MKK מודה הנדסה של בריטניה גופני מדעי המועצה למחקר (EPSRC) מדעי החיים תוכנית ממשק עבור אחוות אישי. אנו רוצים גם להודות מימון על ידי ביוטכנולוגיה של בריטניה מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC).

הפרוטוקולים של הכנת המדגם FLIM אינן שונות מאלה של מיקרוסקופיה עוצמת מבוסס confocal או רחב בתחום הקרינה. רכישת נתונים מלווה המשימה העיקרית של ניתוח נתונים, כלומר חילוץ חיים הקרינה מן הנתונים הגולמיים. פעם אלה התקבלו, פרשנות נתונים מסייעת לאמת או לזייף את השערות. 1. תאים מכתים עם רוטורים מולקולאריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות (10 מ&quot;ל) על ידי המסת כ 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל של צבע בכל המתאים הממס (מתנול למשל עבור BODIPY C-12) 6,7 באמצעות איזון מדויק פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים (סרטן מודל התא קו, הלה במקרה שלנו) להיות מוכתם גדלים על בצלחת עם multiwell התחתון coverslide עבור מיקרוסקופיה, באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO 2 עד ~ 80% confluent . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10-20 μl של פתרון המניות על התאים החיים הגדלים רב welאני צלחת (SmartSlide 50 הדגירה מיקרו המערכת, WaferGen) ב 4 מ&quot;ל של Opti-MEM בינוני (GIBCO) לכל צלחת 6 היטב היטב. זה יוצר ריכוז מיקרו טוחנת צבע היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את צלחת רב היטב באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO 2 עבור 10-45 דקות על מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת multiwell מן החממה ולשטוף את התאים 3-4 פעמים עם 4 ברור אופטית בינוני מ&quot;ל תרבית תאים (למשל Opti-MEM) להסיר צבע עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הצלחת multiwell לשלב את המיקרוסקופ ולהתחבר בקר טמפרטורה / 5% 2 CO כניסת הגז כנדרש, לקראת ההדמיה. </li></ol> 2. FLIM של הרוטורים ניאון מולקולריים בתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם על הבמה מיקרוסקופ ולקבל שידור ותמונה הקרינה לזהות תאים ניאון. תרשים סכמטי של הניסוי הגדרת מוצג איור. 1.Verify שמפיץ הקרינה במיקומים expected (למשל קרום התא, בציטופלסמה). להשיג ספקטרום פליטת הקרינה, ולוודא כי הוא זה של צבע או חלבון צפוי, במקרה זה את הספקטרום של הרוטור מולקולרית. כביקורת שלילית, התמונה המדגם הלא מוכתם ולוודא שזה לא לזרוח. למרות שלב זה אינו חיוני במיוחד עבור FLIM, זהו תרגול טוב בכלל עוזר כדי לוודא כי המדגם הוא מה שאתה חושב שזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור למצב FLIM - זה נעשה בקלות על ידי הזזת המראה מתוך נתיב קרן הקרינה זיהוי (&quot;גלאי חיצוני&quot; כפתור &quot;נתיב קרן ההגדרה&quot; פאנל על התוכנה TCS Leica SP2 רכישת השליטה). המסנן המתאים פליטת הקרינה כדי לחסום את כל האור מרגש להגיע הגלאי חייב להיות beampath גילוי הקרינה. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> באיור 1. הסדר ניסיוני עבור FLIM תחום בזמן באמצעות ACלייזר onfocal סריקת מיקרוסקופ. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המדגם ולבדוק, במחשב השליטה על רכישת FLIM, כי ספירת גלאי קצב (פס שחור שכותרתו CFD על תוכנת רכישת השליטה בקר &amp; Hickl SPC 830 עמוד) הוא לא יותר מ 1% של שיעור החזרה לייזר ( בר ירוק שכותרתו השליטה SYNC תוכנה הרכישה). אם כן, להפחית את עוצמת הלייזר עירור, למשל על ידי הצבת מסנן צפיפות ניטרלי בנתיב קרן הלייזר, כדי למנוע איסוף ערימת-up עקומות דעיכה מעוותות פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת התמונה FLIM, בדרך כלל 3-5 דקות, להפסיק סריקה ולשמור את הנתונים הגולמיים (נתונים 3D &quot;הקוביה&quot; המורכב מרחבית הקואורדינטות x ו-y, וזמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הנתונים הגולמיים של חבילת ריקבון הקרינה ניתוח התוכנה, למשל Tri-2 14 או תוכנה מסחרית, כדי להציג את התמונה עוצמת הקרינה. זה פשוט ריקבון הקרינה משולב, כלומר את השטח מתחת לעקומה ריקבון הקרינה, בכל אחדפיקסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פיקסל טיפוסי על ידי הצבת הסמן על זה, ובחן את הדעיכה של הקרינה פיקסל זה. אם ספירת השיא הוא מתחת 100, השתמש binning המרחבי של פיקסלים. ספירת הפיקסלים הסמוכים (3x3 או 5x5 למשל) יתווספו אל פיקסל המרכזי, כך מספר שיא גבוה יותר מתקבל שם. זה מספק דיוק סטטיסטי גבוה יותר עבור לשלב