저자는 통찰력 토론과 원고 검토를 위해 박사 더글러스 게츠 (학과 화학 및 생명 공학, 오하이오 대학) 박사 파비안 Benencia (바이오 메디컬학과, 오하이오 대학) 감사드립니다. 우리는 또한 도움이 기술 토론 (W. Nuhsbaum 주) 박사 크리스토퍼 Huppenbauer 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 과학 재단 (CBET-1106118)과 국립 연구소 (1R15CA161830-01)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 소프트웨어 설치 <ol><li> StreamPix에게 SimulPix 모듈 또는 수집하고 흑백 CCD 카메라로 캡처 한 이미지를 결합 할 수있는 다른 이미징 소프트웨어와 5 멀티 카메라 소프트웨어를 구입합니다. </li><li> StreamPix 5에 대한 최소 요구 사항은 다음과 같습니다 : 1 기가 바이트 RAM 이상 2.4 GHz의 이상으로 코어 2 듀오를 장착 한 PC를. 지원 IEEE 디지털 또는 아날로그 카메라와 호환 프레임 그래버. 윈도우 XP/7/Vista 32 또는 64 비트. 해상도 1,024 × 768 이상을 지원하는 모니터. 좋은 2D 성능의 그래픽 어댑터 (OCU는 16 배 이상을 표현 권장) 및 RAID-O 구성을 기록 7,200 RPM 하드 디스크 드라이브. </li></ol> 2. 두 가지 색상을 동시에 실시간 이미징 가능 듀얼 카메라 시스템의 설치 <ol><li> MICR의 비디오 포트에 DC2 C-마운트 어댑터를 밀어 현미경에 DC2 배광 방출 스플리터, 또는 유사한 듀얼 카메라 방출 분할 장치를 연결합니다장치의 이색의 하우징에 액세스 할 수 있는지 등을 oscope. </li><li> 여성 C-마운트 (1)에 두 개의 흑백 CCD 카메라를 삽입하고 여성 2 C-마운트합니다. 동일한 카메라가 바람직하다. 유사 카메라가 사용될 수 있지만, 호환성은 내부 하드웨어, 가장 중요한 CCD 이미지 센서에 의존한다. </li><li> 두 카메라에서 이미지를 표시하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 다음 단계 (2.3.1 - 2.3.4) SimulPix 모듈 StreamPix 5에 적용 및 기타 멀티 카메라 이미징 소프트웨어에 적용 할 수 있어야합니다. <ol><li> 오픈 StreamPix 5 작업 리본에서 &quot;작업 공간&quot;을 선택합니다. </li><li> 열기 &quot;작업 공간 관리자&quot;화면의 오른쪽에 위치하며, &quot;새로운 작업 공간&quot;을 선택합니다. </li><li> 카메라의 이름을 지정하면, 소프트웨어가 미리 채워진 목록에서 그래버를 선택하라는 메시지를 따르십시오. 카메라 모델과 일치하는 그래버를 선택하고 두 번째 카메라 작업 영역에 대해 반복합니다. 병합 된 작업 공간의 경우, 한 번 더 반복하지만 오류 M &quot;모든 카메라는 사용중인&quot;essage가 나타납니다. 이 메시지는 정상입니다. </li><li> 병합 작업 영역이로드되면, 작업 영역 1, 작업 영역 2에서의 뷰잉 스크린의 오른쪽에있는 도킹 패널 병합 작업 영역에 카메라를 할당. </li></ol></li><li> 듀얼 카메라 방출 분할 시스템에 카메라를 맞 춥니 다. <ol><li> 밝은 필드 또는 PlanApo 40X 목표 (또는 그 이상)를 사용하여 제조 업체에서 제공하는 교정 그리드와 위상 대조적으로 카메라를 맞 춥니 다. </li><li> 현미경 단계에 제조업체에서 제공 한 금속 코팅 보정 그리드를 배치, 현미경의 접안 렌즈로 빛을 전송하고, 현미경의 무대에서 그리드를 광장. </li><li> 초점 그리드를 가져옵니다. </li><li> 치환하지만, 카메라 1 (수동 카메라)를 정렬, 이색 주택을 제거하지 마십시오. 비닝없이 자동으로 조정하지 않고 그리드를 표시합니다. C-마운트 포트 1에 포커스 조절 다이얼을 사용하여 이미지를 초점. </li><li> 이중 channe에 이색 주택을 눌러L 취득 장치에 완전히 이미지가 모두 카메라에 다이크로 분할되도록. </li><li> 푸 세 64분의 5 &quot;나사를 설정하고 격자의 방향이 C-마운트 포트 2에 초점 조절 다이얼을 사용하여. 두 이미지에 동일한 때까지 여성 C-마운트에 대한 두 번째 카메라를 회전, 카메라에서 이미지를 가져 초점 2. </li><li> 이미징 소프트웨어의 병합 된 작업 공간에 결합 된 화상을 이용하여 얼라인먼트를 마무리. 이것은 하나 보정 그리드의 두 영상의 실시간 의사 색조 오버레이를 참조 할 수있다. DC2의 우측에만 R / L 노브를 사용하여 조합 된 이미지의 위치를​​ 조정한다. 이미지의 왼쪽 / 오른쪽 수직 경계가 정확하게 정렬 될 때까지이 노브를 조정합니다. </li><li> 수평 눈금 막대가 제대로 정렬 될 때까지 두 번째 이미지의 위 / 아래 정렬을 조정하기 위해 U / D 노브를 사용합니다. </li><li> 위 / 아래 정렬하는 동안 약간의 카메라 회전은 세 64분의 5 &quot;인치 SCRE를 풀어, 올바른이 문제가 발생하는 경우WS 카메라 2 회전에 표시된 이미지가 제대로 정렬 될 때까지. </li></ol></li></ol> 3. 