המחברים מודים וייק פורסט המכון לרפואת רגנרטיבית לעזרתם עם פיתוח של פרוטוקול זה. אנו מכירים תמיכה על ידי תרומות של הצדקה רחוב גרייט אורמונד בבית החולים, הקרן Eugenio Litta (ז&#39;נבה, שוויץ), המועצה למחקר הרפואי, מכללת מנתחים המלכותית של אנגליה, הצדקה הרפואית של ניצוצות הילדים, משרד החוץ הבריטי לבריטניה / ארה&quot;ב גזע פרס שיתוף פעולה נייד וקרן המחקר למיטאל. כמו כן, אנו רוצים להודות לקרן החברה המלכותית / וולפסון למענק שיפוץ מעבדת הנדסת רקמות שהתקבל למחלקה לכירורגיית הילדים במכון לבריאות ילד. PDC ו SE נתמך על ידי הצדקה של רחוב אורמונד בית החולים לילדים הגדולים.

1. בידוד של עכברוש מעי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 ליטר של בופר פוספט (Sigma, בריטניה) עם 1% אנטיביוטיקה / antimycotic (Sigma, בריטניה) (PBS / AA). להתאים את משאבת peristaltic (מהירות משתנה L Masterflex / S) עם שני צינורות. הפעל 70% אתנול (EtOH) דרך הצינורות של משאבת peristaltic ל15 דקות במהירות המרבית, ואחריו PBS / AA לעוד דקות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדות ספראג-Dawley בוגרת במשקל של כ 250-350 גר &#39;על ידי CO 2 שאיפה ונקע בצוואר הרחם על פי הנחיות מקומיות של בעלי חיים ואישורים (בבריטניה, הנחיות משרד פנים תחת בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מכשירי הניתוח לפני השימוש. ספריי ולנגב את הבטן של החיה באמצעות EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך laparotomic xifo-ערווה על הבטן כדי להבטיח שדה ניתוחי ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסחת את המעי הדק בצד ימין של החיה על מגבת נייר ריססה עם EtOH 70%. Takטיפול בדואר להרטיב ברציפות המעי עם PBS / AA כדי למנוע התייבשות של הרקמות וdenaturation של מטריקס תאי (ECM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את עורק mesenteric מעולה (SMA), שנובע בזווית של ° 90 מאב העורקים לכיוון המעי. השתמש בצינורית G 27 להיכנס SMA מאב העורקים ובמהירות למשוך את המחט כדי למנוע את קריעת הקיר של כלי השיט. לקדם את צינור הפלסטיק של הצינורית לתוך SMA ומאובטח באמצעות תפרים (Vicryl 5/0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר cannulation על ידי הזרקת 1 מיליליטר של PBS / AA. השתמש במספריים באביב כדי לחתוך הפרוקסימלי אב העורקים ודיסטלי SMA כדי לשחרר את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע דליפה של צואה כאשר לנתח את המעי גס, במקום אחד (משי 5/0) קשר תפר בקצה הפרוקסימלי של צומת ileocaecal ואחד בקצה הדיסטלי של המעי הגס סיגמואיד. ואז לחתוך את מעי סופני ומעי גס בין שני קשרים ולהסיר את המעי גס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי בצומת jejuno-התריסריוןnd לשחרר את המעי מכל חיבורי רקמות חיבור זה יכול להיות עם הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המעי הדק בצלחת פטרי עם PBS / AA. Cannulate הקטע הפרוקסימלי של המעי עם טפטפת פלסטיק פסטר (מתכלה המעבדה LSL) ולאבטח אותו במקום עם תפרים. חותכים את פיפטה כך שהוא יתאים Luer-לוק של מזרק 60 מיליליטר (BD Plastipak). סומק לומן המעיים 2X עם 60 מיליליטר של PBS / AA