Nous remercions les membres passés et présents dans JCT et laboratoires LM-S pour le développement et l&#39;amélioration des techniques de génétique inverse d&#39;arénavirus et plasmides. Nous remercions également Snezhana Dimitrova pour le support technique. L&#39;anticorps monoclonal dirigé contre JUNV NP (SA02-BG12) a été obtenu à partir de ressources BEI (NIAID biodéfense et Emerging Infections Resources Research Repository). BYHC a été soutenue par Nombre Grant GM068411 partir institutionnel Service Award Ruth L. Kirschstein national de recherche. EO-R est un Fullbright-Conicyt (BIO 2008) et un vaccin contre Rochester Fellowship (2012) destinataire. Soutien actuel EO-R est fourni par une bourse de recherche postdoctorale pour la diversité et l&#39;excellence académique de l&#39;Office de perfectionnement du corps professoral et de la diversité à l&#39;Université de Rochester. Research in LM-S laboratoire est financé par le NIH RO1 subventions AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, les Centres d&#39;excellence pour NIAID recherche sur la grippe et la surveillance (HHSN266200700008C), etL&#39;Université de Rochester Center for Modeling biodéfense immunitaire (HHSN272201000055C). La recherche au JCT laboratoire a été financé par des subventions SR1 AI047140, AI077719 SR1 et SR1 AI079665 du NIH.

1. Arenavirus Rescue transfection Notre système de sauvetage a été basée sur l&#39;utilisation des deux II plasmides d&#39;expression de la protéine de polymérase codant pour la nucléoprotéine (NP) et dépendante de l&#39;ARN-ARN-polymérase (L), les facteurs agissant en trans virales nécessaires à la réplication d&#39;ARN et de l&#39;expression des gènes du génome de l&#39;arénavirus 7, 19, et des plasmides capables de diriger la synthèse intracellulaire, par l&#39;intermédiaire du cellulaire d&#39;ARN polymérase I (pol-I), de la S et L espèces d&#39;ARN antigénomique 7. Dans nos études, nous utilisons l&#39;expression pCAGGS de protéines plasmide, qui utilise le promoteur β-actine de poulet et polyadenylanation des séquences de signaux (PA), et la pol-I humain plasmide, qui utilise la polymérase I humaine séquences promoteur et terminateur murins (Figure 2) . Le S et L segments d&#39;ARN sont clonées dans le plasmide HPOL-I dans une orientation anti-génomique pour permettre la génération de segments d&#39;ARN génomique lors de la transcription par HPOL-I. Pour le sauvetage de wild-type VCML recombinant (rLCMV) et franc # 1 (rCandid n ° 1) le pCAGGS NP et L de chaque virus ont été co-transfectées avec leur pol-I humain respective S et L segments d&#39;ARN (Figure 3). Génération de VCML recombinant trisegmented (r3LCMV) et franc # 1 (r3Candid n ° 1) a suivi un protocole similaire, mais le segment S a été scindé en deux plasmides S pol-I différents, chacun codant pour un gène rapporteur distinctif: dans l&#39;un, la lecture NP ouvert cadre (ORF) a été remplacé par la protéine (GFP) fluorescente verte de journaliste (HPOL-I S GFP / GP) et, dans l&#39;autre, le précurseur de la glycoprotéine virale (GPC) ORF est remplacé par le Gaussia luciférase (Gluc) du gène rapporteur (HPOL-I S NP / Gluc). Une représentation schématique du protocole est illustré à la figure 4. La transfection et le protocole d&#39;infection a été établi pour 6 puits de plaques chauffantes. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mélange: Préparer 250 pi de milieu OptiMEM et, selonsur la délivrance de virus, de 10 à 12 pg de LPF2000 (1 pg / pl) par transfection (tableau 1). Un ratio de 2,5 pg LPF2000 par pg d&#39;ADN est recommandée. Incuber pendant 5-10 min à température ambiante. Pendant ce temps, préparer le mélange de transfection plasmidique dans un tube à centrifuger séparé (étape 1.2). </li><li> Mélange de transfection d&#39;ADN plasmidique: Préparer le cocktail de transfection plasmidique dans un tube de centrifugation en utilisant les quantités recommandées pour chaque sauvetage de virus (voir tableau 1). Porter le volume final de 50 pi avec OptiMEM. </li><li> Mélange de plasmides OptiMEM-LPF2000-ADN: Ajouter 250 pi de la LPF2000 OptiMEM mélange (étape 1.1) dans le mélange de transfection d&#39;ADN plasmidique (étape 1.2). Incuber ce mélange pendant 20 - 30 minutes à température ambiante. Pendant ce temps préparer et compter 1 x 10 6 cellules Vero par réaction de la transfection. Les cellules Vero sont transfectées en suspension. </li><li> Préparation des cellules Vero: Vero cells sont cultivées dans des boîtes de 100 mm. Avant de commencer, mettre le PBS 1x, DMEM 10% FBS 1% des médias PS, et le mélange trypsine-EDTA à 37 ° C. <ol><li> Laver les cellules deux fois avec 5 ml de PBS 1x. </li><li> Trypsiniser cellules avec 1 ml de trypsine-EDTA et attendre jusqu&#39;à ce que les cellules détachement (environ 5 min). Doux écoutes peut-être nécessaire de détacher complètement les cellules de la vaisselle. </li><li> Soigneusement, remettre en suspension les cellules dans 10 ml de DMEM 10% FBS 1% PS dans un tube à centrifuger de 15 ml. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 1000 rpm dans une centrifugeuse. </li><li> Resuspendre les cellules dans 10 ml de DMEM 10% de FBS 1% PS et compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre, et ajuster la concentration de 1 x 10 6 cellules / ml. Il a été observé que 0.5 - 1 x 10 6 cellules Vero par transfection a produit les meilleurs résultats. </li></ol></li><li> Mélanger LPF2000/DNA et cellules: Après 20 - 30 min chambre d&#39;incubation de la température (étape 1.3), ajouter 1 ml de cellules Vero (1 x 10 6) (étape 1.4)le mélange de plasmides OptiMEM-LPF2000-ADN et incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Seed LPF2000/DNA-cell mélange dans 6 puits des plaques: Ajouter le mélange d&#39;ADN LPF2000-Vero (étape 1.5) dans les puits de la plaque de 6 puits. Secouer doucement le-bien-plaque 6 et laisser incuber la transfection de la nuit dans l&#39;incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Changer le milieu de transfection: Environ 16 à 24 h post-transfection, retirez le support de transfection, ajouter 2 ml de milieu d&#39;infection et incuber les cellules transfectées pour un 48 heures supplémentaires. </li><li> passage Cellulaire: Après 48 heures d&#39;incubation dans un milieu d&#39;infection, retirer le surnageant de culture tissulaire (TCS) et faire passer les cellules transfectées dans un plat 100 mm. Le TCS contient rarement virus infectieux parce que les cellules transfectées ont besoin d&#39;incubation supplémentaire pour générer des particules virales. Pour le passage de la cellule: <ol><li> Laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS 1x. </li><li> Trypsiniser cellules w<html> vec 0,5 ml de trypsine-EDTA et attendre jusqu&#39;à ce que les cellules se détachent. </li><li> Reprendre les cellules dans 1 ml de DMEM 10% FBS 1% PS dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 5000 rpm, 4 ° C dans une microcentrifugeuse. </li><li> A mélanger soigneusement les cellules dans 1 ml de milieu d&#39;infection et de transférer les cellules à un plat 100 mm. Amener au volume total de la plaque, avec des milieux infectieuses, à 8 ml, un volume suffisant pour empêcher le séchage des cellules ainsi que pour la concentration du virus. </li></ol></li><li> Secouer doucement le plat 100 mm et continuer l&#39;incubation de cellules Vero dans l&#39;incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 72 heures. </li><li> Collection de TCS: Après 72 heures d&#39;incubation, de recueillir le TCS dans un tube à centrifuger de 15 ml. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation pendant 5 min à 2500 tpm dans une centrifugeuse. Arénavirus infectieuses se trouve dans le TCS, donc enlever des débris culot cellulaire et stocker le TCS à -80 ° C. </li></ol>Le &quot;&gt; 2. Confirmation de recombinant Rescue Arenavirus La détection d&#39;un sauvetage réussi de rLCMV et rCandid n ° 1 est réalisée par une unité de formation de mise au point (FFU) de test d&#39;immunofluorescence (IFA). Pour le sauvetage de virus de type sauvage, nous utilisons des anticorps spécifiques pour le NP virale. Le r3LCMV et r3Candid # 1 codent deux gènes rapporteurs (GFP et Gluc), permettant ainsi la détection et la titration virale sans nécessité d&#39;anticorps par microscopie à fluorescence (GFP) et / ou de luminescence (Gluc). <ol><li> Confirmez type sauvage sauvetage arénavirus recombinant: Le jour avant le titrage, laver les cellules Vero deux fois avec PBS, trypsiniser et préparer des plaques à 96 puits pour atteindre 80 - 90% de confluence le lendemain (4 x 10 4 cellules / puits). Secouer doucement les plaques à la main pour obtenir une répartition uniforme des cellules. Culture des cellules, la nuit, dans les 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2. Vérifiez les cellules sous le microscope pour confirmer une monocouche, avant de procéder à l&#39;infection: <ol><li> Série diluer (10 dilutions) le virus contenant TCS récupéré à partir des cellules transfectées dans le plat 100 mm (étape 1.10) en OptiMEM. </li><li> Retirez le support à partir des cellules Vero ensemencées, laver deux fois avec 50 pi de PBS 1x et infecter les cellules avec 50 pl du virus dilué en série (étape 2.1). Infecter les cellules pendant 1,5 heure à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Après l&#39;infection, enlever l&#39;inoculum de virus, ajouter 100 ul de milieu d&#39;infection / puits et incuber les cellules pendant 16 à 18 h. Viral réinfection peut se produire après 18 heures d&#39;incubation, ce qui pourrait entraîner une surestimation des titres viraux. </li><li> A 16 - 18 heures après l&#39;infection, retirer le TCS de chaque puits et fixer les cellules avec 4% de formaldéhyde diluée dans du PBS 1X, pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Ensuite, retirez la solution de fixation et perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X-100 dilué dans du PBS 1X, pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution de perméabilisation, puis laver les cellules 3 fois wie 1x PBS. </li><li> Bloquer les cellules avec du sérum albumine bovine à 2,5% (BSA) dans du PBS 1X (solution de blocage) pendant 1 heure à température ambiante. Alternativement, les cellules peuvent être bloquées pendant une nuit à 4 ° C et a continué avec incubation d&#39;anticorps le lendemain. </li><li> Pendant ce temps préparer l&#39;anticorps primaire. Diluer les anticorps primaires # 1 spécifiques LCMV-et franc dans une solution de blocage, puis centrifuger l&#39;anticorps / solution de blocage pendant 15 min à 3500 rpm. L&#39;anti-LCMV NP clone d&#39;anticorps monoclonal 1.1.3 (01:30 dilution) 16 et l&#39;anticorps anti-NP JUNV monoclonal SA02-BG12 de ressources BEI (dilution 1:500) peut être utilisé pour la détection de rLCMV et rCandid n ° 1 , respectivement. </li><li> Après une heure d&#39;incubation 1, aspirer la solution de blocage et ajouter 50 ul de l&#39;anticorps primaire dans les cellules et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> A cette époque, diluer l&#39;anticorps secondaire dans une solution de blocage, puis centrifuger le / la solution de blocage d&#39;anticorps pendant 15 min à 3500 rpm. Le polyIgG anti-souris anticorps secondaire clonale de lapin FITC pour la détection des anticorps monoclonaux primaires a été utilisé pour obtenir des images observées sur la figure 5. </li><li> Après 1 heure d&#39;incubation, aspirer l&#39;anticorps primaire, laver 3 fois avec PBS 1x, et ajouter l&#39;anticorps secondaire pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Après 30 minutes d&#39;incubation, aspirer l&#39;anticorps secondaire et laver 3 fois avec PBS 1x. Les cellules sont maintenant prêts à être observé par microscopie de fluorescence à la fois déterminer le succès du sauvetage et de titrage viral en comptant le centre de formation d&#39;unités par ml (FFU / ml). </li></ol></li><li> r3LCMV et r3Candid n ° 1 de sauvetage viral: Depuis ces virus expriment deux gènes rapporteurs, leur sauvetages peut être contrôlée par microscopie à fluorescence pour détecter l&#39;expression GFP ou expression Gluc en TCS. Rescue peut aussi être confirmé par l&#39;expression de Gluc en TCS. Pour titrer les virus trisegmented, nous suivons les étapes 2.1 à 2.1.4, mais les cellules n&#39;ont pas besoin de be fixé pour déterminer une opération de sauvetage réussie virale en raison de l&#39;expression de la GFP. Le titrage du virus sera déterminée en comptant le FFU / ml. Pour déterminer sauvetage viral réussie par l&#39;expression Gluc, expression Gluc du TCS peut être mesurée à l&#39;aide d&#39;un kit de dosage Gluc (Biolux kit de dosage de luciférase Gaussia, New England Biolabs). À cette fin: <ol><li> Ajouter 100 ul de TCS dans une plaque blanche à 96 puits (plaques de microtitration à fond plat, Fisher Scientific). </li><li> Mettre en place le luminomètre (LumiCount, Packard Biosciences). </li><li> Ajouter 50 - 100 ul solution de dosage Gluc (tel que recommandé par le fabricant) pour chaque échantillon et de mesurer l&#39;expression du gène rapporteur Gluc avec le luminomètre. Comme témoin négatif, expression Gluc du TCS contre les virus de type sauvage cellules infectées a été mesurée. </li></ol></li></ol> 3. Passage de tissu surnageants de culture Sauvetage virale dépend de l&#39;efficacité de la transfection. Des cellules Vero ont été montrésd&#39;avoir des efficacités de transfection plus faibles que d&#39;autres lignées cellulaires 14. Si les titres de virus dans le TCS sont faibles, infecter des cellules Vero frais à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 0,01 (LCMV) ou 0.1 (Candid n ° 1) pendant 72 heures pour amplifier le virus.

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Génération d&#39;arénavirus recombinantes utilisant des techniques de génétique inverse à base de plasmides est devenu une approche largement utilisée pour l&#39;étude des différentes facettes de la biologie arénavirus. Ici, nous documentons une amélioration cruciale pour le système actuel en effectuant arénavirus sauvetages dans des cellules Vero, permettant la génération potentielle de vaccins candidats approuvés par la FDA contre arénavirus et des vecteurs de vaccins contre d&#39;autres maladies infe...

Arénavirus sont des virus enveloppés avec un bisegmented, génome à ARN brin négatif 3 qui appartiennent à la famille Arenaviridae. Le génome du code arénavirus quatre protéines dans un mode de ambisens de deux segments distincts virales 3. Le grand segment (L) code l&#39;ARN polymérase ARN-dépendante (L) et la petite ceinture (Really Interesting New Gene) de protéine à doigt (Z) qui sert de principale force motrice de bourgeonnement du virus. Le petit segment (S) codant pour la nucléoprotéine virale (NP) et la glycoprotéine de surface (GP) (Figure 1). Plusieurs membres de la famille Arenaviridae sont responsables de la fièvre hémorragique mortelle (HF) chez l&#39;homme 3. Principe préoccupations virus Lassa (LASV) et le virus Junin (JUNV), qui sont connus pour causer une forte mortalité chez les patients hospitalisés 8, 9. Bien que ces virus sont endémiques à l&#39;Afrique de l&#39;Ouest et l&#39;Argentine rurale, respectivement,il ya des préoccupations croissantes en matière d&#39;importation de LASV et JUNV vers des zones non endémiques en raison de l&#39;augmentation des voyages 10. En outre, bien que n&#39;étant pas normalement associée à une maladie grave chez l&#39;homme, l&#39;arénavirus prototype du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) est considéré comme un pathogène négligé car il ya eu des cas d&#39;infection mortelle chez les patients immunodéprimés 6, 15 et est responsable de malformations congénitales et des avortements spontanés chez les femmes enceintes 2, 13. Actuellement il n&#39;ya pas approuvés par la FDA américaine vaccins contre arénavirus et le traitement se limite à l&#39;analogue nucléosidique ribavirine, qui n&#39;est que partiellement efficace et souvent associé à des effets secondaires importants. L&#39;introduction d&#39;inverse à base de plasmides génétique 4 et génération de arénavirus recombinantes 7, 19 ont grandement fait progresser le domaine de la recherche sur arénavirus. Actuellement, les cellules de rongeurs (comme BHK-21) sont utilisés pour la généation des arénavirus recombinantes en raison de l&#39;ARN polymérase I murine spécifique à l&#39;espèce (pol-I) promoteur diriger la transcription initiale de la S et L segments. Cependant sauvetage du virus dans les cellules BHK-21 ne sont pas une méthode approuvée pour la production d&#39;arénavirus recombinantes comme candidats potentiels de semences de vaccins. Ici, nous documentons l&#39;utilisation du promoteur pol-I humain pour le sauvetage efficace de l&#39;Ancien Monde prototypique (OW) VCML et le Nouveau Monde (NW) JUNV Candid n ° 1 souche dans des cellules Vero. En utilisant une méthodologie similaire, nous avons généré VCML recombinant trisegmented (r3LCMV) et franc # 1 (r3Candid n ° 1) arénavirus qui contiennent deux gènes étrangers supplémentaires encodés en deux segments d&#39;ARN S différentes 5. Ce nouveau système résulte non seulement un protocole très reproductible et simple, mais peut être immédiatement mis en oeuvre dans la production d&#39;arénavirus comme vaccin recombinant potentiel ou de graines de vecteur de vaccin.