הבא. לחלופין, מדידת יכול לחזור לזמן הרכישה יותר (שלב 5). במשך 30 50 דקות, מספר שיא של כ 10 פעמים גבוה יותר (וספירת הכולל של הפורום) מתקבל, אבל זה הרבה יותר מדי זמן בזמן הרכישה עבור דגימות ביולוגיות רוב בגלל הסיכון של החדרת חפצים בשל התנועה המדגם, להיסחף מיקרוסקופ, phototoxicity ו photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פיקסל העולמי ערך הסף (שמעליו ריקבון ב פיקסל מותאם) ולהחיל התאמה אחת דעיכה מעריכית לתמונה. התוצאה מניב לכל החיים הקרינה עבור כל פיקסל מעל הסף, אשר מקודד אזצבע. כל פיקסל הוא בצבע עם תוצאה של התאמה, ומפה FLIM מתקבל. בדוק את מופחת צ&#39;י בריבוע ערכי פיקסלים שונים - סביב 1 (ועד 1.3) מצביע על התאמה טובה. בדוק את השאריות המתאימים, אשר יש שחולקו באופן אקראי סביב אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההיסטוגרמה הקרינה לכל החיים חלקות באיזו תדירות הקרינה חיים מסוימים המתרחשים בחיים לעומת הקרינה עצמה. התאם את טווח הצבעים כך הפצה החיים הקרינה נכנס לתוך טווח הצבעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא מתאים monoexponential להניב ערך צ&#39;י בריבוע של כ 1 (ועד 1.3), ויש סטייה שיטתית של שאריות את מאפס, מודל מתוחכם יותר נדרש. לדוגמה, נסה להתאים מודל מעריכי כפולה על דועך הקרינה, כדי להסביר את שתי סביבות שונות לחקור את עשויה להיות בו מתאים גם להניב מראש מעריכי לגורמים או משרעות אשר נותן אינדיקציה לכמות היחסית של צבע אחד מסבment זה או אחר. לחלופין, פונקציה מעריכית מתוח יכול להיות מתאים לחשבון להפצה של חיים פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוצאות עבור חיים הקרינה, מראש מעריכי גורמים, והיחס לכל החיים ויחס מראש מעריכי גורם עבור כל פיקסל אז יכול להיות מקודד בצבע. כל פיקסל הוא בצבע בהתאם לערך שלה, לעומת זאת בגלל הקרינה, חיים מראש מעריכי גורמים יחסים שלהם מתקבלת. שוב, בדוק את מופחת צ&#39;י בריבוע ערכים (אשר יכול גם להיות מקודד בצבע ומוצג כתמונה) - כ 1 (ועד 1.3) מצביע על התאמה טובה. בדוק את השאריות, אשר יש שחולקו באופן אקראי סביב אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היסטוגרמות לכל החיים הקרינה צריך ללוות את כל התמונות להדמיה קלה של ממוצע ערכי הקרינה לכל החיים, וחלוקת החיים פלואורסצנטי. </li></ol> 3. נציג תוצאות דועך הקרינה נמדדהרוטור מולקולרי פלואורסצנטי להגדיל את צמיגות ב מתנול / גליצרול תערובות מוצגים בתרשים. 2. את דועך הם הקרינה monoexponential, ואת החיים הקרינה משתנה במידה ניכרת כפונקציה של צמיגות. זה מגביר את מרחבי 300 PS ב מתנול (צמיגות 0.6 CP) כדי ns 3.4 ב גליצרול 95% (950 CP צמיגות). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> באיור 2. דעיכה פרופילים הקרינה עבור BODIPY-C 12 מתנול / גליצרול תערובות של צמיגות משתנה. 6 העלילה כיול לוגריתמי של פעם בחיים הקרינה τ לעומת הצמיגות η עבור רוטור מולקולרי פלואורסצנטי מוצג איור. 3. זה קו ישר כפי שנדרש על ידי המשוואה פורסטר הופמן 9 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> כאשר k הוא 0 radiativ<html> שיעור דואר מתמיד, ו-Z ו-X הם קבועים, עם 0 &lt;x &lt;1. אם ניקח את הלוגריתם על שני הצדדים תשואות <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> כאשר x הוא שיפוע של קו ישר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> איור 3. העלילה של צמיגות הקרינה יומן החיים לעומת יומן של BODIPY-C 12 התשואות קו ישר לפי המשוואה פורסטר, הופמן 6. לאחר דגירה של תאים חיים עם הרוטור מולקולרי פלואורסצנטי הפצה צבע punctate הוא ציין את התמונות פלואורסצנטי. תמונות FLIM של תאים הלה מודגרות עם צבע BODIPY טווינה, להחליף מוצגים בתרשים. 4. דועך את הקרינה של כל פיקסל של התמונה יכול להיות מצויד כראוי באמצעות מודל יחיד דעיכה מעריכית. &gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig4.jpg" /> איור 4. (א) עוצמת פלואורסצנציה (ב) תמונות FLIM של תאים הלה מוכתמים BODIPY-C 12. החיובי, באזורים לפסק התערוכה חיים קצר יותר מאשר באזורים אחרים. זה liftime קצר יותר מתאים צמיגות נמוכה יותר puncta, טיפות השומנים ככל הנראה, על פי המשוואה פורסטר, הופמן. עד זומם את חיים המופקים כל פיקסל, נקבל היסטוגרמה לכל החיים הקרינה של התמונה כולה, כפי שמוצג באיור. 5. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> איור 5. Histograms של חיים הקרינה מתמונות FLIM של תאים הלה מוכתמים טווינה, שייצגו רוטורים מולקולאריים BODIPY.