평행 판 유량 용기 접착 분석에 대한 암 세포의 준비 <ol><li> 최소 필수 배지 (MEM)에서 배양 BT-20 유방암 세포는 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 37 ° C에서와 CO 2는 앞서 2 바와 5.0 %로 매체를 완료 보충. </li><li> 수확 암 묽은 트립신 처리를 가진 세포는 혈구와 세포를 계산합니다. </li><li> 세척 및 칼슘 및 마그네슘 (DPBS +)와 DPBS에서 소 혈청 (BSA)에서 0.1 % 알부민 10 7 세포 / ml로 세포를 일시. </li><li> 0.1 % BSA DPBS +에서 소정의 최적의 농도로, 기본 항체 정제 된 마우스 항 - 인간 CD24 정제 쥐 HECA-452 (안티 sialofucosylated 항원)을 희석. 30 분 9, 10에 대한 세포를 품어. </li><li> 1,200 rpm에서 원심 분리기 세포 세포 펠렛을 구하십시오. ASPI일차 항체를 평가하고, 0.1 % BSA, admin으로 +로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 0.1 % BSA DPBS + 소정 최적의 농도 차 항체, 염소 항 - 마우스 IgG AlexaFluor 568 (방출 최대 603 NM), 및 염소 항 - 쥐의 IgM AlexaFluor 488 (방출 최대, 519 nm의), 희석. 30 분 동안 세포를 품어. </li><li> 0.1 % BSA DPBS + 10 6 세포 / ml에서 0.1 % BSA DPBS +에 두 번 세포를 세척하고 일시 중지합니다. </li></ol> 4. 평행 판 유량 용기 접착 분석에 대한 반응성 기판의 제조 <ol><li> 35mm 조직 배양 접시 안에 맞는 평행 판 유량 용기의 입구와 출구 포트에 튜브 두 개의 길이를 연결합니다. 한 튜브는 지정된 유량 유체를 철회 할 주사기 펌프, 0.1 % BSA DPBS +와 다른 정지 표지 세포의 저장소에 연결됩니다. </li><li> 유량 용기 1 진공 라인을 연결합니다. </li><li> 35mm 조직 배양 디에 유량 용기의 위치를SH E-셀렉틴 (E-CHO)를 발현하는 중국어 햄스터 난소 세포의 단층을 함유. CHO-E 세포는 37 ° C에서 MEM 완전 배지에서 성장과 5.0 %의 CO 2했다. </li><li> 적절한 진공 밀봉 1을 보장하기 위해 유량 용기 및 / 또는 흐름 챔버 가스켓을 조정합니다. </li><li> 적절한 도장과 기포 형성 (1)의 더 시각적 인 증거를 유량 용기 어셈블리를 모니터링, 저수지에서 유체를 철회. </li><li> 현미경 (라이카 DMI 6000B)에 유량 용기 어셈블리를 놓고 1. </li></ol> 5. 두 가지 색의 이미지 수집 <ol><li> 라이트 가이드에 높은 강도의 빛과 쌍을 생성하는 전원 라이카 EL-6000 소형 광원, 또는 유사한 장치. 원하는 색 / 강도의 형광 물질을 자극하기 위해, 조합 필터 큐브, 즉 G / R (그린 / 레드) 필터 큐브를 통해 빛을 통과 거꾸로 현미경을 사용합니다. </li><li> 이색 하우징 (우울) 올바른 운영 위치에 있고 확인바이 패스 모드에 있지. </li><li> 형광 모드에서 현미경을 운영하고 (빨강, 녹색 /) 적절한 형광 필터 큐브를 선택합니다. </li><li> 카메라 1의 노출 시간과 이득 결정 (적색, 620 ± 60 nm의) 카메라 2 (녹색, 535 ± 40 nm 정도). <ol><li> 모두 적색 및 녹색 발광 채널의 이미지를 얻기 위해 이색 우울. 단지 적색 형광 물질로 표지 된 세포와 유동 챔버 분석을 사용하여 이미징 소프트웨어의 &quot;라이브 설정&quot;에서 카메라 (1)의 노광 시간을 조정하여 적색 채널에 화상을 얻었다. </li><li> 카메라 1의 노출 시간에 2 번 카메라의 노출 시간을 맞 춥니 다. 이미지는 녹색 채널에서 관찰되는 경우, 블리드 - 스루 아티팩트가 존재하고 두 카메라의 노출 시간이 감소 될 필요가있다. </li><li> 비쳐 아티팩트가 더 이상 녹색 채널에 보일 때까지 노출 시간을 감소시키지 카메라 1과 카메라 2에 상응하는 노출 시간을 유지. 이미지 visibilit을 개선하기 위해 카메라 1의 게인을 조정필요한 경우 빨간색 채널 Y. </li><li> 단지 녹색 형광으로 표지 된 세포와 5.4.3하지만, 카메라 (1)에 의해 수집 된 빨강 채널에서 비쳐 유물없이 녹색 채널의 이미지 셀에 카메라 2 노출 시간을 정의 - 반복 5.4.1 단계를 반복합니다. </li><li> Retitrate 항체 비쳐 유물 (11)를 제거하거나 카메라 1과 카메라 2의 노출 시간이 상당히 다른 경우 예를 들어, 이미지가 일시적으로 잘못 정렬 될 수 있습니다 합병이 할 수없는 경우. </li></ol></li><li> 동시에 흐름 챔버 실험에서 두 개의 흑백 CCD 카메라에서 촬영 된 이미지를 볼 수 이미징 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> Streampix 5 SimulPix 모듈 또는 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 두 카메라에서 수집 한 이미지를 병합합니다. </li><li> 필요한 경우 공간적으로, 병합 된 이미지를 정렬 SimulPix 또는 다른 소프트웨어의 디지털 보정 조정을 사용합니다. 이미지는 수평, 수직의 SimulPix 모듈을 보정 할 수있다, 및 회전 조정. </li></ol>

<ol>
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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 세포 또는 분자 운동이 급속 응용 프로그램에서 높은 품질의 이미지를 캡처하는 데 필요한, ​​공간 시간 및 광학 해상도를 가지고 있습니다. 대표적인 결과를 생성, 소프트웨어 설정 및 카메라 설정을 포함하여 듀얼 카메라 방출 분할 시스템의 매개 변수는, 압연 부착 세포가 공간적으로 시간적으로 정렬 된에 병합 된 이미지 시퀀스를 얻기 위해 최적화되었다. ...

이러한 면역 염색과 같은 세포 표면 분자를 분석하는 방법은, 화학적으로 표적 분자의 검출을 허용 형광체에 접합되는 프로브를 사용한다. 라이브 세포 이미징 및 유체 흐름 기반 세포 부착 분석법은 일반적으로 셀룰러 및 / 또는 분자 레벨 1, 2에서 생리적 과정을 포착하도록 설계된 모노크롬 CCD 카메라로 기록된다. 이 카메라는 빠른 프레임 속도 (초당 30 프레임 이상)을 제공하고, (- 빠른 프레임 속도와 짧은 노출 시간에) 뛰어난 시간 해상도를 제공, 매우 민감하다. 그러나, 흑백 카메라는 이미지를 수집하기 위해 (하나의 형광을 검출) 하나의 배출 채널을 캡처 할 수 있습니다. 단일 카메라 발광 분리 시스템은 다수의 발광 채널을 캡처 혼입하지만 종종 시야를 감소시키고 모든 채널을 이미징하는 동일한 노출 시간을 필요로 할 수있다. multip로 표지 세포의 전체 컬러 스펙트럼을 캡처하려면르는 컬러 카메라가 대안으로 사용될 수 있으며, 형광체. 그러나, 컬러 카메라는 특정 응용 프로그램에서 라이브 셀 이미징에 원하는 시간 해상도를 제공 일반적으로 할 수 없습니다. 또 다른 촬상 장치는 높은 시간 해상도를 유지하면서 다수의 파장에서 이미지 생균에 유익되는 애플리케이션을 위해 필요하다. 주요한 실험 애플리케이션은 세포 잠재적 반응성 기판 1, 3 위에 생리학 관련 조건으로 관류되는 평행 평판 유동 챔버 부착 분석법이다. 특정 세포 표면 분자를 표현 흐름에있는 세포 접착과 같은 부착 분자 또는 표면 흡착 된 세포 외 기질 단백질 (4, 5)을 발현하는 세포의 단층으로서 기판 상에 롤있다. 롤링 세포는 두 번째의 분수에 회전 및 병진 운동을 겪을 수있다. 롤링과 같은 세포 표면 분자의 클러스터를 부착 한 세포에 대한 분자의 특징도 potenti있을알은 세포 표면에 활성 개편을 받아야합니다. 따라서, 영상 시스템은 뛰어난 시간 해상도를 제공해야합니다 (초 이상 초당 30 프레임 및 노출 시간 &quot;거의 0&quot;) 셀이 6, 7 롤링의 단계별 진행 상황을 보여줍니다 이미지 시퀀스를 생성 할 수 있습니다. 듀얼 카메라 발광 분리 시스템은 다수의 형광으로 표지 된 세포 이미징을위한 이러한 요구를 충족시킬 수있다. 이중 사진기 방출 분할 시스템보기의 전체 필드를 유지하면서 동시에 두 개의 공간적으로 동일하지만 형광 고유의 이미지를 캡처하는 두 개의 유사한 카메라에 필터 형광 채널을 분할. 이 기술은 각 채널에서 실시간으로 촬영 된 화상의 직접적인 비교를 가능하게하고, 사용자가 신속하게 다른 이미징 기능과 카메라 모델 사이를 전환 할 수있다. 이 기능은 더 나은 시스템을 캡처 할 수있는 하나의 카메라에서 이미지 캡처 설정을 조정하는 데 유용합니다다른 강도, 수명, 그리고 멸종 계수 8 형광. 이미징 소프트웨어와 결합, 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 여러 파장의 라이브 셀 이미징 분석의 실시간 기록을 허용하고 세포 행동을 연구하기 위해 형광을 사용하여 시험 관내 분석을 향상시킬 수 있습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

