פרוטוקול זה הוא השער למטריצה החוץ-תאית. זה המורכבות והמבנה שלו עד לסולם תת מיקרון. אז היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת להשיג מטריצה חוץ תאית ששומרת על השלמות המבנית שלה ובכך פותחת את הדרך לניתוח ביוכימי ואנטומי.
בהדגמת ההליך יהיו אלחנדרו מאיורקה ג'ילאני, רפאל רויטן ומריה ראפיבה, שנמצאים כרגע במעבדה שלי וכריס מדסן שהיה במעבדה שלי והמשיך את העבודה באוניברסיטת לונד. התחל על ידי גילוח בית החזה, הבטן והחלק האחורי של העכבר המתת חסד עם קוצץ שיער. לחטא את האזור עם 70% אתנול.
לאחר מכן הצמידו את העכבר למגש פוליסטירן, המרחיב את ארבע הגפיים האחוריות הקצות שלו, כמו גם את ראשו וזנבו. מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ המיקרו-כירורגיה. באמצעות מספריים דפוס ישר מאיו, לעשות חתך עורי פועל מאזור הלסת התחתונה לבטן התחתונה ולנתח תת עורית כדי לחשוף את דופן בית החזה ואת הצפק.
לאחר מכן השתמש במספריים מיקרוכירורגיים כדי לחתוך את שרירי החזה העיקריים והדקטריים לאורך החלל הבין-צילומי השישי משני צידי דופן דופן בית החזה. חותכים את החזה לאורך החתכים הקודמים עם מספריים דפוס ישר. לאחר מכן להשלים כריתת החזה על ידי חיתוך ציר החזה לאורך צירו הארוך.
הגבהו והצמידו, משני צידי דופן בית החזה כדי לחשוף את תסביך הלב-ריאה. השתמש במלקחיים מיקרו עגולים כדי לחתוך את התימוס ואת רקמת השומן שמסביב על ידי משיכה עדינה שלהם את ההחזקות שלהם. ולחתוך את הוושט עם מספריים זעירות.
להפריד את הוורידים brachiocephalic ואת העורק brachiocephalic עם מלקחיים מיקרו חדים. לאחר מכן להפריד את העורק הראשי המשותף השמאלי ואת העורקים התת-בריקליים השמאליים מן הרקמה הבסיסית כדי להקל על קשירה וצרוב. השתמש מחזיק microneedle מלקחיים מיקרו חדים תשעה הו תפר להניח תפרים מעל הופעתה של brachiocephalic עזב עורקים נפוצים והעורקים התת-בריקליים שמאל, לצרוב את הוורידים brachiocephalic.
באמצעות מספריים מיקרו, לפתוח כניסה על ידי חתך הרצועה. הכניסו קטטר 27 מד לתוך קנה הנשימה ולדחוף בעדינות עד קנה הנשימה מסתעף לתוך הסימפונות, דואג לא לשבש את הסימפונות. בעזרת תפר של שישה O, מניחים שלושה תפרים סביב קנה הנשימה כדי לאבטח את הצנתר.
קטע את העכבר בגובה החוליה החזה ה -12, אב העורקים היורד פועל בקו הקדמי לעמוד השדרה ויש לחלק אותו כאן יחד עם עמוד השדרה. מצמצם בנסיגה את בן העורקים ולדחוף את הצנתר עד שהוא מגיע לקשת של בכושר העורקים. בעזרת תפר, מניחים ארבעה תפרים סביב באבי העורקים, החל מחמישה מילימטרים מתחת לקצה הצנתר.
חבר את העכבר למערכת משאבה באמצעות צינורות סיליקון ומחברים נמוכים יותר. יש לטפס עם מים דה-תיוניים ב-200 מיקרוליטרים לדקה במשך 15 דקות. לאחר מכן לשנות את סוכן זלוף ל 0.5%DOC, מדולל במים deionized ולפרפר בן לילה.
למחרת, לשנות את סוכן זלוף ל 0.1%SDS מדולל במים deionized, ולפרוט במשך שמונה שעות. לאחר מכן לעיין במים דה-יונים במשך 24 שעות כדי לשטוף את ה- SDS וה- DOC.