<ol>
	<li>Luby-Phelps, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+and+physical+properties+of+cytoplasm:+Volume,+viscosity.+diffusion,+intracellular+surface+area.">Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area.</a> International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).</li><li>Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+as+a+CAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels.">CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269, 847-850 (1995).</li><li>Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+reduced+red+blood+cell+deformability+in+severe+falciparum+malaria.">Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).</li><li>Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).</li><li>Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-sensitive+behavior+of+fluorescent+molecular+rotors.">Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors.</a> J. Biol. Eng. 4, (2010).</li><li>Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Rotor+Measures+Viscosity+of+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).</li><li>Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Bound+Molecular+Rotors+Measure+Viscosity+in+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).</li><li>Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Sol-to-Gel+Transitions+via+Fluorescence+Lifetime+Determination+Using+Viscosity+Sensitive+Fluorescent+Probes.">Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes.</a> J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).</li><li>Förster, T., Hoffmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit+der+Fluoreszenzquantenausbeuten+einiger+Farbstoffsysteme.">Die Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme.</a> Zeitschrift f&#252;r Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).</li><li>vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+and+Their+Remedies+in+Time-Resolved+Fluorescence+Spectroscopy+and+Microscopy.">Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy.</a> J. Fluores. 15, 377-413 (2005).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).</li><li>O'Connor, D. V., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-correlated single-photon counting. , (1984).</li><li>Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

