אנו מודים לחברים בעבר ובהווה ובמעבדות יק&quot;ט LM-S לפיתוח והשיפור של טכניקות הגנטיקה הפוכות arenavirus ופלסמידים. אנו מודים גם Snezhana Dimitrova לקבלת תמיכה טכנית. הנוגדן חד שבטי מופנה לJUNV NP (SA02-BG12) התקבל ממשאבי BEI (biodefense NIAID ומתעורר מחקר מאגר זיהומים משאבים). BYHC נתמכה על ידי מענק ממספר GM068411 פרס מוסדי רות ל &#39;Kirschstein שירות הלאומי למחקר. איו-R הוא Fullbright-Conicyt (BIO 2008) ורוצ&#39;סטר חיסון האחווה (2012) נמען. תמיכה הנוכחית איו-R מסופקת על ידי מלגת דוקטורט לגיוון ומצוינות אקדמית מהמשרד לפיתוח פקולטה וגיוון באוניברסיטת רוצ&#39;סטר. מחקר בLM-S מעבדה ממומן על ידי NIH מענקי RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, המרכז NIAID המצוינים למחקר שפעת ומעקבים (HHSN266200700008C), ואוניברסיטת רוצ&#39;סטר המרכז לדוגמנות חיסונית biodefense (HHSN272201000055C). מחקר במעבדת יק&quot;ט נתמך על ידי מענקי RO1 AI047140, RO1 AI077719, וRO1 AI079665 מ-NIH.