להסיר את הצואה ופסולת. </li></ol> 2. מתודולוגיה Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינורית כלי הדם לברזלי שלוש דרך. זה יקל טיפול, לצמצם את המתח על העץ בכלי הדם ומאפשר הסרת בועות מהצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מים זורמים deionized (18.2 MΩ / סנטימטר התנגדות) באמצעות משאבת ההרים מהירות משתנה L Masterflex / S ב0.6 מיליליטר / שעה. ודא שאין בועות נמצאות בתוך צינורות לפני חיבור עם ברזלים חלל מעי. בועות מסוימות עשויות להיות נוכחת בתוך לומן מצעד1.9, אשר עלול לפגוע בתהליך decellularization. לשנות את המהירות של המשאבה ולטפל ברקמות עם מלקחיים בזהירות כדי להבטיח את יציאת בועות מהקצה הדיסטלי. אל תחבר את צינורית כלי הדם עד שתהליך זה יסתיים מאז מהירויות גבוהות עלולות לגרום נזק לעץ בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המכשיר לחדר הקר, שכן הצעד של decellularization הבא מתבצע ב 4 ° C. הטמפרטורה הנמוכה מאפשרת הסרת התאים תוך מזעור פירוק רקמות. מניחים את צלחת פטרי במכל שיאסוף את הפתרון שעלה על הגדות. תנקב שניהם חלל המעי והעץ בכלי הדם במי deionized (התנגדות 18.2 MΩ / סנטימטר) ל24 שעות ב0.6 מיליליטר / שעה. בשעה הראשונה לבדוק את המנגנון באופן קבוע על מנת להבטיח את כל החיבורים מאובטחים, דליפה היא מינימאלית ואין בועות נמצאות בתוך המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של טיפול במי deionized, להעביר מנגנון decellularization מחוץ לחדר הקר כמו שאר השלבים הםמתבצע בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל deoxycholate נתרן (Sigma, בריטניה) כדי להכין 300 מיליליטר של פתרון 4% במי deionized. שוקל deoxycholate נתרן מתחת למכסת מנוע יניקה, כפי שהוא גירוי אוראלי ועין. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. הפתרון עשוי להישמר על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את פתרון deionized לdeoxycholate נתרן, בדוק את החיבורים, להסיר כל בועות וינקבו ב0.6 מיליליטר / שעה במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף צעד deoxycholate נתרן עם PBS / AA ל30 דקות, כדי למנוע אינטראקציה בין deoxycholate נתרן וDNase-I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את deoxyribonuclease-I (DNase-I, Sigma) ולהכין 250 מיליליטר של פתרון 2,000 KU בנתרן כלורי 1 מ &#39;, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. פתרון זה חייב להיות מוכן מייד לפני השימוש ולא יכול להיות מאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנקב עם DNase-במשך 3 שעות ב RT במהירות של 0.6 מיליליטר / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות DNase-אני הצעד, להעביר אתפיגום לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה ולשנות צלחות ומכשירים. הוא הציע להשתמש בטכניקה מזוהמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS / AA ל30 דקות כדי להבטיח את כל השאריות של פתרונות decellularization יוסרו. הנח את הפיגום בצלחת פטרי חדשה ולהעביר לcrosslinker UV (Spectroline, ארה&quot;ב). להפעיל שני מחזורי עיקור. אחסן ב5% PBS / AA ולשנות את הפתרון כל 3 ימים. </li></ol>

