מקורות מימון של מחקר זה: קרן משותפת של החברה באוניברסיטת תל אביב העברת טכנולוגיה, רמות ומרכז הרפואי שיבא, (מ &#39;ע&quot;א וע&quot;כ.), ICRF - ישראלי לחקר סרטן בבסיס (מ&#39; ע&quot;א.) וקרן לאומית למדע ( SI).

1. הכנת תרבית תאים מד&quot;א-MB-231 תאים נרכשו מATCC (אוסף תרבות סוג אמריקאי) ומאוחסנים בחנקן נוזלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 10 6 מד&quot;א-MB-231 תאים בצלחת פטרי בקוטר 92 מ&quot;מ ב10 מ&quot;ל המכילים בינונית מלא Dulbeco שינוי נשר בינוני (DMEM), 10% סוס בסרום, L-גלוטמין 1%, ו -1% Penstrep-Amphotericine אפשר תאי B. להתרבות לכ 80-100% מפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור בינוני תרבות מצלחת וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שכבת התאים לזמן קצר עם (w / v) פתרון טריפסין-EDTA כדי להסיר את כל העקבות של סרום 0.25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.0 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין-EDTA לצלחת ולצפות בתאים על ידי מיקרוסקופ ההפוכה עד ששכבת תאים מפוזרת (בדרך כלל תוך 5 עד 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיום גידול מלא 18 מ&quot;ל ולשאוב בעדינות את התאים על ידי פיפטה. מעביר צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב1,200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות תא גלולה ב 24 מ&quot;ל של מ&quot;קlture בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של השעיה תא 35 מנות מ&quot;מ זכוכית תחתונות (כ -25% מפגש) ומקום בחממה (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני מלא לתאי התפשטות: DMEM עם 10% FBS, אנטיביוטיקה 1% (פתרון העט סטרפטוקוקוס-Ampho 100 יחידות / מיליליטר פניצילין G, סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ&quot;ל, 100) ו 2 מ&quot;מ L-גלוטמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון טריפסין-EDTA, המכיל 0.25% טריפסין-EDTA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות: 92 צלחות פטרי בקוטר מ&quot;מ. מנות 35 מ&quot;מ קוטר פולי-D-ליזין מצופה זכוכית תחתונה התרבות. </li></ol> 2. הכנת תאים להדמית confocal חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 2 x 10 5 מד&quot;א-MB-231 תאים במנות התרבות תחתיות זכוכית ב2 מ&quot;ל בינוני מלא כאמור בסעיף 1. כאשר תרבית תאים מגיעה לנקודת מפגש של 60-70% (כ 10 5 תאים לכל צלחת 3-4 x), המשך עם transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים עם שני פלסמידים encoding היתוך חלבוני γ-טובולין-GFP (לגילוי ניאון של centrosomes) והיסטון אדום (H2B אדום, לגילוי ניאון של כרומוזומים) באמצעות מגיב transfection liposomal Jet-PI, בעקבות פרוטוקול הייצור. בקצרה, לערבב 2 מיקרוגרם מפלסמיד בצינור עם 100 NaCl μl (150 מ&quot;מ). מערבבים את מגיב transfection (100 μl) עם 100 NaCl μl (150 מ&quot;מ) במבחנה שנייה, ודגירת 5 דקות בטמפרטורת חדר (RT). לאחר מכן לשלב את שני פתרונות, לערבב (באמצעות מערבולת קלה) וספין למטה. דגירה במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה של תערובת transfection, לשטוף את תאי פעם עם PBS ולהחליף את המדיום הסלולרי עם 2 מ&quot;ל של DMEM החם ללא תוספים (37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף את תערובת transfection לתאים בDMEM ולאחר מכן להחזיר את התאים לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 8 שעות של דגירה, להחליף DMEM עם 2 מ&quot;ל בינוני מלא ודגירת התאים בחממה במשך 24משאבי אנוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר transfection, להחליף את המדיום של התאים עם 2 בינוניות מלא המכיל 20 מ&quot;ל מיקרומטר PJ-34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 18 שעות נוספות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא התאים לחיות הדמיה confocal לפחות 16 שעות בחדר הדמיה שמירה על התאים ב5% CO 2 ו 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, יבחן transfection transfection יעילות 36 שעות הודעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 2 x 10 5 מד&quot;א-MB-231 תאים בצלחת 6 היטב המכילה coverslip 1 לכל גם ב2 בינוניות מלא מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים כאמור בסעיפים 2.2-2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 36 שעות לאחר transfection לתקן את תאי transfected רכובים על coverslip על ידי דגירה במתנול הקר: אצטון (1:1) פתרון, 7 דקות, -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון הקיבעון ולתת coverslip עם התאים רכובים לייבוש במנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל להאריך מגיב antifade זהב עם DAPI ולתת הדואר coverslip להתייבש בחושך במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחשב את אחוז תאי transfected (אותות אדומים וירוקים) מהאוכלוסייה של תאים (מכתים-DNA על ידי DAPI). אחוז transfection הרצוי הוא כ 20-40%, כאשר 100-200 תאים נספרים. </li></ol></li></ol> 3. פרמטרים טכניים של הגדרות סורק ההדמיה confocal חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ScanMode XYZT; חריר [אוורירי] 1.00; זום 3.5; 8 סיביות רזולוציה; ננומטר לייזר DPSS 561; ארגון, לייזר גלוי 488 ננומטר, לייזר הוא / Ne 633 ננומטר גלוי; מטרת HCX PL APO CS 63x 1.40 UV נפט; מספרי צמצם 1.4; מהירות סריקה 700 הרץ; מדד שבירה 1.52. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצגת 3-D תמונה הוכנה על ידי Imaris הדמיה תוכנה 7.0. </li></ol> 4. Confocal הדמיה של מיטוזה בתאים קבועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 2 x 10 תאי סרטן שד (ATCC), fibroblasts העכבר העוברי הנורמלי (MEF), או PARP1 מד&quot;א-MB-231 חסרים לי 5F (PARP - / -, שהוכן על ידי ד&quot;ר פרנסואז Dantzer) על coverslips זכוכית בצלחת 6 היטב ב2 בינוניות מלא מ&quot;ל. Coverslips נשטפו עם 96% אתנול, בעקבות על ידי שטיפה עם המים DD סטרילי, התייבש במשך שעה 2, והניח בבאר כל צלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PJ-34 (10-30 מיקרומטר) לבינוניות ודגירת התאים לתקופה הנדרשת (HR בדרך כלל עד 96). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips פעם עם PBS (בופר פוספט), ולתקן את התאים באמצעות דגירה במתנול קר כקרח: אצטון (1:1) פתרון, 7 דקות, -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון הקיבעון ולתת את coverslips לייבוש במנדף כימי (בשלב זה, יכול להיות כל הזמן את coverslips ב-20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips פעם אחת עם PBST (PBS בתוספת 0.1% Tween-20) לpermeabilize את קרום התא ולחסום את התאים עם 10% NDS (רגיל חמור בדם) בPBST (&quot;פתרון חסימה &#39;) במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים הקבועים permeabilized עם antibodi העיקריes לשעה 2 ב RT (לצירים וcentrosomes מכתים). את הנוגדנים הם מדוללים בפתרון החסימה כדלקמן: טובולין אנטי α (1:250 דילול) ואנטי טובולין γ (1:200 דילול). נוגדנים ראשוניים מיושמים כדלקמן: להחיל 100 μl (בירידה) מתערובת של הנוגדנים בחסימת פתרון לכל coverslip על כריכת צלחת 6 היטב (הכיסוי הוא הפוך). בעדינות לשים את coverslip על ירידת הנוגדנים, תאי זרע מול הירידה. דגירה coverslips העומדים בפני הנוגדנים במשך שעה 2 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את coverslips בחזרה בבארות ולשטוף את התאים 3 פעמים עם PBST. לאחר מכן להשתמש באותו ההליך מתואר ב4.6 עבור תיוג תאים על coverslips עם נוגדנים משני הניאון. דגירה התאים על coverslips עם נוגדנים משני לשעת 1, RT, בחושך. את הנוגדנים הם מדוללים בפתרון החסימה כמו בצע: Alexa פלואוריד 488 (1:1,000 דילול; ירוק) ואלקסה פלואוריד 568 (1:1,000 דילול;אדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את coverslips באמצעות להאריך מגיב antifade זהב עם DAPI (לצביעת כרומוזומים) ו דגירה הלילה ב RT בחשכה לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התלושים לכסות על ידי מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 5. כדאיויות תא נמדד על ידי ייצור ה-ATP ייצור ה-ATP שנמדד על ידי assay ערכת זיהוי ה-ATP זורח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בצלחת 96 היטב, כ -20,000 תאים בינוניים μl 800 בכל טוב. שלוש בארות ריקות אמורים לשמש לקביעת הארה הרקע של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרת דילול הסטנדרטית ATP מ כ 10 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חומר ניקוי לזה היטב ולנער את הצלחת למשך 5 דקות בהקפה ייקרה, 700 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש כל בקבוקון של &#39;מצע lyophilized&#39; עם 5 מ&quot;ל של &quot;חיץ מצע &#39;בערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון המצע המחודש לבארות, ולנערהצלחת למשך 5 דקות על המסלול שייקר, 700 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצלחת בחושך במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד luminiscence של כל אחד גם על ידי ELISA microplate קורא. </li></ol>

