Les auteurs tiennent à remercier le Dr Douglas Goetz (Département de chimie et génie biomoléculaire de l&#39;Université de l&#39;Ohio) et le Dr Fabian Benencia (Département des sciences biomédicales, Université de l&#39;Ohio) pour des discussions pertinentes et évaluation des manuscrits. Nous remercions également le Dr Christopher Huppenbauer pour les discussions techniques utiles (W. Nuhsbaum Inc.). Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (CBET-1106118) et les National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

Une. Installation du logiciel <ol><li> Achetez Streampix 5 logiciels multi-caméras avec module SimulPix ou un autre logiciel d&#39;imagerie capable de collecter et combiner des images captées par les caméras CCD monochrome. </li><li> Exigences minimales pour Streampix 5 comprennent: Un PC équipé Core 2 Duo 2,4 GHz ou mieux avec 2 Go de RAM ou plus. Une caméra IEEE soutenu numérique ou analogique et d&#39;acquisition d&#39;images compatible. Fenêtres XP/7/Vista 32 ou 64 bits. Un moniteur supportant une résolution de 1024 x 768 ou supérieure. Une carte graphique avec de bonnes performances 2D (UCO express 16x ou plus est recommandé) et 7200 RPM disque dur pour l&#39;enregistrement avec configuration RAID-O. </li></ol> 2. Installation d&#39;un système de double caméra Capable de deux couleurs simultanée d&#39;imagerie en temps réel <ol><li> Connectez le séparateur DC2 Photometrics d&#39;émission, ou dispositif d&#39;émission de fractionnement double caméra similaire, au microscope en faisant glisser l&#39;adaptateur DC2 monture C dans le port vidéo de la MICRoscope de telle sorte que le logement de la dichroïque sur le dispositif est accessible. </li><li> Insérez deux caméras CCD monochrome en femelle monture C 1 et C-femme monter 2. Caméras identiques sont préférables. Caméras similaires peuvent être utilisés, mais dépend de la compatibilité matérielle interne, le plus important au capteur d&#39;image CCD. </li><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie pour afficher les images des deux caméras. Les étapes suivantes (2.3.1 - 2.3.4) s&#39;appliquent à Streampix 5 avec module SimulPix et doivent être adaptés à d&#39;autres logiciels d&#39;imagerie multi-caméra. <ol><li> Ouvrir Streampix 5 et sélectionnez &quot;espace de travail&quot; dans le ruban de la tâche. </li><li> Ouvrir &quot;gestionnaire d&#39;espace de travail», situé à l&#39;extrême droite de l&#39;écran et sélectionnez «nouvel espace de travail&quot;. </li><li> Après la nomination d&#39;un appareil photo, suivez le logiciel demande de sélectionner une carte d&#39;acquisition d&#39;une liste pré-remplie. Sélectionnez la carte d&#39;acquisition correspondant au modèle de l&#39;appareil et répétez l&#39;opération pour le deuxième espace de travail de la caméra. Pour l&#39;espace de travail fusionnée, répéter une fois de plus, mais «toutes les caméras sont en cours d&#39;utilisation&quot; erreur message s&#39;affiche. Ce message est normal. </li><li> Une fois l&#39;espace de travail fusionnée est chargé, affecter les caméras de l&#39;espace de travail et espace de travail 1 2 à l&#39;espace de travail fusionnée dans le panneau d&#39;accueil situé sur le côté droit de l&#39;écran de visualisation. </li></ol></li><li> Alignez les caméras dans le système de séparation des émissions de double caméra. <ol><li> Alignez les caméras dans le champ lumineux ou contraste de phase avec la grille de calibrage fourni par le fabricant en utilisant un objectif Planapo 40X (ou plus). </li><li> Envoyer lumière pour les oculaires du microscope, placer la grille de calibrage revêtus de métal qui a été fourni par le fabricant sur la platine du microscope et de la place de la grille sur la platine du microscope. </li><li> Apportez la