著者は、洞察力に富んだ議論や論文審査のために博士ダグラス·ゲッツ（化学と生体分​​子工学専攻、オハイオ大学）博士ファビアンBenencia（医歯薬学総合研究科、オハイオ大学）に感謝したい。また、役立つ技術的な議論（W. Nuhsbaum社）博士クリストファーHuppenbauerに感謝します。この作品は、国立科学財団（CBET-1106118）と国立衛生研究所（1R15CA161830-01）からの補助金によって支えられている。

1。ソフトウェアのインストール<ol><li>購入StreamPix SimulPixモジュールまたはモノクロCCDカメラで撮影した画像を収集し、組み合わせることのできる他のイメージングソフトウェアを使用して5マルチカメラソフトウェア。 </li><li> StreamPix 5の最小要件は次のとおりです。2ギガバイト以上のRAMと2.4 GHz以上でのCore 2 Duoを搭載したパソコン。サポートIEEEデジタルまたはアナログのカメラと互換性のあるフレームグラバー。 Windowsは、32ビットまたは64ビットをXP/7/Vista。解像度102​​4×768以上をサポートするモニタ。優れた2D性能を備えたグラフィックアダプタ（OCUは16倍以上が推奨されて発現する）と7,200 RPMのRAID-0構成で記録するためのハードディスクドライブ。 </li></ol> 2。 2色同時リアルタイムイメージングが可能なデュアルカメラシステムの設置<ol><li> MICRのビデオポートにDC2 Cマウントアダプターをスライドさせて顕微鏡に、DC2フォトメトリック放射スプリッタ、または同様のデュアルカメラ発光分割装置を接続デバイス上の二色性の筐体がアクセス可能であることなどOSCOPE。 </li><li>女性Cマウント1に2のモノクロCCDカメラを挿入し、女性2 Cマウント。同一のカメラが好ましい。同様のカメラを用いることができるが、互換性は、CCDイメージセンサ、最も重要なのは、内部ハードウェアに依存する。 </li><li>両方のカメラからの画像を表示するには、画像処理ソフトウェアを使用してください。次の手順（2.3.1 - 2.3.4）SimulPixモジュールとStreamPix 5に適用され、他のマルチカメラ画像処理ソフトウェアに適応しなければならない。 <ol><li>オープンStreamPix 5とタスクリボンの「ワークスペース」を選択します。 </li><li>開いた「ワークスペース·マネージャ」画面の右端に位置しており、「新しいワークスペース」を選択します。 </li><li>カメラに名前を付けた後、ソフトウェアがあらかじめ入力リストからグラバーを選択するように指示に従います。カメラモデルと一致グラバーを選択し、第2のカメラワークスペースの繰り返し。マージされたワークスペースには、もう一度繰り返しますが、エラーM &quot;すべてのカメラが使用されている」essageが表示されます。このメッセージは正常です。 </li><li>マージされたワークスペースがロードされると、視聴画面の右側に配置され、ドッキングパネルでマージされたワークスペースにワークスペース1とワークスペース2からカメラを割り当てます。 </li></ol></li><li>デュアルカメラの排出分割システムでカメラの位置を合わせます。 <ol><li>明視野またはPlanApo対物レンズ40倍（またはそれ以上）を使用して、メーカーが提供するキャリブレーショングリッド位相コントラストにカメラの位置を合わせます。 </li><li>顕微鏡ステージ上で、製造業者によって提供された金属でコーティングされたキャリブレーショングリッドを配置し、顕微鏡の接眼レンズに光を送信し、顕微鏡ステージ上のグリッドを二乗。 </li><li>焦点にグリッドを持参してください。 </li><li>変位が、カメラ1（バイパスカメラ）を整列させるために、ダイクロイックハウジングを削除しないでください。ビニングなしで自動スケーリングせずにグリッドを表示します。 Cマウントポート1に焦点調整ダイヤルを使用して画像の焦点を合わせる。 </li><li>デュアルchanneにダイクロ住宅をプッシュ完全リットル取得装置、画像が両方のカメラにダイクロによって分割されるようになっている。 </li><li> 3 64分の5」のネジを設定し、グリッドの向きが両方のイメージで同じになるまで、女性のCマウント2に第2のカメラを回転させます。Cマウントポート2上で焦点調整ダイヤルで、カメラからの画像を持って緩め焦点に2。 </li><li>イメージングソフトウェアのマージされたワークスペースに合成された画像を使用して配置を完成させる。これは1キャリブレーショングリッドの二つの画像をリアルタイムで疑似カラーオーバーレイを見ることができます。 DC2の右側にのみ、R / Lのノブを使用して合成された画像位置を調整します。画像の左/右の縦の境界を正確に整列されるまで、このノブを調整します。 </li><li>水平格子棒が適切に整列されるまで、第2の画像のアップ/ダウンの配置を調整するために、U / Dノブを使用してください。 </li><li>上/下の位置合わせの際に若干のカメラの回転は3 64分の5 &quot;インチSCREを緩めて、正しいこの問題が発生した場合カメラ2のためのWSと表示された画像が適切に整列されるまで回転させます。 </li></ol></li></ol> 3。平行板フローチャンバー接着アッセイのためのがん細胞の調製<ol><li>最小必須培地（MEM）中で培養BT-20乳癌細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン、37℃で、およびCO 2は 、先2に記載5.0％で媒体を完了するために補充した。 </li><li>希薄トリプシン処理で収穫癌細胞および血球計算板を用いて細胞を数える。 </li><li>洗浄とカルシウムとマグネシウム（DPBS +）とのDPBS中ウシ血清（BSA）、0.1％のアルブミン中の10 7細胞/ mlで細胞を懸濁。 </li><li> 0.1％BSA、DPBS +での所定の最適濃度に、一次抗体、精製マウス抗ヒトCD24および精製ラットHECA-452（抗シアロフコシル化抗原）希薄。 30分9、10のために細胞をインキュベートします。 </li><li> 1,200 rpmで遠心分離細胞は、細胞ペレットを得た。 ASPI一次抗体を評価し、0.1％BSAをDBPS +で細胞を2回洗浄します。 </li><li> 0.1％BSA DPBS +で所定の最適濃度は、二次抗体、ヤギ抗マウスIgGのAlexaFluor 568（発光最大値、603ナノメートル）、およびヤギ抗ラットIgM抗体のAlexaFluor 488（発光最大519 nm）を、希釈する。 30分間、細胞をインキュベートします。 </li><li>細胞を2回洗浄し、0.1％BSA、DPBS +で10 6細胞/ mlで、0.1％のBSA、DPBS +で一時停止。 </li></ol> 4。平行板フローチャンバー接着アッセイのための反応基質の調製<ol><li> 35mm組織培養皿内に収まるパラレルプレートフローチャンバーの入口および出口ポートにチューブを2つの別々の長さを接続する。 Oneチューブを所定の流量で流体を撤退するシリンジポンプに0.1％BSA DPBS +およびその他の中に懸濁標識細胞のリザーバに接続します。 </li><li>フローチャンバー1に真空ラインを接続します。 </li><li> 35ミリメートルの組織培養ディ経由でフローチャンバーを配置するshのE-セレクチン（CHO-E）を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞の単層を含有する。 CHO-E細胞を、37℃でMEM完全培地中で増殖させ、5.0％CO 2れた。 </li><li>適切な真空シール1を確保するために、フローチャンバーおよび/ ​​またはフローチャンバーガスケットを調整します。 </li><li>適切なシール及び気泡の発生1の視覚的な証拠なしのフローチャンバアセンブリを監視する、リザーバから流体を引き出す。 </li><li>顕微鏡（ライカDMI 6000B）のフローチャンバアセンブリを配置する1。 </li></ol> 5。 2色画像を取得<ol><li>光ガイド内に高強度の光と結合する、それを生成するために電力ライカEL-6000小型の光源、又は同様の装置。所望の色/輝度の蛍光プローブを励起するため、フィルターキューブコンビネーションフィルターキューブ、 すなわち G / R（緑/赤）を介して、この光を通過させるように倒立顕微鏡を使用してください。 </li><li>ダイクロハウジング（押し下げ）が正しい動作位置にあることを確認し、バイパス·モードではありません。 </li><li>蛍光モードで顕微鏡を操作して、適切な蛍光フィルターキューブ（緑/赤）を選択します。 </li><li>カメラ1の露光時間、ゲイン決定（赤、620±60 nm）であり、カメラ2（緑; 535±40nmで）。 <ol><li>両方の赤と緑の発光チャンネルの画像を取得するために、ダイクロイックを押し下げる。赤色のみフルオロフォアで標識された細胞を用いたフローチャンバーアッセイを使用して、イメージングソフトウェアの「ライブ設定」にカメラ1の露光時間を調整することにより、赤のチャネル画像を得る。 </li><li>カメラ1の露光時間にカメラ2の露光時間と一致する。画像は緑チャネルにおいて観察された場合、ブリー​​ドスルーアーチファクトが存在し、両方のカメラの露光時間を短縮する必要がある。 </li><li>ブリードスルーアーチファクトが緑色チャネルに見えなくなるまで、露光時間を短縮せず、カメラ1とカメラ2の露光時間と同等に保つ。イメージを改善するために、カメラ1の利得を調整visibilit必要に応じて、赤チャンネルのY。 </li><li>唯一の緑の蛍光体で標識した細胞で5.4.3が、カメラ1が収集し、赤のチャンネルでのブリードスルーのアーティファクトなしに緑のチャンネルで画像セルにカメラ2で露光時間を定義する - を繰り返して、5.4.1を繰り返します。 </li><li>ブリードスルー場合アーチファクトRetitrate抗体が11を除去することができない、又は、カメラ1とカメラ2の露光時間は、マージされた画像が時間的にずれてもよいように、実質的に異なっている場合。 </li></ol></li><li>同時にフローチャンバー実験における2モノクロCCDカメラから撮影した画像を表示するには、画像処理ソフトウェアを使用してください。 </li><li> Streampix 5のSimulPixモジュールまたは代替ソフトウェアパッケージを使用して両方のカメラから収集された画像を合成。 </li><li>必要に応じて、空間的にマージされた画像を位置合わせするためにSimulPixにおけるデジタル補正の調整や別のソフトウェアを使用してください。画像は、水平、垂直のためSimulPixモジュールを補正することができる、および回転の調整。 </li></ol>