<ol>
	<li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li><li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction:+an+observational+study.">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li><li>Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+transplantation+of+a+bioengineered+airway+tissue.">First human transplantation of a bioengineered airway tissue.</a> J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li><li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+a+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection.">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li><li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multicellular+Approach+Forms+a+Significant+Amount+of+Tissue-Engineered+Small+Intestine+in+the+Mouse.">A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li><li>Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+optimizes+the+formation+of+tissue-engineered+small+intestine.">VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine.</a> Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).</li><li>Chen, M. K., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+bowel+tissue+engineering+using+small+intestinal+submucosa+as+a+scaffold.">Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold.</a> J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).</li><li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+assessment+of+small+intestinal+submucosa+as+a+small+bowel+graft+in+a+rat+model.">Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model.</a> J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).</li><li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+evaluation+of+regenerated+small+bowel+by+small+intestinal+submucosa.">Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa.</a> J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).</li><li>Hori, Y., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+tissue+engineering+of+the+small+intestine+by+mesenchymal+stem+cell+seeding.">Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding.</a> J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).</li><li>Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+tissue-engineered+small+intestine.">Angiogenesis in tissue-engineered small intestine.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).</li><li>Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+matrices,+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method,+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells.">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).</li><li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , 1-8 (2010).</li><li>Uygun, B. E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+lung+engineering.">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).</li><li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration.">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li><li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הצעדים הקשים ביותר בהקמת ניסוי זה כרוך cannulation של SMA והקמה והתחזוקה של עקרות. Cannulating SMA במכרסמים ללא פקיעת הקיר יכול להיות די קשה בשל הגודל והמיקום של כלי השיט. לחלופין, תפר ניתן להציב סביב אב העורקים הפרוקסימלי לפני המוצא SMA, ואחריו cannulation של אב העורקים עצמו distally, בימוי צינורית הפלסטיק לתוך SMA. במהלך decellularization שילוב של מיקום צינורית עני וספיקות גבוהות עלול לגרום לאבד את הגישה של כלי הדם. עקרות היא בעיה רצינית עקב כמות של חי חיידקים הנמצאים במעי הדק. שטיפה עם PBS / AA הבאה קציר היא מאוד חשובה, וכל סימן של עניין או פסולת בצואה יש להסיר מלומן. הצבת חלק מהפיגום בצינור בז עם DMEM בחממה הבאה עיקור UV צריכה להיות אינדיקטור אם עקרות הושגו. במקרההקולוניזציה חיידקים, התקשורת תשנה את ה-pH עם הצבע שלו הופך מאדום לצהוב. כדי להתמודד עם זה, מחזורי UV נוספים מומלץ וכן כביסה עם PBS המכיל ריכוז גבוה של האנטיביוטיקה / antimycotic. שינוי להסיג לך פיגום עם גישת שני כלי דם וורידים יהיה cannulate נחות הווריד הנבוב (IVC), כמו גם מחברת SMA. Decellularization מצדדי ורידים וכלי דם צריך להיות ניסיון לסירוגין במשך כל שלושת הפתרונות. decellularization המתמשך עלול להתפוצץ נימי הדם על ידי שיש לחץ חיובי על שני הצדדים. במהלך השנים היו מספר ניסיונות במעיים TE באמצעות שילובי תא פיגום שונים במבחנה in vivo 6,9,12. רוב העבודה שבוצע באמצעות פיגומי PLGA צינורי 95%% PGA-5 לא ארוגים מצופים בסוג אני 6,7,13,22 קולגן. הזריעה הבאה עם מעייםיחידות אפיתל organoid (יחידות ארגוניות) ותקופה של השתלה לתוך omentum של עכברים, הם יוצרים ציסטות בשרירים בצד החיצוני והאפיתל בחלק הפנימי אשר לאחר מכן ניתן tubularized. עם זאת, הנקבוביות והפשטות בעיצוב של פיגומים אלה אינם מאפשרים לדור של חתיכות גדולות של מעי מלאכותי בסביבה במבחנה כמו זו של bioreactor. בנוסף, המחסור ברשת כלי דם מולדת שיכול להיות מחוברת לנמען נוסף מגבילה את השימוש בפיגום הזה לתרגום קליני. חוץ מהניסויים עם פיגומי PGA-PLGA, קבוצות אחרות השתמשו בפיגומי קולגן או SIS, אשר שניהם לא לשכפל את המורכבות של מערכת העיכול. SIS בפרט הוא המתודולוגיה שפורסמה קודמת רק של הנדסת רקמות מעיים וכבר בשימוש בלמעלה מ 150 הגדרות רפואיות, הממחיש את יכולתה של פיגומי decellularized לספק יציבות מכאנית ולקדם את צמיחת תאים תוך הובלהing לשום תגובת immunogenic. עם זאת, חוסר ארכיטקטורת מיקרו מקרו ומתאים, הוביל לתוצאות גרועות בשימוש בו &quot;למטרות TE מעיים 9-11,23. היתרונות של מתודולוגיה decellularization שתארנו כוללים את שימור מאפיינים מיקרוסקופיים כגון ארכיטקטורת קריפטה-סיסי luminal המייצגים את הסביבה מתאימה לאכלוס על ידי הנישה תאי גזע במעי. בהיבט מאקרוסקופי, הנוכחות של רשת כלי דם היררכית תאפשר קובץ מצורף לנמען, המאפשרת מתן חומרי מזון וחמצן לכל השכבה של TE-המעי 21. מה הוא יותר, התחזוקה של רכיבי ECM כגון קולגן, אלסטין וglyocosaminoglycans יש תפקיד חשוב לא רק למאפיינים מכאניים, אלא גם מכוונים את הריבוי והתמיינות תאיים. והכי חשוב, את היכולת של המתודולוגיה decellularization להיות מדורגת עד לגדולרקמות r תוך שמירה על אותם המאפיינים היא תכונה חשובה לתרגום קליני של TE. הפיתוח של מטריקס מעיים טבעי עם רשת כלי דם מאפשר יצירה של מגזרים גדולים יותר של מעי מלאכותי שיכול להיות מחובר למחשב המארח.

הנדסת רקמות (TE) מספקת אלטרנטיבה טיפולית להשתלת איברים, תוך עקיפת סוגיות של דיכוי חיסוני ומחסור באיברים. TE היה לאחרונה יישומים מוצלחים במרפאת, עם החלפה של איברים כגון שלפוחית ​​השתן 1, 2 שופכה ואת קנה הנשימה, הן במבוגרים 3,4 וילדים 5. בניית איבר רקמות מהונדסות מחייבת שילוב של פיגום עם התאים המתאימים. פיגום ניתן להכין באמצעות טבעית הנגזר (למשל קולגן) ו( חומצה למשל פולי-L-גליקולית; PLGA) סינתטית חומרים, או להשיג על ידי decellularization של איברים ורקמות מקומיים. פיגומים שהיו בשימוש עד כה לTE מעיים היו בעיקר שני decellularized (submucosa מעי הדק) או סינטטי (חומצת פולי-L-גליקולית וחומצה לקטית פולי) 6-13. חומרים ביולוגיים אלה הם פשוטים מאוד בשתי ארכיטקטורת מיקרו מקרו ו, אשרלא יכול להיות אידיאלי אם מעי רקמות מהונדסות הוא להיות מתורגם מבחינה קלינית. ביולוגי אופטימלית למעי צריך עץ בכלי דם מולדת שיכול להיות מחובר לאספקה ​​של מארח דם, קיר צינורי שכבתי עם מאפיינים שונים על מנת לשקף את שכבות דופן המעי וציר סיסי-קריפטה בצד luminal כדי לסייע עם אכלוס על ידי תאי גזע אפיתל. Decellularization הוא מתודולוגיה חדשנית שמייצרת פיגומים על ידי הסרת תאים מאיברים שלמים תוך שמירה על הארכיטקטורה המקורית שלהם 14. זה עדיף על קיים כבר פיגומים שכן הם לא רק לשכפל את המבנה של האיבר אבל גם מכילים אותות כימיים המוטבעים בתוך המטריצה ​​תאית (ECM) שהתרבות תאי סיוע ובידול. בשנת 2008 קנה הנשימה מגופות היה decellularized 14, נזרע עם תאים של החולה עצמו, ומושתל להחליף את הסמפונות השמאל העיקרית בבחור צעיר <sup&gt; 3. מאז, מספר הקבוצות דיווחו הייצור של פיגומי decellularized ללב 15, הכבד 16,17, וריאות 18-20 בבעלי חיים קטנים וגדולים. יש לנו גם להתאים אותן השיטות כדי לייצר פיגום decellularized מעי דק 21. המטרה של השיטה המתוארת במסמך זה היא לייצר מטריצות מעיים decellularized, כי לשמור על המאפיינים מקרוסקופית של רקמה המקורית כגון אספקת הדם, כמו גם את הארכיטקטורה המיקרוסקופית של הציר סיסי-קריפטה בחלל המעי. אנו מאמינים במתודולוגיה זו סופו של דבר יכולה להיות מאומץ על איברים אחרים כדי לשפר את היעילות של decellularization.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