grille dans le foyer. </li><li> Déplacer, mais ne pas retirer le boîtier dichroïque pour aligner la caméra 1 (caméra de dérivation). Afficher la grille sans binning et sans le redimensionnement. Concentrer l&#39;image en utilisant la molette de réglage de mise au point sur le port monture C 1. </li><li> Poussez le boîtier dichroïque dans le double Channel dispositif d&#39;acquisition entièrement, de sorte que l&#39;image est divisée par le dichroïque à deux caméras. </li><li> Desserrer les trois 5/64 &quot;set vis et tourner la deuxième caméra sur la femelle monture C 2 jusqu&#39;à ce que l&#39;orientation de la grille est identique dans les deux images. Utilisation de la molette de réglage de mise au point sur le C-monter le port 2, amener l&#39;image de la caméra 2 dans le foyer. </li><li> Achever l&#39;alignement de l&#39;aide de l&#39;image combinée dans l&#39;espace de travail fusionnée du logiciel d&#39;imagerie. Cela permet de voir un pseudo-superposition en temps réel des deux images de la grille d&#39;étalonnage. Ajuster les positions d&#39;image combinées en utilisant uniquement le système R / L bouton sur le côté droit de la DC2. Réglez ce bouton jusqu&#39;à ce que droite / gauche limite verticale des images est précisément aligné. </li><li> Utilisez le bouton U / D pour régler l&#39;alignement haut / bas de la deuxième image jusqu&#39;à ce que les barres horizontales de la grille sont correctement alignés. </li><li> Si lors de l&#39;alignement vers le haut / vers le bas une légère rotation de la caméra se produit, Corriger cette question en desserrant les trois 5/64 &quot;scre poucesws pour appareil photo 2 et tourner jusqu&#39;à ce que l&#39;image affichée est correctement aligné. </li></ol></li></ol> 3. Préparation des cellules cancéreuses pour plaques parallèles Chambre de circulation Essai d&#39;adhésion <ol><li> Culture BT-20 des cellules de cancer du sein dans un milieu essentiel minimum (MEM) additionné de milieu complet avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 37 ° C et 5,0% de CO 2, comme précédemment décrit 2. </li><li> Récolte des cellules cancéreuses avec un traitement à la trypsine diluée et compter les cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Laver et suspendre les cellules à 10 7 cellules / ml dans 0,1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans du DPBS avec calcium et magnésium (DPBS +). </li><li> Diluer les anticorps primaires, les souris purifié anti-CD24 humain et de rat purifiée HECA-452 (les antigènes anti-sialofucosylated), à une concentration optimale prédéterminée dans 0,1% de BSA DPBS +. Incuber les cellules pendant 30 min 9, 10. </li><li> Centrifuger les cellules à 1200 rpm pour obtenir un culot cellulaire. Aspiévaluer anticorps primaire, et laver les cellules deux fois avec 0,1% de BSA SPD +. </li><li> Diluer anticorps secondaires, de chèvre anti-IgG de souris AlexaFluor 568 (émission max, 603 nm), et de chèvre anti-IgM de rat AlexaFluor 488 (émission max, 519 nm), à une concentration optimale prédéterminée dans 0,1% de BSA DPBS +. Incuber les cellules pendant 30 min. </li><li> Laver les cellules deux fois et suspendre dans 0,1% de BSA DPBS + à 10 6 cellules / ml dans 0,1% de BSA DPBS +. </li></ol> 4. Préparation du réactif Substrat pour plaque parallèle Chambre de circulation Essai d&#39;adhésion <ol><li> Relier deux longueurs de tube séparées pour les ports de la chambre d&#39;écoulement parallèle de la plaque qui s&#39;adapte à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de culture tissulaire de 35 mm entrée et de sortie. Un tube se connecte au réservoir de cellules marquées en suspension dans 0,1% de BSA DPBS + et l&#39;autre à la pompe à seringue, qui va retirer du fluide à un débit spécifié. </li><li> Connexion à une ligne