לאחסן את הרקמה בצינור קריו סטרילי במים deionized עם 1% פניצילין סטרפטומיצין ו 0.3 מיקרומולר נתרן אזיד בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע כתמי אימונו, לחסום את המדגם על ידי דגירה אותו בצינור הקפאה המכיל 6% סרום חמור ו 3% BSA לילה. ואז לדגור עם נוגדן ראשוני בסרום חמור 3% ב PBS במשך 24 שעות.
לאחר הדגירה לשטוף את המדגם חמש פעמים PBST במשך שעה אחת לכל לשטוף. לדגור על המדגם עם נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי בסרום חמור 3% ב- PBS במשך 24 שעות. ואז לחזור על הכביסות ב PBST.
מוסיפים את המים היונים ומאחסנים את המדגם במרחק של ארבע מעלות צלזיוס מאור ישיר. כדי לדמיין את המדגם, מניחים אותו בצלחת תחתונה מזכוכית ולח אותו עם שתי טיפות של פתרון אחסון. הגדר את המטרה ולבדוק את המדגם באמצעות אור פלואורסצנטיות.
עבור לבקרת מחשב, הפעל לייזרים והתאם את עוצמת הלייזר, צמצם חור הסיכה, אורך הגל של הגל, הרווח, הרזולוציה וההזום. הגדר את המספר ואת גודל השלב עבור מחסנית Z ולאחר מכן להתחיל רכישה. מוציאים אונת ריאה אחת מעכבר מורדם ומניחים אותה בתבנית קריו 10 על 10 על 5 מ"מ.
לכסות אותו עם כ 500 קילומטר microliters של תרכובת OCT ולהקפיא אותו על קרח יבש. שמור על הדגימה בטמפרטורה הזאת. Excise אונת ריאות אחת decellularized מעכבר מעובד, למקם אותו בתבנית קריו עם שטח הפנים הגדול ביותר למטה לכסות אותו עם תרכובת OCT.
להקפיא את המדגם על קרח יבש ולשמור אותו בטמפרטורה זו עד שנדרש אחרת. ניתן לאחסן את הדגימה למשך 12 שבועות לפחות. השתמש cryostat כדי סעיף בלוקים רקמה קפואה לחמישה מקטעי מיקרומטר במינוס 20 מעלות צלזיוס.
ומניחים את המקטעים על שקופיות זכוכית דבק. מעבירים את השקופיות לטמפרטורת החדר עד שהאוויר מתייבש. לטבול בקצרה את השקופיות PBS, ואחריו 4%paraformaldehyde ב- PBS במשך 15 דקות.
לשטוף פעם אחת PBS, ולאחר מכן פעמיים במים מזוקקים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לטבול את השקופיות בפתרון המטוקסילין של מאייר במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות בצנצנת קופלנד תחת מים מזוקקים זורמים במשך 10 דקות לטבול בתמיסת אאוזין במשך שבע דקות.
טובלים בקסילן מספר פעמים. יש למרוח כמה טיפות של הרכיבה על DPX בינונית ולהניח פתק כיסוי מזכוכית. השאר את השקופיות להתייבש לילה מתחת למכסה המנוע הכימי ולאחר מכן לסרוק אותם בסורק שקופיות.
לאחר השלמת הפרוטוקול בהצלחה, הלב והריאות ורקמת NX יהיו נקיים מתאים. Decellularization יכול להיות מאומת על ידי המטוקסילין אאוזין כתמים של פיגומי ECM. הפיגומים שומרים על מידותיהם של איברים טריים ומבנה ה- ECM הניתן להתגלות שלו אינו נפגע.
פיגומי ECM הראו חמיאות מוגברת וחבובות אור. שימוש בפרוטוקול זה עם שלב מיקרוסקופ ממונע מאפשר הדמיה תלת ממדית של דגימות הרכבה שלמות ברזולוציית תת מיקרון. זה חיוני כדי להתרחק זרימה לכיוון האיברים של עניין כדי להשיג decellurization אחיד מלא.
הניתוח המיקרו-כירורגי וקשירת כלי הדם חייבים להיות יעילים. ובאותו הזמן לכבד את רקמות היעד כדי לשמור על מבנה VCM מקומי. בעקבות הליך זה, הפיגומים יועשרו לחלבוני ECM מבניים וניתן להשתמש בהם לספקטרומטריית מסה או להנדסת רקמות.
טכניקה זו סוללת את הדרך למיפוי ברזולוציה גבוהה של המטריצה החוץ-תאית.