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li><li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+centrosome+function.">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li><li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function.">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li><li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let's+huddle+to+prevent+a+muddle:+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy.">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li><li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+centrosomes+clustering+in+cancer+cells.">Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells.</a> The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).</li><li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy.">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1-mediated+poly(ADP-ribosyl)ation+for+centrosome+duplication.">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li><li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

לחיות ההדמיה confocal סיפק תיעוד בזמן אמת של האפקט הרעיל לתאים של PJ-34 בתאים מרובים centrosomal חיה במהלך מיטוזה (איור 3 ומידע משלים). זה היה התיעוד החי הראשון מייחס cytotoxicity של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים לcentrosomes נוסף דה אשכולות ומוות של תאים, דבר המצביע אינדוקציה של מוות של...

Phenanthrene נגזר PARP1 מעכבים, כולל PJ-34, שנועד להגן על תאים שקטים ממוות של תאים אפופטוטיים הנגרמים על ידי אנרגיה רב PARP1 תיווך-DNA תיקון תחת תנאי לחץ (אוטם שריר הלב או שבץ מוחי) 1. עם זאת, לאחרונה גילה שPJ-34, בריכוז גבוה פי שתיים מזה ישכנע עיכוב PARP1, ניתן אך ורק לגרום למוות של תאים בתאים סרטניים אנושיים 2,3. המהירה יותר ההתפשטות של התא הייתה, יעיל יותר למיגור התאים היה. הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 יוחסה לExtra-centrosomes דה אשכולות במיטוזה 2. רבים נמל תאי סרטן אנושי multicentrosomes 4,5. דגירה של תאים אנושיים של סרטן שד מד&quot;א-MB-231, אשר נמל centrosomes העודפים, עם 20 מיקרומטר PJ-34 יעילות להכחיד את התאים האלה בתוך 72-96 שעות מבלי לפגוע בתאים שקטים או כמה תאים מתרבים פירים מחסה שני centrosomes במיטוזה <sup&gt; 2,3. תאים שפירים כללו תאים אנושיים אפיתל החלב MCF-10, תאי אנדותל אנושיים (HUVEC) ותאי mesenchymal ראשוניים שהוכנו מבלוטת התימוס אנושית. תאים אלה היו עמידים לפעילות ציטוטוקסית של PJ-34. PJ-34 לא התערבו במחזור התא שלהם במהלך הדגירה 96 שעות או להשפיע על היווצרות ציר דו מוקדי 2,3 centrosomes ושלהם. ההרכבה centrosome דו קוטבית היא קריטית להיווצרות ציר דו קוטבי במיטוזה 4,5. לכן, תאים עם יותר משני centrosomes פיתחו מנגנון מולקולרי הבין בקושי, אשכולות centrosomes נוסף שלהם בשני קטבים 4-9. כישלון של הרכבה דו קוטבית של centrosomes עלול לגרום להפרדת צירים וחריגים כרומוזומים קוטביים מעוותת שמעצרי מחזור התא במעצר G2 / M, ומוביל למוות של תאים המיוחס לכישלון mitotic 4,5. המנגנונים המולקולריים שבבסיס Extra-centrosomes דה אשכולות נחקרים באינטנסיביות &lt;sup&gt; 10. הבנת מנגנון המוות הזה תאפשר מיגור בלעדי של תאים סרטניים תוך חוסך 5,10 רקמות בריאות. לכן, תרכובות המפעילות מות תאי קטסטרופה mitotic מציעות מצב חדש של טיפול בסרטן סלקטיבית, שעשויה להיות יעילה במגוון רחב של תוצאות cancers.Our מוצקות אדם מראה כי הדמיה confocal יכולה לשמש כדי לזהות מולקולות המשפיעות על אשכולות במיוחד בcentrosomes 2,3 מיטוזה, עיבוד תרכובות סרטן אלה מיקוד לתרופות. אנחנו תעדו את הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 על ידי סריקת תאים קבועים ולחיות עם אדם סרטן (שכיחות גבוהה של Extra-centrosomes במיטוזה) לעומת תאים נורמלים. צעד אחר צעד התיאור של נהלי ההדמיה המשמשים לזיהוי הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים כלול להלן.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

