D-glukamin klorid ile ikame edilmiş NaCl örneğin bir kısmı) tuz içeriğinden ikame edilen bütün bir hücre akım genliği azaltmak için kullanılabilir. </li><li> Bir pipet çekici üzerine çekilir ve KCl ve diğer tuzlar 450 mm (bkz. Tablo 1) oluşan hücre içi çözelti (ICS) ile yarım toprakla fiber dolgulu borosilikat yama pipetler uygundur ve yaklaşık 0.5-1 Mohms bir dirence sahip olmalıdır. Belirli iyonik akımların izolasyonu isteniyorsa, örneğin, Na + K akımları, K +, bu çözüm yokluğunda akımları gibi Cs + gibi diğer iyonlar ile değiştirilebilir. Cl - daha doğal bir ICS isteniyorsa geçirgen olmayan anyon ile ICS değiştirilmesi de garanti edilir9. </li><li> Hücreler oda sıcaklığında mümkün&gt; 1 saat süren kayıtları ile sağlamdır. Kayıt kültüründe 24-48 saat için gelen, gün 3 ve protokolün 4 en uygunudur. 48 saat sonra, güçlük, hücre yüzeyi üzerinde bir glikokaliksin hazırlanması belki de, gigaohm conta oluşturan, ve proses sonucudur neden olduğu alan kıskaç sorunlar vardır. Hücreler &lt;14 d içinde tamamlanabilir gibi toksikoloji olmayan yama kelepçe çalışmalar, için, yararlı, ancak vardır. </li><li> ASW ve diğer çözümler ağırlık beslenen çözüm cihaz vasıtasıyla dağıtılabilmesidir için, hem de hücre içi çözelti süzülür gereken bir gigaohm conta oluşumuna müdahale ince parçacıkların ortadan kaldırmak için 0.2 mikron Acrodisk filtre (Tablo 3), bir şırınga monte edilebilir. </li><li> Örneğin, D-aspartat (D-Asp) agonist kullanıldığında Duyarsızlaştırma oluşur, bu nedenle agonist, uygulamalar arasında, 1-2 dakika ~ tavsiye edilir. Tersine, Potentiation genellikle hızlı tekrar başvurunun ile görülmektedirL-glutamat (L-Glu), agonist katyon. </li><li> L-Glu gibi agonist aktif akımları Picospritzer pipet ile agonistleri uygulayarak incelenebilir. Bu pipet yama pipet ile aynı çekilir ve ASW agonisti içerir. Bu pipet ucu yerçekimi beslenen çözüm cihaz çıkışı boru altında konumlandırılmış ve çıkış boru (Şekil 2F) bir 45 ° açıyla, agonist hızla hücreden kalmamis olur ve duyarsızlaştırma en aza inecektir zaman. Agonist pipet 90 ° &#39;lik ya da daha fazla yama pipet&#39; lik bir açı oluşturması gerekir. </li></ol>

<ol>
	<li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl(-)+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP(B)+and+FMRFamide.">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li><li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li><li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica.">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li><li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica.">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li><li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Na++and+Ca2++currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica.">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li><li>Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging.">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li><li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+in+Aplysia:+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology.">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li><li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia:+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation.">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li><li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia.">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular basis of behavior. , (1976).</li><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialog+between+nerves+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li><li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase.">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li><li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transcriptome+of+Aplysia:+neuronal+compartments+and+circuitry.">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li><li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons.">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-channel recording. , (1995).</li><li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+Ca2++current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons.">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li><li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture:+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment.">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li><li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections.">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li><li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+Ca(2+)-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons.">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li><li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia.">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li><li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities.">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Ayrışma teknikleri glia ve diğer tanımlanamayan hücrelerin az sayıda serpiştirilmiş 50-100 izole nöron içeren duyusal nöron kültürleri verim burada açıklanan. Protokolde en kritik adımlar ganglionlar enzim çözeltisi kalır zaman vardır, ve, tek tek hücrelere küme bozmaya sindirilmiş hücre kümeleri ayrışma Flicking. Enzim sindirimi (adım 1.8) mevcut sıcaklığında optimize edilmesi gerekmektedir. 23 yavaş sallayarak ° C, 13 saat BSC kümeleri while15 saat PVC kümeleri için optimum sonucu ...