1. Transfection הצלת Arenavirus מערכת ההצלה שלנו הייתה מבוססת על השימוש בשני פלסמידים ביטוי חלבון פולימראז II קידוד nucleoprotein (NP) ו-RNA תלוי-RNA-פולימראז (L), גורמי טרנס הפועל הנגיפיים הנדרשים לשכפול RNA וביטוי גנים של הגנום arenavirus 7, 19, ופלסמידים שמסוגלים לכוון סינתזה תאית, באמצעות RNA פולימראז אני הסלולרי (Pol-I), של ה-S ומיני L antigenome RNA 7. במחקרים שלנו אנו משתמשים בביטוי חלבון pCAGGS פלסמיד, אשר משתמש אמרגן β-אקטין העוף ו( PA) רצפי אותות polyadenylanation, וPol-אני אדם פלסמיד, אשר עושה שימוש בפולימראז האנושי אמרגן ורצפי שליחות קטלני עכבריים (איור 2) . S וקטעי RNA L הם משובטים לתוך hpol-פלסמיד בנטיית antigenomic כדי לאפשר לדור של מקטעי RNA הגנומי על ידי שעתוק hpol-I. להצלת פרועה טייPE רקומביננטי LCMV (rLCMV) ופספוסי # 1 (rCandid # 1) NP pCAGGS וL מוירוס היו שיתוף transfected יחד עם Pol-אני בהתאמה האנושי S וקטעי RNA L (איור 3). הדור של רקומביננטי LCMV trisegmented (r3LCMV) ופספוסי # 1 (r3Candid # 1) ואחריו פרוטוקול דומה אבל קטע S פוצל לשני פלסמידים S-Pol אני שונים, שכל אחד קידוד גן כתב ייחודי: באחד, קריאת NP הפתוחה מסגרת (ORF) הוחלפה (GFP) גן ירוק חלבון פלואורסצנטי כתב (hpol-S אני GFP / רופא משפחה), ובשני, מבשר גליקופרוטאין הנגיפי (GPC) ORF מוחלף לוציפראז Gaussia (Gluc) גן הכתב (Hpol-S אני NP / Gluc). ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מתואר באיור 4. Transfection הבאה ופרוטוקול זיהום כבר נקבעו ל6 גם צלחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000): הכן 250 μl של תקשורת OptiMEM ו, בהתאםעל הצלת הווירוס, 10 - 12 מיקרוגרם של LPF2000 (1 מיקרוגרם / μl) לכל transfection (טבלת 1). יחס של 2.5 מיקרוגרם לLPF2000 מיקרוגרם של ה-DNA הוא מומלץ. דגירה של 5 - 10 דקות ב RT. בינתיים מכין את תערובת transfection פלסמיד בצינור microcentrifuge נפרד (שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת transfection פלסמיד דנ&quot;א: להכין את קוקטייל transfection פלסמיד בצינור microcentrifuge שימוש בכמויות המומלצות לכל הצלת וירוס (ראה טבלה 1). להביא את הנפח הסופי ל -50 μl עם OptiMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת פלסמיד OptiMEM-LPF2000-DNA: הוסף 250 μl של התערובת-LPF2000 OptiMEM (שלב 1.1) לתוך תערובת transfection פלסמיד דנ&quot;א (שלב 1.2). דגירה את התערובת למשך 20 - 30 דקות ב RT. בינתיים להכין ולספור 1 x 10 6 תאי Vero לתגובת transfection. תאי Vero יהיה transfected בהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי Vero: Vero celLS בתרבית 100 מ&quot;מ צלחות. לפני שמתחיל, תביא PBS 1X, DMEM 10% FBS PS 1% תקשורת, ותערובת טריפסין-EDTA עד 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים, פעמיים, עם 5 מ&quot;ל של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים עם 1 מ&quot;ל של טריפסין-EDTA ולחכות עד שתאים לניתק (כ -5 דקות). עדין הקשה אולי נדרש לנתק לחלוטין את התאים מאת הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות, resuspend התאים 10 מ&quot;ל של DMEM 10% FBS PS 1% בצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 1000 סל&quot;ד בצנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 10 מ&quot;ל של DMEM 10% FBS PS 1% ולספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהתאים את הריכוז ל1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. זה היה ציין כי 0.5 - 1 x 10 6 תאי Vero לכל transfection הניבו את התוצאות הטובות ביותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים LPF2000/DNA ותאים: אחרי 20 - 30 דקות בטמפרטורת חדר דגירה (שלב 1.3), להוסיף 1 מ&quot;ל של תאי Vero (1 x 10 6) (שלב 1.4) כדיתערובת OptiMEM-LPF2000-DNA פלסמיד ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע לתוך תערובת LPF2000/DNA-cell 6 גם צלחות: הוסף את תערובת ה-DNA LPF2000-Vero (שלב 1.5) לתוך הבארות של צלחת 6 באר. נער בעדינות את 6 היטב הצלחת ולתת דגירה transfection הלילה באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית transfection: כ 16-24 שעות שלאחר transfection, להסיר את המדיה transfection, להוסיף 2 מ&quot;ל של תקשורת זיהום ודגירת תאי transfected עבור 48 שעות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר סלולרי: אחרי 48 שעות של דגירה בתקשורת זיהום, להסיר את רקמת תרבות supernatant (TCS) ולהעביר את תאי transfected לתוך צלחת 100 מ&quot;מ. TCS לעתים רחוקות מכיל וירוס מדבק, כי תאי transfected צריך דגירה נוספת כדי ליצור חלקיקי נגיף. למעבר התא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים, פעמיים, עם 2 מ&quot;ל של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאי w<html> 0.5 מ&quot;ל-i של טריפסין-EDTA ולחכות עד שתאים לניתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 1 מ&quot;ל של DMEM 10% FBS PS 1% בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 5000 סל&quot;ד, 4 מעלות צלזיוס בmicrocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend בקפידה את התאים ב 1 מ&quot;ל של תקשורת זיהום ולהעביר את התאים למנת 100 מ&quot;מ. להעלות את הנפח הכולל בצלחת, עם תקשורת זיהומיות, עד 8 מ&quot;ל, נפח מספיק כדי למנוע התייבשות של התאים, כמו גם לריכוז הווירוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את צלחת 100 מ&quot;מ ולהמשיך את הדגירה של תאי Vero בחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף של TCS: לאחר הדגירה 72 שעות, לאסוף TCS בצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל. הסר את תא פסולת על ידי centrifuging במשך 5 דקות ב2,500 סל&quot;ד בצנטריפוגה. arenavirus זיהומיות נמצאת TCS, כך להסיר מתא פסולת גלולה ולאחסן TCS ב -80 ° C. </li></ol>Le &quot;&gt; 2. אישור על הצלת Arenavirus רקומביננטי זיהוי של הצלה מוצלחת של rLCMV וrCandid # 1 מושגת באמצעות הקמת יחידת פוקוס (FFU) assay immunofluorescence (IFA). להצלת וירוס פראי מסוג שאנו משתמשים נוגדנים ספציפיים לNP הנגיפי. # 1 r3LCMV וr3Candid לקודד שני גני כתב (GFP וGluc), ובכך מאפשר זיהוי נגיפי וללא הצורך בטיטרציה של נוגדנים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (GFP) ו / או הארה (Gluc). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר הצלת arenavirus רקומביננטי פראי סוג: היום לפני טיטרציה, לשטוף תאי Vero פעמיים עם PBS, trypsinize ולהכין צלחות 96, גם כדי להגיע ל80 - מפגש 90% למחרת (4 x 10 4 תאים / טוב). נער בעדינות את הצלחות ביד כדי לקבל את חלוקת מדים של התאים. תרבות התאים, בן לילה, ב37 ° C חממה עם 5% CO 2. בדקו את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר monolayer, לפני שתמשיך עם הזיהום: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרנו לדלל (10 דילולים קיפול) המכיל את נגיף TCS התאושש מתאי transfected בצלחת 100 מ&quot;מ (שלב 1.10) בOptiMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מתאי Vero זרע, לשטוף פעמיים עם 50 μl של 1x PBS, ולהדביק תאים עם 50 μl של נגיף דילול סדרתי (שלב 2.1). להדביק תאים עבור 1.5 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדבקה, הווירוס להסיר את הבידוד, להוסיף 100 μl של זיהום תקשורת / היטב דגירה התאים עבור 16 - 18 שעות. מחדש זיהום נגיפי עלול להתרחש לאחר הדגירה שעות 18, אשר יכול לגרום ליתר הערכה של titers ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב16 - 18 שעות לאחר פגיעה, הסר את TCS מכל הטוב ולתקן את התאים עם פורמלין 4% בדילול ב 1x PBS, במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, להסיר את פתרון הקיבעון וpermeabilize התאים עם 0.1% טריטון X-100 בדילול 1x PBS, למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון permeabilization, ולאחר מכן לשטוף את התאים 3 פעמים wiה 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את התאים עם 2.5% אלבומין בסרום השור (BSA) ב 1x PBS (חסימת פתרון) עבור שעה 1 ב RT. לחלופין, ניתן לחסום את תאי הלילה ב 4 מעלות צלזיוס והמשיכו בדגירת נוגדן ביום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכין את הנוגדן הראשוני. לדלל את הנוגדנים הראשוניים ספציפיים #-1-LCMV ופספוסים בחסימת פתרון, ואז צנטריפוגות הנוגדן / פתרון חסימה במשך 15 דקות ב -3,500 סל&quot;ד. שיבוט חד שבטי אנטי LCMV NP נוגדן 1.1.3 (1:30 דילול) 16 והנוגדן אנטי-NP JUNV חד שבטי SA02-BG12 ממשאבי BEI (1:500 דילול) יכול לשמש לזיהוי של rLCMV וrCandid # 1 , בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 1 שעה, לשאוב את פתרון החסימה ולהוסיף 50 μl של הנוגדן הראשוני לתאים ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, לדלל את הנוגדנים משני בחסימת פתרון, ואז צנטריפוגות / פתרון חסימת נוגדנים במשך 15 דקות ב 3500 סל&quot;ד. פולינוגדן ארנבת משובט אנטי עכבר IgG FITC המשני לצורך זיהוי של נוגדנים חד שבטיים העיקריים היה בשימוש כדי להשיג תמונות שנצפו באיור 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1 שעה, לשאוב את הנוגדן הראשוני, לשטוף 3 פעמים עם 1X PBS, ומוסיף את הנוגדנים משני למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות דגירה 30 דקות, לשאוב את הנוגדנים משני ולשטוף 3 פעמים עם 1X PBS. התאים מוכנים כעת להיות שנצפה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לשניהם יקבעו את ההצלחה של הצלה וטיטרציה נגיפית על ידי ספירת מוקד יצירת יחידות למ&quot;ל (FFU / מ&quot;ל). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלה נגיפית r3LCMV וr3Candid # 1: מאז וירוסים אלה מבטאים שני גני כתב, שלהם מציל את יכול להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות ביטוי של GFP או ביטוי Gluc בTCS. חילוץ יכול להיות גם על ידי ביטוי של Gluc בTCS. כדי לכייל את וירוסי trisegmented, אנו עוקבים אחר צעדים 2.1 ל 2.1.4, לעומת זאת תאים לא צריכים בדואר קבוע כדי לקבוע הצלת ויראלי מוצלחת בגלל הביטוי של GFP. טיטרציה של הנגיף תיקבע על ידי ספירת FFU / מ&quot;ל. כדי לקבוע הצלת ויראלי מוצלחת על ידי ביטוי Gluc, ביטוי Gluc מTCS ניתן למדוד באמצעות ערכת assay Gluc (ערכת Biolux Gaussia לוציפראז assay, ניו אינגלנד Biolabs). לשם כך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μl של TCS לתוך צלחת 96 גם לבנה (צלחות microtiter תחתית שטוחות, פישר סיינטיפיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת luminometer (LumiCount, Packard Biosciences). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 - פתרון Assay Gluc μl 100 (כפי שהומלץ על ידי היצרן) לכל דגימה ולמדוד את ביטוי גן כתב Gluc עם luminometer. כביקורת שלילית, ביטוי Gluc של TCS מהווירוסים פראי מסוג התאים נגועים נמדד. </li></ol></li></ol> 3. מעבר של Supernatants תרבית רקמה הצלת ויראלי תלויה ביעילות transfection. תאי Vero הוכחויש יעילות transfection נמוכה יותר משורות תאים אחרות 14. אם titers הווירוס בTCS הם נמוך, להדביק תאי Vero טריים בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 0.01 (LCMV) או 0.1 (פספוסים # 1) 72 לשעה כדי להגביר את הנגיף.