vide à la chambre d&#39;écoulement 1. </li><li> Placez la chambre d&#39;écoulement sur le 35 mm culture de tissus dish contenant une monocouche de cellules d&#39;ovaire de hamster chinois exprimant la sélectine E (CHO-E). Des cellules CHO-E ont été cultivées dans du milieu MEM complet à 37 ° C et 5,0% de CO 2 2. </li><li> Ajuster la chambre d&#39;écoulement et / ou le joint de la chambre d&#39;écoulement afin d&#39;assurer un joint étanche au vide suffisant 1. </li><li> Retirer du fluide depuis le réservoir, le contrôle de l&#39;assemblage de la chambre d&#39;écoulement pour une bonne étanchéité, et aucune preuve visuelle de la formation de bulles d&#39;air 1. </li><li> Placer l&#39;assemblage de la chambre d&#39;écoulement sur ​​le microscope (Leica DMI 6000B) 1. </li></ol> 5. Deux couleurs d&#39;acquisition de l&#39;image <ol><li> Puissance d&#39;une source Leica EL-6000 lumière compact, ou un dispositif similaire, pour générer une lumière de forte intensité et deux dans un guide de lumière. Utilisez un microscope inversé à passer cette lumière à travers un filtre de combinaison cube, soit G / R (vert / rouge) filtre cube, pour exciter des fluorophores de couleur / intensité souhaitée. </li><li> Assurez logements dichroïque est en position de fonctionnement correct (déprimé) etn&#39;est pas en mode de dérivation. </li><li> Fonctionner en mode microscope de fluorescence et sélectionnez bon cube de filtre de fluorescence (vert / rouge). </li><li> Déterminer le temps d&#39;exposition et le gain en appareil photo 1 (rouge, 620 ± 60 nm) et un appareil photo 2 (vert, 535 ± 40 nm). <ol><li> Appuyez sur la dichroïque pour obtenir des images dans les deux canaux d&#39;émission rouge et vert. Utilisation d&#39;un dosage de la chambre d&#39;écoulement avec des cellules marquées avec le fluorochrome rouge seulement, et obtenir une image dans le canal rouge en ajustant le temps d&#39;exposition de la caméra 1 en &quot;direct&quot; paramètres du logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Correspondre à la durée d&#39;exposition de l&#39;appareil photo 2 à la durée d&#39;exposition de la caméra 1. Si une image est observée dans le canal vert, les artefacts de purge-through sont présents et la durée d&#39;exposition dans les deux appareils doit être réduite. </li><li> Garder le temps d&#39;exposition équivalent à huis clos et une caméra 2, de réduire le temps d&#39;exposition jusqu&#39;à ce que l&#39;artefact de purge par n&#39;est plus visible dans le canal vert. Réglez le gain de la caméra 1 pour améliorer l&#39;image visibility dans le canal rouge, si nécessaire. </li><li> Répétez les étapes 5.4.1 - 5.4.3 avec des cellules marquées avec le fluorophore vert seulement, mais de définir le temps d&#39;exposition avec un appareil photo 2 cellules d&#39;image dans le canal vert sans artefacts purge travers du canal rouge recueillies par la caméra 1. </li><li> Anticorps Retitrate si artefacts purge par ne peuvent être éliminés 11, ou si le temps d&#39;exposition de la caméra 1 et la caméra 2 sont sensiblement différents, tels que la fusion des images peuvent être temporellement alignées. </li></ol></li><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie pour visualiser les images capturées simultanément à partir de deux caméras CCD monochrome dans l&#39;expérience de la chambre d&#39;écoulement. </li><li> Fusionner des images recueillies par les deux caméras en utilisant le module de SimulPix Streampix 5 ou un logiciel alternatif. </li><li> Utiliser les ajustements de correction numériques en SimulPix ou logiciel alternatif pour aligner spatialement les images fusionnées, le cas échéant. Les images peuvent être corrigées avec le module SimulPix pour horizontal, verticalet les ajustements de rotation. </li></ol>