Deniz opistobranch yumuşakça, Aplysia, onlarca yıl için yararlı bir nörobiyolojik model olmuştur. Bu iyi alışkanlık ve klasik koşullanma 7, 8 modeli olarak bilinir. Bu modelde öğrenme ve hafıza ile ilgili çalışmalar o Arvid Carlsson ve Paul Greengard 10 ile paylaşılan bir ödül, Eric R. Kandel için 2000 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandı. Düşük hazırlıkları elektrik kayıtları içeren çalışmalar, hangi bu omurgasız ve sinir sisteminin unsurları sinirleri ile hayvan disseke ve kasların tutunduğu, Aplysia bireysel nöronların rollerini aydınlatmak yardımcı olmuştur bıraktı. Aplysia öğrenme teşkil hassas moleküler mekanizmaların belirlenmesi Ancak, çoğu zaman bireysel donör hayvanlardan tek tek elde edilen başka bir teknik, uzun vadeli bir duyusal nöron eş-kültür ve bir motonöron, istihdam ve kültür çanak 21 bir sinaps oluşturmak için izin . Biz ve diğerleri 1, 3, 6, 14, 15, 16 nöronlar sözde homojen nöron kümeleri ayrışmış kısa vadeli kültürleri yapmak için uzun vadeli deneylerde de kendi dayanıklılık gibi bu modelde hedeflenebilir tespit hangi ile kolaylığı istismar var hangi biz yama kelepçe yapılandırmasında gerilim kelepçe altında iyonik akımların çalışma. Birçok Aplysia nöronlar uzun süreli deneysel manipülasyonlar için zaman tanımak için sıkma yama tekrar mermi stand up. Bu teknik, örneğin, karın ganglion Nörosekretor torba hücreleri ve ayrışma burada açıklandığı plevral ve yanak ganglion sensor nöronları olarak nöronlar için yararlıdır, fakat çok büyük nöronlar&gt; 60 mikron gibi L7 gibi çapı ya da R2 karın ganglion. Biz başka bir yerde tanımlanan duyusal-motor nöron ko-kültür aksine, bizim kültürlerde Aplysia serum istihdam yok. Bu işlem kullanılarak elde edilen en nöronlar t işlemleri olmadan olacako tüm hücre voltajı kayıt kolaylaştırmak kültüründe ilk 48 saat,, ama sonra filiz ve besin ve / veya büyüme faktörlerinin eksikliği nedeniyle ölme önce yaklaşık 14 gün boyunca akson ve diğer işlemler ayrıntılı olacaktır. Bu teknik, bukkal ve plevral gangliyon fizyolojik olarak belgelenmiş bölgelerinden tabak başına 50-100 nöronlarının birincil kültürleri üretir. Bu protokol, araştırmacılar, çeşitli deneysel hayvan başına çoğaltır gerektiren deneylerde tek hücre fizyolojisinin açıdan araştırılması için de faydalıdıdr. Bu eşleştirilmiş tedavi ve kontrol kültürlerinden çalışmalar yarar izin, sol ve sağ hemiganglia içine hedef hücrelerin anatomik ayrılması nedeniyle kültürlerin bir eş üretir. Protokol yanak ganglion yanak S kümesi (BSC) nöronlar ve plevral ganglion plevral ventrocaudal (PVC) nöronlar hedefliyor. Bu hücreler, tüm hücre voltaj kayıtları ve görüntüleme Robus için uygun bir boyuttadırt glutamaterjik yanıtları. Açıklanan metodoloji Aplysia&#39;nın sinir sisteminde en gangliyonların birleşmeleri için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Artificial seawater ASW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>assorted</td><td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O), 5MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td></tr><tr><td>Intracellular solution</td><td>Sigma</td><td>assorted</td><td>(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O), 2.5 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O), 5 Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100</td><td>Lonzo Walkersville, Inc.</td><td>17-603E</td><td>5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin</td></tr><tr><td>Neutral dispase II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10165859001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>collagenase type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamate (L-Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>D-Aspartate (D-Asp)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11200-10G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td><td>Biomol</td><td>100002-268</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asp</td><td>Sigma</td><td>A6683-25G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)</td><td>Sigma</td><td>A6816-5MG</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glu R antagonists</td><td>various</td><td>various</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>kynurenate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61250</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWRSP</td><td>BDH1133</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloriding solution</td><td>Sigma</td><td>assorted</td><td>25 g FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Sylgard silicone 2-part polymer</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYL184</td><td>Provides pin-out surface for small dissection dishes</td></tr><tr><td>0-40x zoom magnification microscope for dissections</td><td>Wild</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator</td><td>Microoptics of Florida</td><td>TQ FOI-150</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RotoMix 50800 orbital mixer</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) &amp;amp; 40x objectives</td><td>SR Research Ltd.</td><td>Eyelink II</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tektronix digital oscilloscope</td><td>SR Research Ltd.</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pClamp 10 data acquisition and analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PC with Windows XP or higher operating system</td><td>PC Solutions</td><td></td><td>Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors</td></tr><tr><td>Flaming/Brown P87 micropipette puller</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV203BU</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1200 A/D converter</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration</td><td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TMC Micro-G Vibration isolation table</td><td>Ametek</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td></td><td></td><td>custom manufacture</td></tr><tr><td>Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators</td><td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td><td></td><td>presently PCS-5000; -6000 series + mounts</td></tr><tr><td>Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -</td><td>WPI</td><td>1B150-3</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3 inch length</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ag/AgCl half cell</td><td>WPI</td><td>EP4</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Angled Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dumostar Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm falcon tissue culture dishes</td><td>VWRSP</td><td>25382-064</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013</td><td>VWRSP</td><td>1013</td><td>also can be made into small dissection dishes with sylgard</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>WPI</td><td>SYL184</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>animal dissection tray</td><td>various</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>For 6-bore gravity-fed perfusion system</td></tr><tr><td>Aluminum clips with screw hole ends</td><td>hardware store</td><td></td><td>For perfusion system</td></tr><tr><td>23 gauge needles (manually file off points)</td><td>VWRSP</td><td></td><td>For perfusion system</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing 0.022&quot;ID x 0.042&quot;OD; 427411</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>For perfusion system</td></tr><tr><td>H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>For perfusion system</td></tr><tr><td>one-way valves</td><td></td><td></td><td>For perfusion system</td></tr><tr><td>Drummond Microcaps 1 &amp;mu;l</td><td>VWRSP</td><td></td><td>For perfusion system</td></tr><tr><td>18 gauge needles for suction (filed off points)</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>4.27436E+11</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>fine dissection pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>capillary tubes</td><td>Kimble 71900-100</td><td></td><td>fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS</td></tr><tr><td>modeling clay</td><td>craft store</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dish holder for microscope stage with isolated ground bath</td><td></td><td></td><td>Custom manufacture</td></tr><tr><td>pasteur pipettes</td><td>VWRSP</td><td>14672-412</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pipette bulbs</td><td>VWRSP</td><td>53283-911</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>acrodisk syringe filters</td><td>VWRSP</td><td>28144-040</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass</td><td>WPI</td><td>1B150F-3</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

