Gli autori ringraziano il Wake Forest Institute di Medicina Rigenerativa per il loro aiuto con lo sviluppo di questo protocollo. Noi riconosciamo il sostegno da finanziamenti della carità Great Ormond Street Hospital, la Fondazione Eugenio Litta (Ginevra, Svizzera), il Medical Research Council, il Royal College of Surgeons of England, i bambini Sparks Medical Charity, il Foreign Office britannico per il Regno Unito / USA Stem Cell Collaboration Award e del Fondo di ricerca Mittal. Vorremmo anche ringraziare la Fondazione Royal Society / Wolfson per la concessione di ristrutturazione del laboratorio di ingegneria tissutale ottenuto per il Dipartimento di Chirurgia Pediatrica presso l&#39;Istituto di Salute del Bambino. PDC e SE sono supportati da Carità Great Ormond Street Children del Hospital.

1. Isolamento di Rat Intestino <ol><li> Preparare una soluzione 1 L di Soluzione tampone fosfato (Sigma, UK) con 1% antibiotico / antimicotico (Sigma, UK) (PBS / AA). Montare la pompa peristaltica (Masterflex L / S a velocità variabile) con due tubi. Eseguire il 70% di etanolo (EtOH) attraverso i tubi della pompa peristaltica per 15 min a velocità massima, seguito da PBS / AA per altri 15 min. </li><li> Euthanize adulti Sprague-Dawley peso di circa 250-350 g di CO 2 per inalazione e dislocazione cervicale in conformità con le linee guida locali animali e omologazioni (nel Regno Unito, gli orientamenti Home Office sotto gli Animali (Scientific Procedures) Act 1986). </li><li> Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima dell&#39;uso. Spruzzare e pulire l&#39;addome dell&#39;animale con il 70% EtOH. </li><li> Eseguire una incisione laparotomica xifo-pubica sull&#39;addome per garantire un campo chirurgico chiaro. </li><li> Sventrare tenue sul lato destro dell&#39;animale su un tovagliolo di carta spruzzato con il 70% EtOH. Take cura di bagnare continuamente l&#39;intestino con PBS / AA in modo da evitare la disidratazione del tessuto e denaturazione della matrice extracellulare (ECM). </li><li> Individuare l&#39;arteria mesenterica superiore (SMA) derivante da un angolo di 90 ° dall&#39;aorta verso l&#39;intestino. Utilizzare un G cannula 27 per immettere il SMA dall&#39;aorta e rapidamente estrarre l&#39;ago per evitare di strappare la parete del recipiente. Far avanzare il tubo di plastica della cannula nella SMA e fissarlo con suture (Vicryl 5/0). </li><li> Confermare incannulamento iniettando 1 ml di PBS / AA. Utilizzare forbici a molla per incidere la aorta prossimale e distale alla SMA in modo da rilasciare la cannula. </li><li> Per evitare la fuoriuscita di feci quando sezionare l&#39;intestino crasso, posizionare un (seta 5/0) sutura nodo sull&#39;estremità prossimale della giunzione ileo-cecale e uno all&#39;estremità distale del sigma. Poi tagliare l&#39;ileo terminale e del colon tra i due nodi e rimuovere l&#39;intestino crasso. </li><li> Tagliare l&#39;intestino al digiuno-duodenale incrocio unnd liberare l&#39;intestino da eventuali collegamenti del tessuto connettivo che potrebbe avere con l&#39;addome. </li><li> Trasferire il piccolo intestino in una capsula di Petri con PBS / AA. Incannulare la sezione prossimale dell&#39;intestino con una pipetta Pasteur di plastica (LSL Laboratorio di consumo) e fissarlo in posizione con punti di sutura. Tagliare la pipetta in modo che si adatti il ​​Luer-Lok di una siringa da 60 ml (BD Plastipak). Lavare il lume intestinale 2x con 60 ml di PBS / AA per rimuovere le feci e detriti. </li></ol> 2. Decellularization Metodologia <ol><li> Collegare la cannula vascolare a tre vie rubinetto. Ciò faciliterà la manipolazione, minimizzare la tensione sull&#39;albero vascolare e consentire la rimozione di bolle dal tubo. </li><li> Iniziare a correre acqua deionizzata (resistività 18,2 mW / cm) attraverso la pompa rullo a velocità variabile Masterflex L / S a 0,6 ml / h. Assicurarsi che nessun bolle sono presenti all&#39;interno di tubi prima di collegare il lume intestinale rubinetto. Alcune bolle possono essere presenti all&#39;interno del lume dal passaggio1.9, che può compromettere il processo di decellularization. Variare la velocità della pompa e gestire il tessuto con una pinza con attenzione per garantire l&#39;uscita bolle dall&#39;estremità distale. Non collegare la cannula vascolare fino a quando questo processo è finito in quanto velocità elevate potrebbero danneggiare l&#39;albero vascolare. </li><li> Trasferire apparato per la cella, in quanto la successiva fase di decellularization è eseguita a 4 ° C. La bassa temperatura consente la rimozione di cellule minimizzando decomposizione tessuto. Porre la capsula di Petri in un contenitore che raccoglierà la soluzione traboccante. Profumato sia lume intestinale e l&#39;albero vascolare con acqua deionizzata (resistività 18,2 mW / cm) per 24 ore a 0,6 ml / h. Per controllare la prima ora l&#39;apparecchio regolarmente per assicurare tutti i collegamenti siano sicuri, la perdita è minima e assenza di bolle sono presenti all&#39;interno dell&#39;intestino. </li><li> Dopo 24 ore di trattamento con acqua deionizzata, spostare apparato decellularization esternamente alla cella come il resto dei passaggi sonoeffettuate a temperatura ambiente (RT). </li><li> Pesare desossicolato di sodio (Sigma, UK) per preparare 300 ml di una soluzione al 4% in acqua deionizzata. Pesare sodio desossicolato sotto una cappa di aspirazione, in quanto è un irritante orale e oculare. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. La soluzione può essere conservata a 4 ° C per 1 mese. </li><li> Cambiare la soluzione deionizzata al sodio desossicolato, controllare i collegamenti, rimuovere eventuali bolle e profumato a 0,6 ml / h per 4 ore. </li><li> A seguito della fase di lavaggio sodio desossicolato con PBS / AA per 30 min per evitare interazioni tra il sodio desossicolato e DNasi-I. </li><li> Pesare deossiribonucleasi-I (DNasi-I, Sigma) e preparare 250 ml di una soluzione di 2.000 kU in 1 M di cloruro di sodio, pH 7,4. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. Questa soluzione deve essere preparata immediatamente prima dell&#39;uso e non può essere conservato. </li><li> Profumato con DNasi-I per 3 ore a temperatura ambiente ad una velocità di 0,6 ml / hr. </li><li> Dopo la fase di DNasi-I, trasferire l&#39;patibolo in una cappa di coltura tissutale e cambiare piatti e strumenti. Si consiglia di utilizzare una tecnica asettica. </li><li> Lavare con PBS / AA per 30 minuti al fine di garantire tutti i resti delle soluzioni decellularizzazione vengono rimossi. Posizionare il patibolo in una nuova piastra di Petri e versare in un Crosslinker UV (Spectroline, Stati Uniti). Eseguire due cicli di sterilizzazione. Conservare in 5% PBS / AA e cambiare la soluzione ogni 3 giorni. </li></ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le fasi più difficili nella creazione di questo esperimento implicano l&#39;incannulamento della SMA e la creazione e il mantenimento della sterilità. Cannulating la SMA nei roditori senza rompersi la parete può essere molto difficile a causa delle dimensioni e della posizione della nave. In alternativa, una sutura può essere posizionato intorno dell&#39;aorta prossimale prima origine SMA, seguita da incannulazione dell&#39;aorta sé distalmente, dirigendo la cannula di plastica nella SMA. Durante decellularization una combinazione di scarsa posizionamento cannula e portate elevate può portare a perdere l&#39;accesso vascolare. La sterilità è una questione importante a causa della quantità di flora batterica presente nell&#39;intestino tenue. Lavaggio con PBS / AA raccolto successivo è molto importante, e qualsiasi segno di materia fecale o detriti deve essere rimosso dal lume. Effettuazione di una porzione del ponteggio in un tubo Falcon con DMEM nell&#39;incubatrice seguente sterilizzazione UV dovrebbe essere un indicatore se la sterilità è stato raggiunto. Nel casodi colonizzazione batterica, i media cambierà il pH con il suo colore girando da rosso a giallo. Per far fronte a ciò, ulteriori cicli UV sono invitati nonché lavaggio con PBS contenente un&#39;alta concentrazione di antibiotico / antimicotico. Una possibile modifica avere un ponteggio con accesso sia vascolare e venosa sarebbe incannulare la vena cava inferiore (IVC) nonché la SMA. Decellularization dai lati venose e vascolari deve essere eseguita in modo intermittente per tutte e tre le soluzioni. Decellularization continua può scoppiare i capillari facendo pressione positiva su entrambi i lati. Nel corso degli anni ci sono stati una serie di sforzi intestinale TE utilizzano differenti combinazioni di cellule-scaffold in vitro e in vivo 6,9,12. La maggior parte del lavoro è stato eseguito utilizzando tubolari non tessuto 95% PGA-5% scaffold PLGA rivestiti con collagene di tipo I 6,7,13,22. A seguito di semina con intestinaleunità epiteliali organoide (UO) e un periodo dell&#39;impianto nel omento di topi, formano cisti con il muscolo all&#39;esterno e all&#39;interno epitelio che possono poi essere tubularizzato. Tuttavia, la porosità e la semplicità nella progettazione di questi scaffold non consente per la generazione di grandi pezzi di intestino artificiale in un ambiente in vitro come quello di un bioreattore. Inoltre, la mancanza di una rete vascolare innata che può essere collegato al destinatario limita ulteriormente l&#39;uso di questo scaffold per la traduzione clinica. Oltre agli esperimenti con i ponteggi PGA-PLGA, altri gruppi hanno utilizzato collagene o SIS ponteggi, entrambi i quali non replicano la complessità del tratto intestinale. SIS in particolare è l&#39;unico precedente metodologia pubblicata dell&#39;ingegneria tessuto intestinale ed è stato utilizzato in più di 150 regolazioni mediche, dimostrando la capacità di ponteggi decellularized per fornire stabilità meccanica e promuovere la crescita delle cellule mentre piombozione di nessuna risposta immunogenica. Tuttavia, la mancanza di adeguate macro-e micro-architettura, ha portato a scarsi risultati nel suo &#39;utilizzazione a fini intestinali TE 9-11,23. I vantaggi della metodologia decellularization abbiamo descritto includono la conservazione delle caratteristiche microscopiche come il luminal architettura cripta-villo che rappresentano un ambiente appropriato per il ripopolamento dalla intestinale nicchia delle cellule staminali. Sotto l&#39;aspetto macroscopico, la presenza di una rete vascolare gerarchica consentirà allegato al destinatario, consentendo fornitura di sostanze nutritive e ossigeno a tutto strato del TE-intestinale 21. Per di più, la manutenzione dei componenti ECM come glyocosaminoglycans collagene, elastina e ha un ruolo importante non solo per caratteristiche meccaniche, ma anche dirigere la proliferazione e la differenziazione cellulare. Soprattutto, la capacità della metodologia decellularization per essere scalata in grandetessuti r pur mantenendo le stesse caratteristiche è una caratteristica importante per la traduzione clinica di TE. Lo sviluppo di una matrice intestinale naturale con una rete vascolare permette la creazione di grandi segmenti di intestino artificiale che può essere collegata al sistema host.

L&#39;ingegneria tissutale (TE) offre un&#39;alternativa terapeutica del trapianto di organi, bypassando problemi di immunosoppressione e la carenza di organi. TE ha recentemente avuto applicazioni di successo nella clinica, con sostituzione di organi come la vescica 1, 2 uretra e trachea, sia negli adulti e nei bambini 3,4 5. Costruzione di un organo tissutale richiede la combinazione di un ponteggio con le opportune cellule. Un ponteggio può essere preparato usando derivazione naturale (ad esempio collagene) e (ad esempio acido poli-L-glicolico; PLGA) materiali sintetici, o essere ottenuta con la decellularization di organi e tessuti nativi. Ponteggi che sono stati utilizzati finora per TE intestinale sono principalmente di due decellularized (piccola sottomucosa intestinale) o sintetica (acido poli-L-glicolico e acido poli-lattico) 6-13. Questi biomateriali sono molto semplici sia in macro e micro-architettura, chepuò non essere l&#39;ideale se intestino tissutale deve essere clinicamente tradotto. Un biomateriale ottimale per l&#39;intestino dovrebbe avere un albero vascolare innata che può essere collegato all&#39;alimentazione sangue dell&#39;ospite, una parete tubolare livelli con proprietà diverse per riflettere gli strati della parete intestinale e un asse villi cripta sul lato luminale per aiutare con ripopolamento da parte delle cellule staminali epiteliali. Decellularization è una nuova metodologia che produce ponteggi rimuovendo le cellule di organi interi pur mantenendo la loro originale architettura 14. Questo è preferibile scaffold già esistente dal momento che replicano non solo la struttura dell&#39;organo ma anche contengono indicazioni chimiche incorporati nella matrice extracellulare (ECM) che aiuti la proliferazione e la differenziazione cellulare. Nel 2008 un trachea cadavere è stato decellularized 14, seminati con cellule proprie del paziente, e trapiantato a sostituire le principali bronco sinistro in un giovane <sup&gt; 3. Da allora, vari gruppi hanno riportato la produzione di scaffold decellularized per il cuore 15, 16,17 fegato, polmone e 18-20 nelle piccole e grandi animali. Abbiamo anche adattato la stessa metodologia per produrre un piccolo intestino ponteggio decellularized 21. L&#39;obiettivo del metodo qui descritto è di produrre matrici intestinali decellularized che mantengono le caratteristiche macroscopiche del tessuto originale, come la fornitura di sangue, così come l&#39;architettura microscopica dell&#39;asse villi-cripta nel lume intestinale. Crediamo che questo metodo potrebbe infine essere adottata per altri organi per migliorare l&#39;efficienza di decellularization.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

Ingegneria tissutale riuscito coinvolge la combinazione di scaffold con cellule idonee in vitro o in vivo. Ponteggi possono essere sintetico, di derivazione naturale o derivati ​​da tessuti / organi. Questi ultimi sono ottenuti utilizzando una tecnica chiamata decellularization. Decellularization può comportare una combinazione di metodi enzimatici fisici, chimici, e. L&#39;obiettivo di questa tecnica è quello di rimuovere tutte le tracce cellulari mantenendo la macro e micro-architettura del tessuto originale. Ingegneria tessuto intestinale ha finora utilizzato ponteggi relativamente semplici che non replicano la complessa architettura del fegato nativo. Il focus di questo lavoro è quello di descrivere una tecnica decellularization efficiente per ratto piccolo intestino. L&#39;isolamento del piccolo intestino in modo da garantire il mantenimento di una connessione vascolare è descritto. La combinazione di soluzioni chimiche ed enzimatiche per rimuovere le cellule whilst preservare l&#39;asse villo-cripta sotto l&#39;aspetto luminale del patibolo è impostato anche fuori. Infine, la valutazione di scaffold prodotti per caratteristiche adeguate è discusso.

Su decellularization successo (Figura 1), il ponteggio deve avere un aspetto macroscopico simile a quello dell&#39;intestino nativo, ma con pareti traslucide (Figura 2A). La conservazione di macro-architettura dovrebbe essere evidente dalla pervietà dell&#39;albero vascolare. Quando colorante viene iniettato attraverso la cannula SMA, dovrebbe distribuire uniformemente tutta l&#39;impalcatura e raggiungere l&#39;albero capillare (Figura 2B). Il ponteggio deve essere privo di materiale nucleare e citoplasmatica, qualcosa che può essere valutata utilizzando un kit di quantificazione del DNA e semplice analisi istologica. Ematossilina e eosina (H &amp; E) devono dimostrare l&#39;assenza di materiale nucleare e citoplasmatica pur conservando i piccoli strati intestinali (Figura 3a). In particolare, il mantenimento dei villi e cripte sul lato luminale dovrebbe essere evidente seguente microscopia elettronica a scansione (Figura 4). Laconservazione dei componenti della matrice extracellulare come glicosaminoglicani collagene, elastina e dovrebbe anche essere previsto. Ad esempio, Trichrome display colorazione di Masson intatto il tessuto connettivo nel ponteggio (Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Piano sperimentale Timeline di procedimento decellularization; PBS / AA: tampone fosfato con NaDeoxy antibiotico-antimicotico,: deoxycholate sodio, RT: temperatura ambiente, DNAse-I: deossiribonucleasi-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Scaffold macroscopicac caratteristiche. aspetto macroscopico del piccolo intestino di ratto in seguito decellularization successo (A). Iniezione di Rosso Ponceau tingere attraverso la SMA dimostra una rete vascolare intatto (B); SMA: mesenterica superiore <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. . Istologia H &amp; E (A) e MT (B) colorazione indicano l&#39;assenza di materiale cellulare con la conservazione dell&#39;architettura tessuto connettivo; H &amp; E: ematossilina e eosina, MT: tricromica di Masson. Barra della scala:. 100 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . </p&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. . Microscopia elettronica a scansione al microscopio elettronico indica il conservato l&#39;architettura dei villi-crypt nel lume ponteggio; Scala bar:. 100 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

L&#39;articolo descrive un metodo per la produzione di una matrice acellulare di ratto intestino. La derivazione di ponteggi intestinale è importante per le future applicazioni in ingegneria dei tessuti, biologia delle cellule staminali e test anti-droga.

Un Decellularization Metodologia per la produzione di un naturale acellulare intestinale Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K Views.  University College London.  L'articolo descrive un metodo per la produzione di una matrice acellulare di ratto intestino. La derivazione di ponteggi intestinale è importante per le future applicazioni in ingegneria dei tessuti, biologia delle cellule staminali e test anti-droga. 

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Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Ricerca

Bioingegneria

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

Decellularizzazione e metodologia di ricellularizzazione per le vene safena umane

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularizzazione di cuore umano intero all'interno di una custodia pressurizzata in un orientamento invertito

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolamento e decellularizzazione di un Pancreas suino intero

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

Produzione di nanogoccia di decafluorobutano a spostamento di fase filtrate a membrana da microbolle preformate

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.