<ol>
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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le système de fractionnement des émissions de double caméra a une résolution spatiale, temporelle, et optique nécessaire pour capturer des images de haute qualité dans des applications où la cellule ou le mouvement moléculaire est rapide. Dans la génération des résultats représentatifs, les paramètres du système de fractionnement caméra émission double, y compris les paramètres logiciels et réglages de l&#39;appareil, ont été optimisés pour obtenir une séquence d&#39;image fusionnée dans laquelle ...

Des procédés pour l&#39;analyse de molécules sur la surface des cellules, telles que l&#39;immunocoloration, emploient des sondes qui sont chimiquement conjugués à des fluorophores, ce qui permet la détection de molécules cibles. Imagerie des cellules vivantes et hydrodynamiques des essais d&#39;adhérence des cellules basées sur les flux sont généralement enregistrés avec des caméras CCD monochrome conçus pour capturer les processus physiologiques au niveau cellulaire et / ou moléculaire 1, 2. Ces caméras sont très sensibles, offrir des taux de trame rapides (plus de 30 images par seconde), et de fournir une résolution temporelle exceptionnelle (en raison de taux de trame rapides et des temps d&#39;exposition court). Toutefois, les caméras monochromes ne peuvent capturer un canal d&#39;émission unique (détection d&#39;un seul fluorophore) pour recueillir des images. Simples systèmes caméra émission de séparation peuvent être incorporés à capturer plusieurs canaux d&#39;émission mais réduisent souvent le champ de vision et nécessitent le même temps d&#39;exposition pour l&#39;imagerie de tous les canaux. Pour capturer le spectre complet des couleurs de cellules marquées par multiparele fluorophores, une caméra couleur peut être utilisé comme une alternative. Cependant, les caméras couleurs ne sont généralement pas capables de fournir la résolution temporelle souhaitée pour l&#39;imagerie des cellules vivantes dans certaines applications. Un autre dispositif de formation d&#39;image est nécessaire pour les applications dans lesquelles il est avantageux de l&#39;image des cellules vivantes dans des longueurs d&#39;ondes multiples tout en conservant une haute résolution temporelle. Une application expérimentale de choix est l&#39;analyse de l&#39;adhérence de la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles, dans lequel les cellules sont perfusées dans des conditions physiologiquement pertinentes sur un substrat potentiellement réactif 1, 3. Les cellules dans le flux qui expriment des molécules de surface spécifiques de cellules peuvent adhérer et roulent sur ​​le substrat, par exemple une monocouche de cellules exprimant des molécules d&#39;adhésion ou des protéines de surface adsorbé extracellulaires matricielles 4, 5. Cellules de roulement peuvent subir un mouvement de rotation et de translation en une fraction de seconde. Les caractéristiques moléculaires et de laminage sur les cellules adhérentes, telles que des grappes de molécules de surface cellulaire, ont également le potentiomètreal à subir une réorganisation active sur la surface de la cellule. Ainsi, les systèmes d&#39;imagerie doivent fournir une résolution temporelle exceptionnel (30 images par seconde ou plus, et &quot;proche de zéro&quot; temps d&#39;exposition) pour générer une séquence d&#39;images qui illustre la progression étape par étape de la cellule de roulement 6, 7. Systèmes de séparation double caméra d&#39;émission sont capables de répondre à ces exigences pour l&#39;imagerie de cellules marquées avec des fluorophores multiples. Systèmes de séparation double caméra d&#39;émission répartis et canaux de fluorescence de filtre en deux caméras semblables à capturer simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores tout en conservant la totalité du champ de vue. Cette technologie permet la comparaison directe de l&#39;image capturée en temps réel dans chaque canal et permet à l&#39;utilisateur de basculer rapidement entre les modèles d&#39;appareil photo avec différentes capacités d&#39;imagerie. Cette fonction est utile pour faire des ajustements aux paramètres de capture d&#39;image dans un appareil photo qui mieux permettre au système de capturefluorophores avec différentes intensités, durées de vie, et des coefficients d&#39;extinction 8. Couplée avec un logiciel d&#39;imagerie, des systèmes de séparation d&#39;émission de caméra double permet l&#39;enregistrement en temps réel en direct des dosages d&#39;imagerie des cellules dans les longueurs d&#39;onde multiples et peuvent améliorer les essais in vitro qui utilisent la fluorescence pour étudier le comportement des cellules.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Multi-color microscopie par immunofluorescence pour détecter des molécules spécifiques dans la membrane cellulaire peut être couplé avec des dosages en parallèle de la chambre d&#39;écoulement de la plaque pour étudier les mécanismes qui régissent l&#39;adhérence cellulaire dans des conditions d&#39;écoulement dynamique. Par exemple, les cellules cancéreuses marquées avec des fluorophores multiples peuvent être perfusées sur un substrat potentiellement réactifs pour modéliser les mécanismes de la métastase cancéreuse. Cependant, multi-canaux systèmes de caméras et appareils photo unique de couleur présentent des lacunes dans l&#39;acquisition d&#39;image pour analyse en temps réel des cellules vivantes. Pour surmonter ces limitations, nous avons utilisé un système de séparation des émissions de double caméra pour capturer simultanément en temps réel des séquences d&#39;images de cellules marquées par fluorescence dans la chambre d&#39;écoulement. Longueur d&#39;onde filtre des systèmes de séparation d&#39;émission de l&#39;appareil photo à double sens varie en deux caméras CCD monochrome, capturant ainsi simultanément deux images identiques mais spatialement spécifique fluorophores. Par la suite, psuedocolored images d&#39;un canal sont combinés en un seulen temps réel a fusionné la séquence qui peut révéler de multiples molécules cibles sur des cellules se déplaçant rapidement à travers une région d&#39;intérêt.