FLIM מציע כמה יתרונות מרכזיים על פני הדמיה עוצמה המבוסס על הקרינה. הוא יכול לדווח על אירועים photophysical שקשה או בלתי אפשרי לשמור על ידי הדמיה עוצמת הקרינה, כי זה יכול להפריד ביניהם מתופעות ריכוז fluorophore. תכונה זו שימושית במיוחד עבור מיפוי צמיגות תאיים על ידי רוטורים הדמיה מולקולרית ניאון. החיים הקרינה יכול בקלות להפוך צמיגות באמצעות גרף הכיול, כפי שמוצג באיור. 3, ללא תלות בריכוז של רוטורים מולקולאריים ניאון. ב FLIM ייתכנו ממצאים עלול לסבך פרשנות הנתונים. 10 פריטים אינסטרומנטלי כולל אור מפוזר אשר יופיע בתור שיא על גבי תחילת הדעיכה הקרינה ועלול לבלבל עם זמן דעיכה קצר, או שיא קטן אחרי IRF, אשר עלולה להיגרם על ידי השתקפויות בתוך המיקרוסקופ. כלים אלו אור מפוזר ניתן לזהות ככזהכי הם יכולים להבחין באפליה רפאים - הם תמיד באורך גל זהה לזה של אור מרגש. לזכור באוויר, אור נוסע 30 ס&quot;מ ב 1 שבריר שנייה מסייע לאתר את מקורו של השתקפויות. מסנן הקרינה או זכוכית יכול גם לגרום חפץ, בעיקר מדגם הקרינה נמוכה, אבל זה יכול בקלות להיות מזוהה על ידי לקיחת דגימה ללא מדידה: אם ריקבון מתקבל בנסיבות אלה, בשל מכשיר ואין לו מה לעשות עם מדגם! לעומת זאת, לציין כי autofluorescence מדגם עשוי גם לתרום ריקבון פלואורסצנטי. בספירת הזמן בקורלציה פוטון יחיד (TCSPC), ממיר את זמן היציאה משרעת (TAC) שאינם linearities עלול לגרום התקפי עניים, אבל ניתן לזהות על ידי חסימת עירור ומבריק אור הסביבה, למשל ממקור האור המועבר על מדגם ומדידת העיתוי. הרקע צריך להיות קבועהושגו כל פיקסל של התמונה. באזורים בהם חריגות רקע קבוע להתרחש, לא תניב בכושר טוב, יש להימנע למדידת אם לא ניתן למנוע על ידי התאמת הפרמטרים של כרטיס TCSPC. אחד החפץ לשמצה TCSPC הוא פוטון ערימת-up אשר נגרמת על ידי שיעור גילוי גבוה מדי פוטון. 11,12 זה מוביל פוטון רק 1 בזמן, תוך התעלמות כל הפוטונים הבאים בגלל האלקטרוניקה הם העיתוי עסוק ועיבוד פוטון 1. עורמים מוקפצים מוביל קיצור של פעם בחיים הקרינה, והדרך הטובה ביותר למנוע זאת היא לשמור על קצב הספירה פוטון ב 1% סביב שער החזרה לייזר. השקפה ישנם יישומים שונים של FLIM, וכן, בהתאם ליישום, כל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות. 13 מיקרוסקופ פלואורסצנטי האידיאלי היה לרכוש את כל ממדי הקרינה emissioקווי המתאר של n, עמדה עוצמת הגל, חייו ואת הקיטוב במדידה אחת, עם רגישות פוטון יחיד, רזולוציה מרחבית מקסימלית בזמן רכישת מינימום. אין כיום שום טכנולוגיה עם שילוב ייחודי זה של תכונות, ולבנות 1 עדיין מהווה אתגר עבור מפתחים מכשור. יישום של טכניקות פיזיות חדשים לבעיות חשובות בביולוגיה של התא היא לעתים קרובות הדרך תגליות בלתי צפויות, ויש עוד דרך ארוכה לעבור לפני שאנחנו קרובים להרוות את היכולות של דימות פלואורסצנטי של ביולוגיה של התא. אכן, הדמיה פרמטרים הקרינה כמו בחיים, קשת ואת הקיטוב, כמו גם הדמיה מהר יותר ב-3D ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר, בטוחים כדי לחשוף היבטים חדשים בביולוגיה של התא.