<ol>
	<li>Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+determinant+of+attenuation+in+mice+of+the+Candid1+vaccine+for+Argentine+hemorrhagic+fever+is+located+in+the+G2+glycoprotein+transmembrane+domain.">The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain.</a> Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).</li><li>Barton, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+a+neglected+central+nervous+system+pathogen.">Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen.</a> Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).</li><li>Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenaviridae:+The+viruses+and+their+replication.">Arenaviridae: The viruses and their replication.</a> Fields' Virology. 2, 179201827 (2007).</li><li>Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenavirus+reverse+genetics:+new+approaches+for+the+investigation+of+arenavirus+biology+and+development+of+antiviral+strategies.">Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies.</a> Virology. 411, 416-425 (2011).</li><li>Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+lymphocytic+choriomeningitis+viruses+with+trisegmented+genomes+stably+expressing+two+additional+genes+of+interest.">Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).</li><li>Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation.">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).</li><li>Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+an+arenavirus+entirely+from+RNA+polymerase+I/II-driven+cDNA.">Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).</li><li>Gunther, S., Lenz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lassa+virus.">Lassa virus.</a> Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).</li><li>Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+case+definitions+for+Argentine+hemorrhagic+fever.">Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).</li><li>Isaacson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+hemorrhagic+fever+hazards+for+travelers+in+Africa.">Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).</li><li>Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+analysis+of+the+replication+complex+of+Old+World+arenaviruses+reveals+two+nucleoprotein+sites+involved+in+L+protein+function.">Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function.</a> Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).</li><li>Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NP+and+L+proteins+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV)+are+sufficient+for+efficient+transcription+and+replication+of+LCMV+genomic+RNA+analogs.">NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs.</a> Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).</li><li>Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+an+underdiagnosed+cause+of+congenital+chorioretinitis.">Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis.</a> American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).</li><li>Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+canine+RNA+polymerase+I-driven+reverse+genetics+for+influenza+A+virus:+its+application+for+H5N1+vaccine+production.">Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production.</a> Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).</li><li>Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases.">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).</li><li>Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+single-cycle+infectious+lymphocytic+choriomeningitis+virus+to+study+hemorrhagic+fever+arenaviruses.">Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses.</a> Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).</li><li>Rojek, J. M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+by+human+pathogenic+arenaviruses.">Cell entry by human pathogenic arenaviruses.</a> Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).</li><li>Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+of+cell+entry+by+human-pathogenic+Old+World+and+New+World+arenaviruses.">Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses.</a> Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).</li><li>Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+prototypic+Arenavirus+LCMV+entirely+from+plasmid.">Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid.</a> Virology. 350, 370-380 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הדור של Arenaviruses רקומביננטי באמצעות טכניקות גנטיקה הפוכות מבוססות פלסמיד הפך גישה בשימוש נרחב לחקירת היבטים שונים של הביולוגיה arenavirus. כאן אנו לתעד שיפור חיוני למערכת הנוכחית על ידי ביצוע arenavirus מציל בתאי Vero, המאפשר לדור הפוטנציאל של מועמדי חיסון ה-FDA נגד Arenaviruses ווקטורי חיסון נגד מחלות זיהומיות אחרות. הפרוצדורות המעורבות הן באופן כללי מבוססים היטב ולא צריכים להוות מכשולים משמעותיים. יש, עם זאת, מספר גורמים שצריכים להיות במעקב צמוד על מנת להבטיח הצלחה בקנה אחד. תחזוקה נכונה של תאי Vero היא חיונית להצלת ויראלי מוצלחת. בנוסף, קיים הכרח יש הכנות פלסמיד טובות ליצור arenavirus רקומביננטי (ראה פרוטוקול לתחזוקת תאים תקין והכנת הפלסמיד). להצלת rLCMV וrCandiד # 1 פראי סוג או גירסאות שלהם trisegmented מומלץ שלושה transfections עצמאי עבור כל וירוס רקומביננטי כדי להגדיל את הסיכוי של הצלה מוצלחת, כפי שאינם transfected תאי Vero בקלות 14. אם הצלת וירוס אחד או יותר רקומביננטי הוא ניסה, בקנה מידה בשלבים הבאים בהתאם למספר הווירוסים להצלה. כביקורת שלילית, אנו כוללים transfection בהעדר pCAGGS NP (NP-pCAGGS). מאחר ותאים נגועים #-1-LCMV וכנים לא להציג אפקט קלאסי cytopathic (CPE), הצלת ויראלי מוצלחת של טבע מסוג rLCMV וrCandid יש להעריך 1 # וירוסים באמצעות זיהוי של צאצאים זיהומית, אשר יכול להיעשות באמצעות קלאסי assay פלאק או באמצעות התאחדות. אנו ממליצים על השימוש בIFA על assay פלאק קלאסי משום לשעבר יכול להסתיים בתוך 24 שעות, במקום 5 - 6 ימים הנדרשים להתפתחות הפלאק. R3LCMV או r3Candid # 1 שניצל לקודד שני גני כתב (GFP וGluc), ובכך מאפשרים איתור וטיטרציה נגיפיים ללא הצורך של נוגדנים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (GFP) ו / או הארה (Gluc). כמו בהצלת רקומביננטי # חילוץ פראי סוג LCMV ופספוסים 1, הצלת וירוס trisegmented לא מוצלחת תגרום לחוסר תאי Vero ניאון על חיסון עם TCS מתאי transfected. בהתחשב בכך שמגזרי L S ומונעים על ידי אדם polyermase אני אמרגן, ניתן ליישם מערכת הצלה זו בתאים אנושיים אחרים. ואכן יש לנו גם נוצרו בהצלחה גם rLCMV פראי הסוג וtrisegmented רקומביננטי ו1 # rCandid וירוסים בתאי כליה עובריים אנושיים 293T ביעילות גבוהה. בנוסף, בtransfection monolayers הסלולרי הביאה גם הצלת וירוס, אם כי לא יעילה כמו כאשר transfecting תאי Vero ו293T בהשעיה. בכל הקשור לזיהוי של הצלה נגיפית LCMV ופספוסי # 1 פראי סוג, נוגדנים ראשוניים כנגד חלבונים נגיפיים אחרים יכולים לשמש גם. במקרה של וירוסי R3, אנו יכולים לזהות Gluc ידי הארה במקום ביטוי של GFP. לחלופין, גני כתב אחרים יכולים לשמש במקומו של Gluc וGFP 5. מערכת הצלת הווירוס שלנו הוכיחה להיות יעיל ביותר בידיים שלנו, וכאן אנו מספקים את תנאי transfection הטובים ביותר. מומלץ מאוד להשתמש בכמויות המצוינות של פלסמידים. אם הצלת וירוס מתבצעת בקווים אחרים אדם תאים, כמות התאים, DNA, ו / או LPF2000 צריך להיבדק. הדור של arenavirus wild-type וtrisegmented באמצעות גנטיקה הפוכה מבוססת פלסמיד בתאי Vero יאפשר, כמו גם ללימוד היבטים שונים של הביולוגיה של arenavirus לפיתוח העתידי של חיסונים ה-FDA ווקטורי חיסון.