isolation of sensory neurons of aplysia californica for patch clamp recordings of glutamatergic currents

Deniz gastropod yumuşakça Aplysia californica öğrenme ve hafıza çalışmaları özellikle öneme sahip, sinir sistemi fonksiyonu bir model olarak bir saygıdeğer bir geçmişi vardır. Bu tür çalışmalar için tipik hazırlıkları duyusal ve motor nöronlar minimal disseke hayvan değişmeden kalır, ya da bireysel duyusal ve motor nöronlar bir teknik olarak nöronal ko-kültür edildiği olanlardır. Daha az görülen sözde homojen nöronların küçük kümeler kısa vadeli kültüründe tek hücrelere ayrışmış olduğu izole nöronal hazırlıktır. Bu tür izole edilmiş hücreler yama kıskaç teknikleri ve bu iletkenlikleri hedef modülasyonu kullanılarak iyon akımlarının biyofiziksel karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür kültürlerde hazırlanması için bir protokol açıklanmıştır. Protokol plevra ve yanak ganglion kolayca tanımlanabilir glutamaterjik duyu nöronlarının yararlanır ve bunların ayrışma ve minimum bakım açıklar iserumsuz birkaç gün boyunca N kültürü.

Bu protokolde hedeflenen gangliyon içindeki duyu nöronlarının yerle BSC ile PVC nöronlar Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. BSC nöronlar bukkal gangliyonu, sağlam ganglion (Şekil 1A) &#39;de bukkal kütle uzağa dönük yüzeyinin ventral tarafta simetrik 2 oval kümeler halinde bulunmaktadır. PVC nöronlar merkez ekseni (Şekil 1B) doğru plevral ganglion dorsal yüzeyi etrafında saran ikili, V şeklinde kümeler oluştururlar. Sağ veya sol küme olaylar yak...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents at JoVE.com

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu tarif<em&gt; Aplysia</em&gt; Anestezi sonrası, kısa süreli doku kültürü için nöronlar, ve yama kelepçe tekniği ile tek bir hücre iyon akımlarının kayıtların izolasyon.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

12.2K Görüntüleme.  University of Miami. Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu tarif Aplysia Anestezi sonrası, kısa süreli doku kültürü için nöronlar, ve yama kelepçe tekniği ile tek bir hücre iyon akımlarının kayıtların izolasyon.

Video: Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

Elektrot İmalat ve İmplantasyon Aplysia californica Bozulmamış, Serbestçe Behaving Hayvanlar Çok kanallı Sinir ve Kas Kayıtlar

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Nörobilim

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Biyoloji

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Biyomühendislik

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

An<em&gt; In Vitro</emFizyolojik Hareketleri Besleme Motor Programlar ortaya çıkartılması ve kayıt için&gt; Hazırlık<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Iyer, M. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64908">Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

İç Kulak Duyusal Nöron Hücre Gövdelerinin Delikli Yama-Klemp Kayıtları

1. Recording
NOTE: In this procedure, patch-clamp recordings from the isolated ganglion are typically performed 12-24 h after the plating. Other labs have ...

Duyusal nöronlar izolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler