Os autores agradecem ao Instituto Wake Forest de Medicina Regenerativa por sua ajuda com o desenvolvimento deste protocolo. Reconhecemos o apoio por doações da caridade Great Ormond Street Hospital, a Fundação Eugenio Litta (Genebra, Suíça), o Conselho de Pesquisa Médica, o Colégio Real de Cirurgiões da Inglaterra, as faíscas Infantil Medical Caridade, o Ministério do Exterior britânico para o Reino Unido / EUA Stem Cell Collaboration Award e ao Fundo de Investigação Mittal. Gostaríamos também de agradecer à Fundação Royal Society / Wolfson para a engenharia de tecidos concessão remodelação laboratório obtidos para o Departamento de Cirurgia Pediátrica do Instituto de Saúde da Criança. PDC e SE são suportados por caridade o Great Ormond Street Hospital da Criança.

1. Isolamento de Rato Intestino <ol><li> Prepara-se uma solução de 1 L de salina tamponada com fosfato (Sigma, Reino Unido) com 1% de antibiótico / antimicótico (Sigma, Reino Unido) (PBS / AA). Coloque a bomba peristáltica (velocidade variável Masterflex L / S) com dois tubos. Executar etanol a 70% (EtOH), através dos tubos da bomba peristáltica durante 15 minutos à velocidade máxima, seguido de PBS / AA por mais 15 min. </li><li> Eutanásia adultos ratos Sprague-Dawley pesando aproximadamente 250-350 g por inalação de CO 2 e deslocamento cervical, de acordo com as diretrizes locais de origem animal e aprovações (no Reino Unido, as orientações do Ministério do Interior sob os Animais (Scientific Procedures) Act 1986). </li><li> Autoclave os instrumentos cirúrgicos antes de usar. Spray e limpe o abdômen do animal usando etanol 70%. </li><li> Realizar uma incisão laparotômica xifo-púbica no abdômen para garantir um campo cirúrgico claro. </li><li> Eviscerar do intestino delgado, no lado direito do animal sobre uma toalha de papel pulverizado com 70% de EtOH. Take cuidado para molhar continuamente o intestino com PBS / AA, de modo a evitar a desidratação do tecido e a desnaturação da matriz extracelular (ECM). </li><li> Localizar a artéria mesentérica superior (SMA) provenientes de um ângulo de 90 ° a partir da aorta para o intestino. Usar um G cânula 27 para entrar no SMA da aorta e rapidamente retirar a agulha para evitar rasgar a parede do vaso. Avançar o tubo plástico da cânula para a SMA e segura usando suturas (Vicryl 5/0). </li><li> Confirme punção, injetando 1 ml de PBS / AA. Use uma tesoura de mola para o inciso proximal aorta e distal à SMA, de modo a liberar a cânula. </li><li> Para evitar a fuga das fezes quando dissecando o intestino grosso, coloque um (seda 5/0) nó de sutura na extremidade proximal da junção ileocecal e uma na extremidade distai do cólon sigmóide. Em seguida, retira o íleo terminal e dois pontos entre as duas cabeças e remover o intestino grosso. </li><li> Cortar o intestino no jejuno-duodenal junção umaª liberar o intestino de qualquer conexão do tecido conjuntivo que pode ter com o abdômen. </li><li> Transferir o intestino delgado em uma placa de Petri com PBS / AA. Canular seção proximal do intestino com uma pipeta Pasteur de plástico (LSL Laboratório de consumíveis) e fixá-lo no lugar com suturas. Corte a pipeta por isso vai caber a Luer-Lok de uma seringa de 60 ml (BD Plastipak). Lave o lúmen intestinal 2x com 60 ml de PBS / AA para remover fezes e detritos. </li></ol> 2. Metodologia Decelularização <ol><li> Conecte a cânula vascular a um torneira de três vias. Isto irá facilitar o manuseamento, a minimizar a tensão sobre a árvore vascular e permitir a remoção de bolhas a partir da tubagem. </li><li> Comece a correr água deionizada (resistividade 18,2 mohms / cm) através da bomba de roletes de velocidade variável Masterflex L / S de 0,6 ml / h. Garantir que não haja bolhas de ar dentro do tubo antes de se conectar com a torneira lúmen intestinal. Algumas bolhas podem estar presentes dentro do lúmen do passo1.9, o que pode prejudicar o processo de decelularização. Variar a velocidade da bomba e manipular o tecido com uma pinça com cuidado para garantir que a saída de bolhas a partir da extremidade distal. Não conecte a cânula vascular até que esse processo for concluído, uma vez altas velocidades pode danificar a árvore vascular. </li><li> Transferir para o aparelho de câmara fria, uma vez que o passo seguinte de descelularização é realizada a 4 ° C. A baixa temperatura permite a remoção de células, minimizando a decomposição do tecido. Coloque a placa de Petri em um recipiente que irá recolher a solução transbordante. Perfundir ambos os lúmen intestinal e a árvore vascular com água deionizada (resistividade 18,2 mohms / cm) durante 24 horas a 0,6 ml / h. Para conferir a primeira hora o aparelho regularmente para garantir que todas as ligações são seguras, o vazamento é mínima e sem bolhas estão presentes no intestino. </li><li> Após 24 horas de tratamento com água deionizada, mova aparelho decellularization fora da sala fria, como o resto dos passos sãorealizada em temperatura ambiente (RT). </li><li> Pesar o desoxicolato de sódio (Sigma, Reino Unido) para preparar 300 ml de uma solução 4% em água desionizada. Pesar o desoxicolato de sódio, sob uma capa de sucção, uma vez que é um agente irritante oral e olho. Misturar utilizando um vortex até que a solução é límpida. A solução pode ser mantida a 4 ° C durante até 1 mês. </li><li> Altere a solução deionizada para desoxicolato de sódio, verifique as conexões, remover quaisquer bolhas e perfuse em 0,6 ml / h durante 4 h. </li><li> Seguindo o passo de lavagem com PBS, o desoxicolato de sódio / AA por 30 minutos para evitar a interacção entre o desoxicolato de sódio e de DNase I. </li><li> Pesar desoxirribonuclease-I (DNase I, Sigma) e preparar 250 ml de uma solução 2,000 kU em cloreto de sódio 1 M, pH 7,4. Misturar utilizando um vortex até que a solução é límpida. Esta solução deve ser preparado imediatamente antes da utilização e não pode ser armazenado. </li><li> Perfundir com ADNase-I, durante 3 horas à temperatura ambiente a uma velocidade de 0,6 ml / hr. </li><li> Seguindo o passo de DNase I, transferir oscaffold num capuz de cultura de tecidos e alteração placas ou instrumentos. Sugere-se usar uma técnica asséptica. </li><li> Lavar com PBS / AA por 30 min para assegurar que todos os restos das soluções decelularização são removidos. Coloque o andaime em uma nova placa de Petri e transferir para um Crosslinker UV (Spectroline, EUA). Execute dois ciclos de esterilização. Guarde em 5% PBS / AA e alterar a solução a cada 3 dias. </li></ol>

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Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li><li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+a+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection.">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li><li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. 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E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li><li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+lung+engineering.">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651 (2011).</li><li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration.">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li><li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As etapas mais difíceis na criação deste experimento envolve a punção da SMA e do estabelecimento e manutenção de esterilidade. Canulação da SMA em roedores sem romper a parede pode ser bastante difícil devido ao tamanho ea posição do navio. Alternativamente, um fio de sutura pode ser colocada ao redor da aorta proximal antes da origem SMA, seguido por canulação da própria aorta distais, dirigindo a cânula de plástico para a SMA. Durante decellularization uma combinação de colocação de cânula pobres e altas taxas de fluxo pode resultar na perda do acesso vascular. A esterilidade é um problema importante, devido à quantidade da flora bacteriana do intestino delgado. A lavagem com PBS / AA a seguir à colheita é muito importante, e qualquer sinal de matéria fecal ou restos deve ser removido a partir do lúmen. Colocar uma porção do andaime num tubo Falcon com DMEM na incubadora após a esterilização de UV deverá ser um indicador se esterilidade foi alcançado. No casode colonização bacteriana, a mídia vai mudar o pH com a sua cor passando de vermelho para amarelo. Para lidar com isto, ciclos adicionais de UV são aconselhados, bem como a lavagem com PBS, contendo uma elevada concentração de antibiótico / antimicótico. Uma modificação possível obter um andaime com acesso tanto vascular venoso e seria canular a veia cava inferior (IVC), bem como a SMA. Decelularização dos lados venosos e vasculares deve ser tentada de forma intermitente para as três soluções. Decellularization contínua pode estourar os vasos capilares fazendo com que a pressão positiva em ambos os lados. Ao longo dos anos, tem havido uma série de esforços no intestinal TE usando diferentes combinações de células-andaime in vitro e in vivo 6,9,12. A maioria dos trabalhos foi realizada utilizando tubulares não tecido 95% PGA-5% PLGA andaimes revestidos com colágeno tipo I 6,7,13,22. Após a sementeira com intestinalunidades epiteliais organóide (OU) e um período de implantação no omento de ratinhos, que formam cistos com músculo do lado de fora e do epitélio por dentro, que pode então ser tubulares. No entanto, a porosidade e a simplicidade na concepção destas estruturas não permite a geração de grandes pedaços de intestino artificial, em um ambiente in vitro, tais como a de um bio-reactor. Além disso, a falta de uma rede vascular inata, que pode ser conectado ao recipiente limita ainda mais o uso de este andaime para tradução clínica. Além dos experimentos com os andaimes PGA-PLGA, outros grupos têm usado de colágeno ou SIS andaimes, sendo que ambos não replicar a complexidade do trato intestinal. SIS em particular, é a única metodologia publicada anterior de engenharia de tecido intestinal e tem sido usado em mais de 150 ambientes médicos, demonstrando a capacidade de andaimes descelularizados para proporcionar estabilidade mecânica e promover o crescimento celular, enquanto chumboção de resposta imunogênica. No entanto, a falta de macro-e micro-arquitetura apropriada, levou a resultados ruins em sua &quot;utilização para fins TE intestinais 9-11,23. Os benefícios da metodologia de descelularização temos descritos incluem a preservação das características microscópicas, tais como a arquitectura cripta-vilosidade luminal que representam um ambiente adequado para o repovoamento do nicho de células estaminais intestinal. No aspecto macroscópico, a presença de uma rede vascular hierárquica irá permitir ligação ao recipiente, permitindo fornecimento de nutrientes e oxigénio para toda a camada de a-TE intestino 21. Além disso, a manutenção de componentes da matriz extracelular, como colágeno, elastina e glyocosaminoglycans tem um papel importante não só para as características mecânicas, mas também dirigir proliferação e diferenciação celular. Mais importante, a capacidade de a metodologia de descelularização de ser melhorados em grander tecidos, enquanto mantendo as mesmas características é uma característica importante para a tradução clínica da TE. O desenvolvimento de uma matriz intestinal natural com uma rede vascular permite a criação de grandes segmentos do intestino artificial, que pode ser ligado ao hospedeiro.

A engenharia de tecidos (TE) oferece uma alternativa terapêutica ao transplante de órgãos, ignorando questões de imunossupressão e escassez de órgãos. TE teve, recentemente, aplicações bem sucedidas na clínica, com a substituição de órgãos como a bexiga 1, 2 uretra e traquéia, tanto em adultos 3,4 e crianças 5. Construção de um órgão de engenharia de tecidos, requer a combinação de um andaime, com as células apropriadas. Um andaime pode ser preparado usando de origem natural (por exemplo, colagénio) e (por exemplo, ácido poli-L-glicólico; PLGA) sintética materiais, ou ser obtido através da descelularização de órgãos e de tecidos nativos. Os andaimes que têm sido utilizados até agora para TE intestinais têm sido principalmente quer descelularizado (submucosa de intestino delgado) ou sintético (ácido poli-L-ácido glicólico e ácido poli-láctico) 6-13. Estes biomateriais são muito simples, tanto macro-e micro-arquitetura, quepode não ser ideal se intestino engenharia de tecidos deve ser traduzido clinicamente. Um biomaterial ideal para o intestino deve ter uma árvore vascular inata, que pode ser conectado ao fornecimento de sangue do hospedeiro, de uma parede tubular de camadas com diferentes propriedades de modo a reflectir as camadas da parede intestinal e um eixo vilo-cripta no lado luminal para auxiliar com repovoamento de células estaminais epiteliais. Decelularização é uma nova metodologia que produz andaimes, removendo as células de órgãos inteiros, mantendo sua arquitetura original 14. Isto é preferível para andaimes já existente, uma vez que não só a mesma estrutura do órgão, mas também contêm sinais químicos incorporados no interior da matriz extracelular (ECM), que ajuda a proliferação e diferenciação celular. Em 2008, um traquéia cadavérico foi descelularizados 14, semeado com células do próprio paciente, e transplantadas para substituir brônquio principal esquerdo em um homem jovem <sup&gt; 3. Desde então, diversos grupos relataram a produção de andaimes descelularizados para o coração 15, 16,17 fígado, pulmão e 18-20 em animais pequenos e grandes. Nós também se adaptaram a mesma metodologia para produzir um pequeno andaime descelulada intestinal 21. O objectivo do método aqui descrito é para produzir matrizes intestinais descelularizados que mantêm as características macroscópicas do tecido original, tais como o fornecimento de sangue, bem como a arquitectura microscópica do eixo vilo-cripta no lúmen intestinal. Acreditamos que essa metodologia poderia finalmente ser adotado para outros órgãos para melhorar a eficiência de descelularização.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

Engenharia de tecidos bem sucedido envolve a combinação de andaimes com células adequadas in vitro ou in vivo. Os andaimes podem ser sintéticos, de origem natural ou derivados de tecidos / órgãos. Estes últimos são obtidos utilizando uma técnica chamada de descelularização. Descelularização pode envolver uma combinação de métodos enzimáticos física, química, e. O objetivo desta técnica é remover todos os vestígios de telefonia celular, mantendo a arquitetura micro-macro e do tecido original. Engenharia de tecidos intestinais, até agora utilizados andaimes relativamente simples que não reproduzem a arquitetura complexa do órgão nativo. O foco deste artigo é descrever uma técnica eficiente para decellularization rato intestino delgado. O isolamento do intestino delgado, de modo a assegurar a manutenção de uma ligação vascular é descrito. A combinação das soluções químicas e enzimáticas para remover as células whilª preservando o eixo vilosidade-cripta no aspecto luminal do andaime também está definido para fora. Finalmente, é discutida a avaliação de andaimes produzidos para as características apropriadas.

Após a descelularização bem sucedida (Figura 1), o andaime deve ter uma aparência macroscópica semelhante ao do intestino nativo, mas com paredes translúcidas (Figura 2A). A preservação da macro-arquitetura também deve ser evidente por a desobstrução da árvore vascular. Quando corante é injectado através da cânula da SMA, ele deve distribuir uniformemente por todo o andaime e atingir a árvore capilar (Figura 2B). O andaime deve estar livre de material nuclear e citoplasmática, algo que pode ser avaliada através de um kit de quantificação de DNA e análise histológica simples. Hematoxilina e eosina (H &amp; E) deve demonstrar a ausência de material nuclear e citoplasmática, preservando as pequenas camadas intestinais (Figura 3A). Em particular, a manutenção das criptas e vilosidades do lado luminal deve ser evidente a seguir a microscopia electrónica de varrimento (Figura 4). Aconservação de componentes da matriz extracelular, tais como o colagénio, a elastina e os glicosaminoglicanos também deve ser esperado. Por exemplo, de tricromo Masson exibe tecido conjuntivo intacto no andaime (Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Plano Experimental Timeline do procedimento decellularization; PBS / AA: tampão fosfato com antibiótico-antimicótico, NaDeoxy: desoxicolato de sódio, RT: temperatura ambiente, DNAse-I: desoxirribonuclease-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Andaime macroscopic características. aparência macroscópica do intestino delgado de ratos após decellularization sucesso (A). A injeção de Rosso Ponceau corante através da SMA demonstra uma rede vascular intacto (B); SMA: artéria mesentérica superior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. . Histologia H &amp; E (A) e MT (B) coloração indicam uma ausência de material celular com a preservação da arquitetura do tecido conjuntivo; H &amp; E: hematoxilina e eosina, MT: Masson. Barra de escala:. 100 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . </p&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. . Microscopia eletrônica de Microscopia Eletrônica de Varredura indica a arquitetura das vilosidades-crypt preservada no lúmen andaime; Barra de escala:. 100 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas.

A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

a-decellularization-methodology-for-production-natural-acellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K visualizações.  University College London.  O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas. 

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Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Bioengenharia

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularization e Recellularization metodologia para as veias safena humanas

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization do coração humana dentro de uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolamento e Decellularization de um pâncreas todo porcino

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

Produção de nanodroplets de decafluorobutano filtrados por membrana a partir de microbolhas pré-formadas

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.