Un essai d&#39;adhérence à la chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles a été utilisé pour démontrer un système de fractionnement appareil d&#39;émission double qui a capturé simultanément en temps réel de séquences d&#39;images en deux voies d&#39;émission (figure 1). Le système de division de l&#39;émission de la caméra double détecté BT-20 cellules qui ont été marquées par fluorescence avec CD24 anti-humain et HECA-452 (détection des antigènes sialofucosylated) des antic...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Émissions des systèmes de séparation à double caméra pour deux couleurs microscopie à fluorescence générer en temps réel des séquences d&#39;images avec une résolution optique et temporelle exceptionnelle, une exigence de certains tests cellulaires en direct, y compris des essais parallèles chambre d&#39;écoulement de la plaque d&#39;adhérence. Lorsque le logiciel est utilisé pour fusionner des images de canaux d&#39;émission acquis simultanément, des séquences d&#39;images pseudocolored sont produites.

Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d&#39;émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l&#39;adhésion cellulaire

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K vues.  Ohio University.  Émissions des systèmes de séparation à double caméra pour deux couleurs microscopie à fluorescence générer en temps réel des séquences d'images avec une résolution optique et temporelle exceptionnelle, une exigence de certains tests cellulaires en direct, y compris des essais parallèles chambre d'écoulement de la plaque d'adhérence. Lorsque le logiciel est utilisé pour fusionner des images de canaux d'émission acquis simultanément, des s?...

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Recherche

Bio-ingénierie

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Une nouvelle plate-forme d&#39;étirement pour Applications dans cellulaire et tissulaire mécanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Électrotaxie l&#39;étude des cellules du cancer du poumon à l&#39;aide d&#39;un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

À main photoacoustique clinique, système d’imagerie pour l’imagerie animale petit Non invasif en temps réel

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

À Situ Microscopie pour la détermination en temps réel de la morphologie monocellulaire dans les bioprocessus

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...