<ol>
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M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

デュアルカメラ発光分割システムは、細胞または分子の動きが速い用途で高品質の画像をキャプチャするために必要な空間的、時間的、および光学的分解能を有する。代表的な結果を生成する際に、ソフトウェアの設定やカメラ設定を含むデュアルカメラ発光分割システム、のパラメータは、ローリングおよび接着細胞は、空間的および時間的に整列されたマージされた画像シーケンスを得?...

例えば、免疫染色、細胞表面上の分子の分析のための方法、化学的標的分子の検出を可能にする、フルオロフォアにコンジュゲートされたプローブを用いる。生細胞イメージングおよび流体力学的フローベースの細胞接着アッセイは、典型的には、細胞および/ ​​または分子レベル1、2で生理学的プロセスを捕捉するように設計されたモノクロCCDカメラで記録される。これらのカメラは、高速フレームレート（1秒あたりのより大きい30フレーム）を提供し、（原因速いフレームレートと短い露光時間に）非常に優れた時間分解能を提供する、非常に敏感である。しかし、モノクロカメラは、画像のみを収集するために（シングル蛍光体を検出する）、単一の放出チャネルをキャプチャすることができます。単一のカメラ発光分割システムは、複数の放射チャネルを捕捉するために組み込まれたが、多くの場合、視野を低減し、全チャンネルを画像化するために同じ露光時間を必要とすることができる。 multipで標識した細胞から完全なカラースペクトラムをキャプチャするにはルフルオロフォア、カラーカメラは、代替として使用することができる。しかしながら、カラーカメラは、一般に、特定の用途において生細胞イメージングのために所望の時間分解能を提供することができない。別の撮像装置は、高時間分解能を維持しながら、複数の波長で画像生細胞に有利である用途のために必要とされる。プライミング実験のアプリケーションは、細胞が潜在的に反応性の基板1,3の上に生理学的に関連する条件下で灌流された平行板フローチャンバー接着アッセイである。このような接着分子または表面に吸着細胞外マトリックスタンパク4,5を発現する細胞単層のような特定の細胞表面分子を発現する細胞をフロー内の基板上に付着し、ロールよい。ローリング細胞は、第二の画分に回転および並進運動を受けることができる。このような細胞表面分子のクラスターとしてローリングおよび接着細胞上の分子の機能も、ポテンショを有する細胞表面上で活性の再編成を受けるらこれにより、撮像システムは、6,7の圧延セルのステップバイステップの進行を示す画像シーケンスを生成するために、例外的な時間分解能（秒以上と露光時間「ゼロに近い」毎秒30フレーム）を提供しなければならない。デュアルカメラ発光分割システムは、複数のフルオロフォアで標識された細胞を画像化するためのこれらの要求を満たすことができる。 デュアルカメラ発光分割システムは、全視野を維持しながら、同時に2つの空間的に同一であるが、フルオロフォア固有の画像を捕捉するつの類似のカメラに蛍光チャネルを分割し、フィルタ。この技術は、各チャネルの実時間で撮像した画像の直接比較を可能にし、ユーザが迅速に異なる撮像機能を備えたカメラモデルの間で切り替えることができる。この特徴は、より良いシステムをキャプチャすることを可能にする1つのカメラで画像キャプチャ設定を調整する場合に有用である異なる強度、寿命、および吸光係数8と蛍光団。イメージングソフトウェアと相まって、二重カメラ放出分割システムは、複数の波長の生細胞イメージングアッセイのリアルタイム記録を可能にし、細胞の挙動を研究するために蛍光を使用するin vitroアッセイを高めることができる。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

細胞膜に特異的な分子を検出するための多色免疫蛍光顕微鏡は、動的流動条件下での細胞接着を支配するメカニズムを調べるために平行プレートフローチャンバーアッセイと結合することができる。例えば、複数のフルオロフォアで標識された癌細胞は、癌転移のメカニズムをモデル化するために潜在的に反応性の基板上に灌流することができる。しかしながら、リアルタイムの生細胞分析のための画像取得におけるマルチチャネル単一カメラシステムとカラーカメラの欠点を呈する。これらの制限を克服するために、我々は同時に、フローチャンバー内の蛍光標識された細胞のリアルタイム画像シーケンスをキャプチャするために、デュアルカメラ発光分割システムを使用した。デュアルカメラ発光分割システムフィルタ定義された波長は、それによって、同時に2つの空間的に同一であるが、フルオロフォア固有の画像を取り込む2のモノクロCCDカメラ、にわたる。続いて、1チャンネルの画像を単一に統合されpsuedocoloredリアルタイムは、関心領域を横切って急速に移動する細胞上の複数の標的分子を明らかにすることができる配列をマージ。

パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイは、同時に2つの発光チャネル（ 図1）内のリアルタイム画像シーケンスをキャプチャし、デュアルカメラ放出分割システムを実証するために使用した。デュアルカメラの排出分割システムは、蛍光抗ヒトCD24およびHECA-452（シアロフコシル化抗原を検出する）モノクローナル抗体および適切な二次抗体（ 図2）で標識し?...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

二色蛍光顕微鏡用のデュアルカメラ発光分割システムは、優れた光学的および時間的解像度、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを含む特定の生細胞アッセイの要件にリアルタイム画像シーケンスを生成する。ソフトウェアは同時に取得放出チャネルからの画像を合成するために使用された場合、疑似色画像シーケンスが生成される。

同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

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Bioengineering

9.5K ビュー.  Ohio University. 二色蛍光顕微鏡用のデュアルカメラ発光分割システムは、優れた光学的および時間的解像度、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを含む特定の生細胞アッセイの要件にリアルタイム画像シーケンスを生成する。ソフトウェアは同時に取得放出チャネルからの画像を合成するために使用された場合、疑似色画像シーケンスが生成される。 

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

生物工学

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

手持ちの臨床音響小動物の非侵襲的な実時間イメージングによる画像計測

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

イン・シトゥバイオプロセスにおける単細胞形態のリアルタイム測定のための顕微鏡検査

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...