נגזרי Phenanthrene מתנהגים כמו PARP1 מעכבים חזקים מנעו אשכולות דו מוקדי של centrosomes העודפים בתאים סרטניים אנושיים רב centrosomal במיטוזה. Phenanthridine PJ-34 הייתה המולקולה חזקה ביותר. Declustering של Extra-centrosomes גורם לכישלון mitotic ומוות של תאים בתאים מרובים centrosomal. יש לי הסרטן אנושי מוצק ביותר שכיחות גבוהה של Extra-centrosomes. הפעילות של PJ-34 תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal של סרטן השד אנושי Live-231-MB מד&quot;א תאי transfected עם וקטורי קידוד עבור γ-טובולין הניאון, שהוא נרחב ביותר בcentrosomes ולניאון הווה H2B ביסטון את הכרומוזומים. הסדרי כרומוזומים חריגים וביטול התקבצו מוקדי γ-טובולין המייצגים centrosomes declustered התגלו במד&quot;א-MB-231 תאי transfected לאחר טיפול עם PJ-34. Un-התקבץ מחוץ לcentrosomes בשני קטבי הכישור קדמו המוות של התאים שלהם. תוצאות אלו מקושרות עבורR בפעם הראשונה את הפעילות ציטוטוקסית הבלעדית זוהתה לאחרונה של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים עם Extra-centrosomes דה אשכולות במיטוזה, וכישלון mitotic מוביל למוות של תאים. על פי ממצאים קודמים שנצפו על ידי ההדמיה confocal של תאים קבועים, PJ-34 תאים סרטניים להכחיד באופן בלעדי עם Multi-centrosomes מבלי לפגוע בתאים נורמלים עוברים מיטוזה עם שני centrosomes וכישורים דו מוקדי. פעילות ציטוטוקסית זה של PJ-34 לא הייתה שותפים PARP1 מעכבי עוצמה אחרים, ונצפתה בPARP1 extracentrosomes מחסה MEF לקוי, דבר המצביעה העצמאות של PARP1 עיכוב שלה. לחיות הדמיה confocal הציע כלי שימושי לזיהוי מולקולות חדשות להשמיד את התאים במהלך מיטוזה.

PJ-34 הוא מים יציבים מסיס 1 phenanthridine (איור 1). התוצאות הקודמות שלנו גילו מוות של תאים ודה התקבצו מחוץ לcentrosomes במספר סוגים של תאי סרטן רב centrosomal הקבועים שטופלו בPJ-34. לעומת זאת, תאים מתרבים נורמלים לא היו נפגעים 2,3. Centrosomes זוהה על ידי תיוג כפול עם נוגדנים המ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 בתאים סרטניים שעברו מיטוזה תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal חי. סרטן PJ-34 להכחיד אנושי שד מד&quot;א-MB-231 תאי מחסה Extra-centrosomes במיטוזה. בניגוד למיטוזה דו מוקדי רגילים, את centrosomes במיוחד לא התקבצו בשני קטבי הכישור בנוכחות של PJ-34.