Arenaviruses הם וירוסים אפפו עם bisegmented, הגנום RNA שלילי תקוע 3 ששייכים למשפחת Arenaviridae. הגנום מקודד arenavirus ארבעה חלבונים באופן ambisense משני מגזרים נגיפיים נפרדים 3. הקטע הגדול (L) מקודד RNA פולימראז RNA התלוי (L) וטבעת הקטנה (ניו ג&#39;ין ממש מעניינת) חלבון אצבע (Z) המשמשת ככוח המניע העיקרי של נגיף ניצנים. הקטע הקטן (S) מקודד nucleoprotein הנגיפי (NP) והמשטח גליקופרוטאין (GP) (איור 1). כמה מחברי משפחת Arenaviridae אחראים לקדחת מדממת קטלנית (HF) בבני אדם 3. חששות עיקריים הוא לסה וירוס (LASV) וJunín וירוס (JUNV), אשר ידועים כגורמי תמותה גבוהה בחולים מאושפזים 8, 9. למרות שהווירוסים האלה הם אנדמיים למערב אפריקה וארגנטינה הכפרית, בהתאמה,יש חששות גוברים של יבוא LASV וJUNV לאזורים שאינם אנדמיים עקב נסיעות עלו 10. בנוסף, למרות שבדרך כלל לא קשור למחלה קשה בבני אדם, arenavirus prototypic וירוס choriomeningitis ימפוציטית (LCMV) נחשב הפתוגן מוזנח כמו שיש כבר מקרים של זיהום קטלני בחולי מדוכאי חיסון 6, 15 והוא אחראי למומים מולדים מולדים והפלות ספונטניות בנשים בהריון 2, 13. כרגע אין בארה&quot;ב ה-FDA חיסונים נגד Arenaviruses וטיפול מוגבלים לnucleoside האנלוגי ribavirin, וזה רק יעיל באופן חלקי, ולעתים קרובות קשורות לתופעות לוואי משמעותיות. כניסתה של הפוך מבוסס פלסמיד גנטיקה 4 ודור של Arenaviruses רקומביננטי 7, 19 שהתקדמה מאוד בתחום מחקר arenavirus. נכון לעכשיו, תאי מכרסמים (כגון BHK-21) המשמשים לgenerזמני של Arenaviruses רקומביננטי בשל פולימראז העכברי RNA אני מינים הספציפיים (Pol-I) אמרגן בימוי התעתיק הראשוני של ה-S ומגזרי L. עם זאת הצלת וירוס בתאי BHK-21 הן לא שיטה שאושרה לדור של Arenaviruses רקומביננטי כמועמדי זרעי חיסון פוטנציאליים. כאן אנו לתעד את השימוש בPol-האמרגן האנושי להצלה יעילה של העולם הישן prototypic (OW) LCMV והעולם החדש (NW) מתח # 1 פספוסים JUNV בתאי Vero. שימוש במתודולוגיה דומה, אנחנו שנוצרנו רקומביננטי LCMV trisegmented (r3LCMV) ופספוסי # 1 (r3Candid # 1) Arenaviruses המכילים שני גנים המקודדים זרים נוספים בשני קטעי RNA S שונים 5. מערכת חדשה זו מתבקשת לא רק פרוטוקול לשעתק ופשוט מאוד אבל יכולה להיות מיושמת באופן מיידי בדור של Arenaviruses רקומביננטי כחיסון פוטנציאלי או זרעי וקטור חיסון.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material and methods</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Cell lines 
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 &deg;C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). 
 
Plasmids 
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 &deg;C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 &deg;C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 &deg;C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. 
 
Viruses 
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. 
 
Tissue culture media and solutions 
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 &deg;C. This media will be used for maintenance of Vero cells. 
 
Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 &deg;C. This media will be used during viral infections. 
 
10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 &deg;C. This is used as a blocking solution for IFA.
</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

generation of recombinant arenavirus for vaccine development in fda-approved vero cells

הפיתוח והיישום של arenavirus ההפוכה גנטיקה מהווה פריצת דרך משמעותית בתחום arenavirus 4. השימוש במערכות minigenome arenavirus מבוססי תאים יחד עם היכולת ליצור רקומביננטי Arenaviruses זיהומיות עם מוטציות שנקבעו מראש בגנום שלהם יש להקל את החקירה של התרומה של גורמים ויראליים לשלבים של מחזור החיים arenavirus השונים, כמו גם מארח וירוס אינטראקציות ומנגנוני פתוגנזה arenavirus 1, 3, 11. בנוסף, הפיתוח של Arenaviruses trisegmented התיר את השימוש בגנום arenavirus להביע גנים זרים נוספים של ריבית, ובכך פתח את האפשרות של יישומי וקטור חיסון מבוסס arenavirus 5. כמו כן, ההתפתחות יחידה במחזור Arenaviruses זיהומיות המסוגלים גני כתב מבטאים מספקת כלי ניסיוני חדש כדי לשפר את הבטיחות של מחקר מעורבת highly Arenaviruses אדם פתוגניים 16. הדור של Arenaviruses רקומביננטי באמצעות טכניקות גנטיקה הפוכות מבוססות פלסמיד הסתמך עד כה על השימוש בשורות תאי מכרסמים 7,19, אשר מהווה חלק ממחסומים לפיתוח של מזון והתרופות האמריקאי (FDA) ברישיון חיסון או וקטורי חיסון. כדי להתגבר על מכשול זה, אנו מתארים כאן הדור יעיל של Arenaviruses רקומביננטי בתאי Vero-FDA.

הצלה מוצלחת של arenavirus פראי סוג רקומביננטי תאושר על ידי הנוכחות של אנטיגנים נגיפיים באמצעות IFA (איור 5). במקרה של וירוסי trisegmented רקומביננטי, ניתן להעריך הצלת ויראלי מוצלחת על ידי התבוננות הביטוי של GFP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 6 א). חילוץ מוצלח יאושר עוד יותר על ידי הערכת ביטוי Gluc (איור 6). נציג תוצאות ממחישות את ההצלה המוצלחת של arenavirus פראי הסוג וtrisegmented התקבלו באמצעות הפרוטוקול שצוין לעיל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50662/50662fig1.jpg" /> איור 1. ארגון Arenavirus הגנום ומבנה virion. Arenaviruses הם וירוסי RNA, אפפו תחושה שלילית עם הגנום bisegmented 3. כל קטע משתמש באסטרטגית קידוד ambisense לכוון סינתזה של שתי protei ויראליNS בכיוון הפוך 3. הקטע (L) הגדול (7.2 קילו) מקודד את חלבון האצבע הקטן הטבעת (Z) שיש לו פונקציות כמו מטריקס, כולל הכוונה בתהליך נביטה 3 RNA תלוי-RNA-פולימראז (L). המגזר (S) הקטן (3.5 קילו) מקודד מבשר גליקופרוטאין (GPC) וnucleoprotein (NP). GPC הוא שלאחר translationally מעובד כדי לייצר GP-1 וGP-2, שמקשרים ליצירת מורכבת גליקופרוטאין (GP) שמהווים את הקוצים על פני השטח של מבנה virion האחראי להכרה קולט ותא כניסה 17, 18. NP encapsidates גנום רנ&quot;א הנגיפי (vRNA) ויחד עם חלבון צורת L את ribonucleoproteins הנגיפי (vRNPs), כי הם המרכיבים המינימאליים לשכפול ושעתוק 12 נגיפיים. IGR: אזור גניים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50662/50662fig2.jpg" /> איור 2. Arenavirus rescuפלסמידים דואר. תרשים של פלסמידים המשמשים לייצור arenavirus רקומביננטי בתאי Vero. pCAGGS ביטוי החלבון פלסמיד משתמש אמרגן β-אקטין עוף ו( PA) את רצפי אותות polyadenylation β-גלובין הארנב לכוון הסינתזה של L ויראלי ו4 NP, 7. CMV-IE משפר: ציטומגלווירוס מוקדם משפר מיידי. אינטרון: רצף אינטרון β-אקטין עוף. Hpol-אני משתמש בפלסמידים פולימראז האנושי אמרגן ורצפי שליחות קטלני פולימראז עכבריים לכוון הסינתזה של מגזרי רנ&quot;א הנגיפיים. שני pCAGGS ופלסמידים hpol-I הם אמפיצילין עמיד (Ampr). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50662/50662fig3.jpg" /> איור 3. . הצלת arenavirus פראי סוג וtrisegmented באליפסה השחורה הן פלסמידים הנדרשים לייצור רקומביננטי arenavirus פראי סוג: pCAGGS NP ו-L, וhpol-S ול &#39;אני וNP L הם דורשיםד ליזום שעתוק ושכפול נגיף. Hpol-S אני וסינתזת L ישירה תאית, דרך Pol-I, ומינים של S RNA antigenomic L. באליפסה האדומה הם פלסמידים הנדרשים לייצור Arenaviruses trisegmented: וכן pCAGGS NP ו-L, אני hpol-L פלסמיד, שהם זהים לאלו שתוארו עבור הצלת arenavirus פראי סוג. Hpol-S אני מופרד לשני פלסמידים: באחד פלסמיד, NP מוחלף עם GFP (hpol-S אני GFP / רופא משפחה) ובפלסמיד האחר, הוא הוחלף על ידי רופא המשפחה Gluc גן (hpol-S אני NP / Gluc ). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50662/50662fig4.jpg" /> איור 4. פרוטוקול הצלת Arenavirus. הצלת Arenavirus נעשה בתאי Vero באמצעות פורמט צלחת 6 באר. בקצרה, תאי Vero הם transfected בהשעיה ביום 1 באמצעות Lipofectamine 2000. ב24 שעות לאחר transfection, תקשורת מוחלפת בתקשורת זיהומיות טריות. תאי transfected מודגרת עבור<html> 48 שעות נוספות ולאחר מכן מוקטן לכדי 100 מ&quot;מ צלחות (יום 4). תאי Vero במנות מ&quot;מ 100 מודגרת עבור 72 שעות נוספות. ביום שלאחר transfection 7 TCS נאספים לגילוי נגיפי או על ידי IFA (rLCMV וrCandid # 1) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (r3LCMV וr3Candid # 1) הזיהום הבא בתאי Vero טריים. אם titers ויראלי הם נמוכים מהצפוי, יכול לשמש TCS להדביק תאי Vero טריים כדי להגביר את הנגיף. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50662/50662fig5.jpg" /> איור 5. אישור על הצלה. TCS ממעבר תא (100 מ&quot;מ צלחות) נגיפית פראי סוג מוצלחת משמש כדי להדביק תאי Vero טריים בצלחות 96, גם. ב24 שעות לאחר פגיעה, תאים קבועים, permeabilized, וחסמו לפני הצביעה עם נוגדנים ספציפיים # 1-LCMV או כנים. נוכחות של אנטיגנים נגיפיים הוא ציין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ברים סולם, 100 מיקרומטר. אוהל &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/50662/50662fig6.jpg" /> איור 6. הצלה מוצלחת של וירוסי trisegmented. רקומביננטי LCMV trisegmented (r3LCMV) ופספוסי # 1 (r3Candid # 1) לקודד גם GFP וGluc. הצלת ויראלי מוצלחת ניתן לקבוע במהירות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (). ביטוי גן כתב Gluc יכול לשמש כאישור המשני של הצלה נגיפית. אינדוקציה לקפל נקבעה על ידי נורמליזציה של ערכי הארה Gluc לנגיף פראי מסוג (ב &#39;). ברים סולם, 100 מיקרומטר. <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/50662/50662table1.jpg" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50662/50662table1highres.jpg" /> טבלת מס &#39;1. ריכוז ה-DNA Lipofectamine / פלסמיד להצלת arenavirus. DNA המומלץ וLPF2000 ריכוזים לדור של wil רקומביננטיArenaviruses D-type וtrisegmented בתאי Vero מצוין.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells at JoVE.com

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

generation-recombinant-arenavirus-for-vaccine-development-fda

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Views.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה ב?...

Video: Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard manufacturing. To achieve an effective protein-based subunit vaccine, the protein antigen often needs to adopt a native-like conformation. This is particularly important for pathogen-surface antigens that are membrane-bound proteins. Cell-free methods have been successfully used to produce correctly folded functional membrane protein through the co-translation of nanolipoprotein particles (NLPs), commonly known as nanodiscs. 
This strategy can be used to produce subunit vaccines consisting of membrane proteins in a lipid-bound environment. However, cell-free protein production is often limited to small scale (&lt;1 mL). The amount of protein produced in small-scale production runs is usually sufficient for biochemical and biophysical studies. However, the cell-free process needs to be scaled up, optimized, and carefully tested to obtain enough protein for vaccine studies in animal models. Other processes involved in vaccine production, such as purification, adjuvant addition, and lyophilization, need to be optimized in parallel. This paper reports the development of a scaled-up protocol to express, purify, and formulate a membrane-bound protein subunit vaccine. 
Scaled-up cell-free reactions require optimization of plasmid concentrations and ratios when using multiple plasmid expression vectors, lipid selection, and adjuvant addition for high-level production of formulated nanolipoprotein particles. The method is demonstrated here with the expression of a chlamydial major outer membrane protein (MOMP) but may be widely applied to other membrane protein antigens. Antigen effectiveness can be evaluated in vivo through immunization studies to measure antibody production, as demonstrated here.

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

This protocol describes using commercial, cell-free protein expression kits to produce membrane proteins supported in nanodisc that can be used as antigens in subunit vaccines.