세포막의 특정 분자를 검출하는 다색 면역 형광 현미경 동적 유동 조건 하에서 세포 부착을 규제 메커니즘을 조사하는 평행 판 유동 챔버 분석법으로 연결될 수있다. 예를 들어, 다 형광으로 표지 된 암세포는 암 전이의 메커니즘을 모델링하는 잠재적 반응성 기판을 통해 관류 될 수있다. 그러나 실시간 라이브 세포 분석을위한 이미지 수집의 멀티 채널 단일 카메라 시스템 및 컬러 카메라 전시 단점. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 동시에 유량 용기에 형광 표지 세포의 실시간 이미지 시퀀스를 캡처하는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용했다. 듀얼 카메라 발광 분할 시스템 필터 정의 파장함으로써 동시에이 공간적으로 동일하지만 형광 특정 화상 촬영이 모노크롬 CCD 카메라로 배열한다. 이어서, psuedocolored 1 채널 이미지는 단일로 결합실시간 세포가 관심 영역에 걸쳐 빠른 속도로 이동하는 여러 표적 분자를 공개 할 수 순서를 합병했다.

병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석은 동시에 두 개의 발광 채널에서 실시간 이미지 시퀀스를 캡처 한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템 (그림 1)를 설명하는 데 사용되었다. 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 형광 항 - 인간 CD24과 HECA-452 (sialofucosylated 항원을 검출) 단일 클론 항체 및 적절한 보조 항체 (그림 2)으로 표시 한 BT-20 세포를 발견했습니다. 일부 압연 세포가 빨간 신?...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

두 가지 색상의 형광 현미경을위한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 뛰어난 광학 및 시간 해상도, 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 포함하여 특정 살아있는 세포 분석의 요구 사항과 실시간 이미지 시퀀스를 생성합니다. 소프트웨어가 동시에 취득한 발광 채널의 이미지를 병합하기 위해 사용될 때, 모조 착색 이미지 시퀀스가​​ 생성된다.

동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K 조회수.  Ohio University.  두 가지 색상의 형광 현미경을위한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 뛰어난 광학 및 시간 해상도, 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 포함하여 특정 살아있는 세포 분석의 요구 사항과 실시간 이미지 시퀀스를 생성합니다. 소프트웨어가 동시에 취득한 발광 채널의 이미지를 병합하기 위해 사용될 때, 모조 착색 이미지 시퀀스가​​ 생성된다. 

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

연구

생체공학

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

멀티 채널 듀얼 전기장 미세 유체 칩을 이용하여 폐암 세포의 Electrotaxis 연구

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

휴대용 임상 Photoacoustic 실시간 비-침략 적 작은 동물 이미징을 위한 이미징 시스템

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

Nafion 코팅의 제조, 미생물 발효 하는 동안 실시간 산도 모니터에 그래 핀 산화물/폴리아닐린 Chemiresistive 센서 감소

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...