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

cell-death-associated-with-abnormal-mitosis-observed-confocal-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

14.9K Views.  Sheba Medical Center. הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 בתאים סרטניים שעברו מיטוזה תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal חי. סרטן PJ-34 להכחיד אנושי שד מד"א-MB-231 תאי מחסה Extra-centrosomes במיטוזה. בניגוד למיטוזה דו מוקדי רגילים, את centrosomes במיוחד לא התקבצו בשני קטבי הכישור בנוכחות של PJ-34.

Video: Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים בכבד על ידי סרוטיפ Adeno-Associated וירוס רקומביננטי 3 וקטורים

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal cancer (CRC) over healthy individuals. This risk is proportional to the duration and extent of disease, with a cumulative incidence as high as 30% in individuals with longstanding UC with widespread colonic involvement.1 Colonic dysplasia in IBD and colitis associated cancer (CAC) are believed to develop as a result of repeated cycles of epithelial cell injury and repair while these cells are bathed in a chronic inflammatory cytokine milieu.2 While spontaneous and colitis-associated cancers share the quality of being adenocarcinomas, the sequence of underlying molecular events is believed to be different.3 This distinction argues the need for specific animal models of CAC.
Several mouse models currently exist for the study of CAC. Dextran sulfate sodium (DSS), an agent with direct toxic effects on the colonic epithelium, can be administered in drinking water to mice in multiple cycles to create a chronic inflammatory state. With sufficient duration, some of these mice will develop tumors.4 Tumor development is hastened in this model if administered in a pro-carcinogenic setting. These include mice with genetic mutations in tumorigenesis pathways (APC, p53, Msh2), as well as mice pre-treated with genotoxic agents (azoxymethane [AOM], 1,2-dimethylhydrazine [DMH]).5 
The combination of DSS with AOM as a model for colitis associated cancer has gained popularity for its reproducibility, potency, low price, and ease of use. Though they have a shared mechanism, AOM has been found to be more potent and stable in solution than DMH. While tumor development in other models generally requires several months, mice injected with AOM and subsequently treated with DSS develop adequate tumors in as little as 7-10 weeks.6, 7 Finally, AOM and DSS can be administered to mice of any genetic background (knock out, transgenic, etc.) without cross-breeding to a specific tumorigenic strain. Here, we demonstrate a protocol for inflammation-driven colonic tumorigenesis in mice utilizing a single injection of AOM followed by three seven-day cycles of DSS over a 10 week period. This model induces tumors with histological and molecular changes closely resembling those occurring in human CAC and provides a highly valuable model for the study of oncogenesis and chemoprevention in this disease.8

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

We demonstrate a protocol in which administration of the genotoxic agent azoxymethane (AOM) followed by three cycles of the pro-inflammatory agent dextran sulfate sodium (DSS) rapidly and consistently generates colon tumors in mice with morphologic and molecular similarities to those seen in human colitis-associated cancer.

דוגמנות סרטן קוליטיס-Associated עם Azoxymethane (AOM) ונתרן סולפט dextran (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination of dead cells in stroke by waste-management phagocytes of any cellular lineage. Although numerous cells of different origins that are capable of phagocytosis are present in ischemic brain, only part of them actively engulf and digest cell corpses. The selective visualization, quantification and analysis of such active phagocytic waste-management are helpful in assessing brain response to ischemia. Efficient cell death clearance is important for brain recovery from ischemic injury, as it opens the way for the subsequent regenerative processes. The failure to clean the corpses would result in a toxic reaction caused by non-degraded DNA and proteins. The described procedure uses fluorescent probes selectively ligated by a viral topoisomerase to characteristic DNA breaks produced in all phagocytes during engulfment and digestion of cells irreversibly damaged by ischemia. The method is a new tool for the investigation of brain reaction to ischemic injury.

We present a new fluorescence technique for selective in situ labeling of active phagocytic cells, which clear off cell corpses in stroke. The approach is important for assessing brain reaction to ischemia because only a small proportion of phagocytes present in ischemic brain participate in clearance of cell death.

הערכת עמילות phagocytic של מוות של תאים בשבץ ניסויי על ידי בדיקות ניאון Ligatable

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...