לדוגמא עם רוטורים מולקולאריים ניאון חומרה: הפוך הלייקה TCS SP2 confocal מיקרוסקופ סריקה קוהירנט מירה 900 Ti: לייזר ספיר femtosecond עם V6 ורדי משאבה לייזר או Hamamatsu PLP-10 470 פעמו picosecond דיודת לייזר מקורות עירור בקר &amp; Hickl SPC 830 עמוד ב 3GHz, Pentium IV, 1GB RAM במחשב עם Windows XP ראש מקורר בקר &amp; Hickl PMC100-01 גלאי המבוסס על Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, רכוב על הנמל של מיקרוסקופ X1, או גלאי היברידית DCC 100 שליטת גלאי מודול תוכנה: Tri-2 או 14 SPCImage 2.8 ידי בקר &amp; Hickl

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

דיפוזיה הוא לעתים קרובות צעד חשוב בקביעת שיעור-בתגובות כימיות או תהליכים ביולוגיים משחק תפקיד במגוון רחב של אירועים תאיים. צמיגות היא אחד הפרמטרים העיקריים המשפיעים על דיפוזיה של מולקולות וחלבונים, ושינויים צמיגות נקשרו מחלות תקלה ברמה התאית. 1-3 בעוד שיטות כדי למדוד את הצמיגות בתפזורת מפותחים היטב, microviscosity הדמיה עדיין מהווה אתגר . מפות הצמיגות של עצמים מיקרוסקופיים, כגון תאים בודדים, יש עד לאחרונה קשה להשיג. צמיגות עם טכניקות מיפוי הקרינה יש יתרון משום, בדומה שיטות אופטיות אחרות, פולשנית, בלתי הרסניות והוא יכול להיות מיושם על תאים חיים ורקמות. רוטורים מולקולאריים פלורסנט התערוכה חיים הקרינה ותשואות הקוונטים שהם פונקציה של הצמיגות של microenvironment שלהם. פיתול Intramolecular 4,5 אוסיבוב מוביל ריקבון לא מקרינים מאחור המדינה מתרגשת למצב בשטח. הסביבה צמיג מאט זה סיבוב או פיתול, הגבלת הגישה מסלול לא מקרינים את זה ריקבון. זה מוביל לעלייה בתשואה הקוונטים הקרינה ואת החיים פלואורסצנטי. דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) שונה של צבעים BODIPY הידרופובי אשר פועלים רוטורים מולקולאריים ניאון מראים כי החיים הקרינה של בדיקות אלה הוא פונקציה של microviscosity של סביבתם. 6-8 העלילה לוגריתמי של פעם בחיים הקרינה לעומת התשואות צמיגות ממס קו ישר, כי מציית המשוואה הופמן פורסטר. 9 עלילה זו משמשת גם גרף כיול להמיר בחיים הקרינה לתוך צמיגות. לאחר דגירה של תאים חיים עם רוטור שונה BODIPY ניאון מולקולרית, הפצה צבע punctate הוא ציין את התמונות פלואורסצנטי. ערך צמיגות המתקבלות הדואר puncta בתאים חיים הוא כ 100 פעמים גבוה יותר מזה של מים בציטופלסמה של התא. 6,7 זמן נפתרה מדידות הקרינה אנאיזוטרופיה להניב פעמים מתאם הסיבוב בקנה אחד עם ערכים אלו microviscosity גדולים. מיפוי החיים הקרינה אינה תלויה בעוצמת הקרינה, ובכך מאפשר הפרדת ריכוז בדיקה ואפקטים צמיגות. לסיכום, פיתחנו גישה מעשית צדדי למפות microviscosity בתאים מבוסס על FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells at JoVE.com

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) התפתחה הטכניקה מפתח לתמונה הסביבה ואינטראקציה של חלבונים ספציפיים צבעים בתאים חיים. FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון מאפשר מיפוי של צמיגות בתאים חיים.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

fluorescence-lifetime-imaging-of-molecular-rotors-in-living-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.8K Views.  King's College London. דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) התפתחה הטכניקה מפתח לתמונה הסביבה ואינטראקציה של חלבונים ספציפיים צבעים בתאים חיים. FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון מאפשר מיפוי של צמיגות בתאים חיים.

Video: Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

פרוטוקול הזרקת ליפידיקו למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...