הנדסת רקמות מוצלחת כרוכה בשילוב של פיגומים עם תאים מתאימים במבחנה או in vivo. פיגומים עשויים להיות סינטטיים, באופן טבעי, שהופק או שמקורם ברקמות / איברים. האחרון מתקבלים באמצעות טכניקה המכונה decellularization. Decellularization עשוי להיות כרוך בשילוב של פיזי, כימי, ושיטות האנזימטית. המטרה של טכניקה זו היא להסיר את כל העקבות הסלולריות תוך שמירה על ארכיטקטורת מיקרו מקרו ושל הרקמה המקורית. הנדסת רקמות מעיים עד כה השתמשה בפיגומים פשוטים יחסית שלא ישכפל את הארכיטקטורה המורכבת של האיברים הילידים. המוקד של מאמר זה הוא לתאר טכניקת decellularization יעילה למעי דק חולדה. הבידוד של המעי דק, כדי להבטיח השמירה על חיבור של כלי דם מתואר. השילוב של פתרונות כימיים והאנזימטית כדי להסיר את תאי whilst שימור הציר סיסי-קריפטה בהיבט luminal של הפיגום הוא גם יצא לדרך. לבסוף, הערכה של פיגומים הופקו עבור מאפיינים המתאימים לדיון.

על decellularization המוצלח (איור 1), הפיגום צריך להיות מראה מאקרוסקופי דומה לזה של המעי המקומי, אבל עם (איור 2 א) קירות שקופים. שימור המאקרו הארכיטקטורה צריך להיות גם לידי ביטוי על ידי patency של העץ בכלי הדם. כאשר הצבע מוזרק דרך צינורית SMA, יש לפזר באופן אחיד לאורך כל הפיגום ולהגיע לעץ הנימים (איור 2). הפיגום צריך להיות חופשי של חומר גרעיני וcytoplasmic, משהו שניתן להעריך באמצעות ערכת כימות DNA וניתוח היסטולוגית פשוט. Hematoxylin ומכתים eosin (H &amp; E) צריכה להוכיח היעדר חומר גרעיני וcytoplasmic תוך שמירה על שכבות המעי הדקות (איור 3 א). בפרט, התחזוקה של villi ומאורות בצד luminal צריכה להיות ברורה הבאה מיקרוסקופיית אלקטרונים (איור 4).גם שימור של רכיבי מטריצה ​​תאיים כגון קולגן, אלסטין וglycosaminoglycans צריך להיות צפוי. לדוגמא, רקמת חיבור ללא פגע מציג מכתים Trichrome של האסון בפיגום (איור 3 ב). <img alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. . תכנית ניסיונית ציר זמן של הליך decellularization; PBS / א.א.: פוספט שנאגרו מלוח עם NaDeoxy האנטיביוטיקה antimycotic,: deoxycholate נתרן, RT: טמפרטורת חדר, DNAse-I: deoxyribonuclease-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. macroscopi פיגוםג מאפיינים. מראה מקרוסקופית של המעי הדק העכברוש הבא decellularization המוצלח (). הזרקה של רוסו Ponceau לצבוע באמצעות SMA מדגימה רשת שלמה של כלי דם (B); SMA: עורק mesenteric מעולה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> איור 3. . היסטולוגיה H &amp; E () ומכתים MT (ב &#39;) מצביעים על העדרו של חומר תאי עם שימור ארכיטקטורת רקמת חיבור; H &amp; E: hematoxylin ו eosin, MT: Trichrome של מייסון. בר סולם:. 100 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> </p&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> איור 4. . מיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה מציין את הארכיטקטורה סיסי-קריפטה השתמרה בלומן הפיגום; בר סולם:. 100 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix at JoVE.com

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

המאמר מתאר מתודולוגיה לייצור מטריצת acellular ממעי חולדה. הגזירה של פיגומי מעיים חשובה ליישומים עתידיים בתחום הנדסת רקמות, ביולוגיה של תאי גזע ובדיקות סמים.

Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

a-decellularization-methodology-for-production-natural-acellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K Views.  University College London.  המאמר מתאר מתודולוגיה לייצור מטריצת acellular ממעי חולדה. הגזירה של פיגומי מעיים חשובה ליישומים עתידיים בתחום הנדסת רקמות, ביולוגיה של תאי גזע ובדיקות סמים. 

Video: A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularization ומתודולוגיה Recellularization עבור האדם הורידים saphenous גדולות

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

בידוד, Decellularization פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי כל חזירי

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

ייצור של ננו-טיפות דקפלואורובוטן מסוננות פאמברנה ממיקרו-טבלים מעוצבים מראש

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

תסיסה מבוקרת אור לייצור כימיקלים וחלבון מיקרוביאליים

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

התקנת התקן מיקרופלואידי לייצור תקע קומבינטורי

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

מחבר זרקור: שילוב גישות חישוביות וניסוייות באונקולוגיה מדויקת

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי לייצור תקע קומבינטורי

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...