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 Cell lines 
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 &deg;C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). 
 
Plasmids 
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 &deg;C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 &deg;C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 &deg;C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. 
 
Viruses 
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. 
 
Tissue culture media and solutions 
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 &deg;C. This media will be used for maintenance of Vero cells. 
 
Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 &deg;C. This media will be used during viral infections. 
 
10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 &deg;C. This is used as a blocking solution for IFA.
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generation of recombinant arenavirus for vaccine development in fda-approved vero cells

L&#39;élaboration et la mise en œuvre des arénavirus génétique inverse représente une percée importante dans le domaine arénavirus 4. L&#39;utilisation de systèmes de minigénome arénavirus à base de cellules ainsi que la capacité à générer des arénavirus infectieuses recombinantes présentant des mutations prédéterminées dans leurs génomes a facilité l&#39;enquête de la contribution des déterminants viraux aux différentes étapes du cycle de vie d&#39;un arénavirus, ainsi que des virus-hôte interactions et les mécanismes de pathogénie arénavirus 1, 3, 11. En outre, le développement des arénavirus trisegmented a permis l&#39;utilisation du génome arénavirus à exprimer des gènes étrangers d&#39;intérêt supplémentaires, ouvrant ainsi la possibilité d&#39;applications de vecteurs vaccinaux arénavirus à base 5. De même, le développement des arénavirus infectieuses cycle unique capables de gènes rapporteurs exprimant fournit un nouvel outil expérimental pour améliorer la sécurité de la recherche impliquant highly pathogènes humains arénavirus 16. La génération des arénavirus recombinantes utilisant des techniques de génétique inverse à base de plasmides a reposé jusqu&#39;à présent sur ​​l&#39;utilisation des lignées de cellules de rongeurs 7,19, ce qui pose certains obstacles pour le développement de la Food and Drug Administration (FDA) sous licence vaccin ou vecteurs vaccinaux. Pour surmonter cet obstacle, nous décrivons ici la génération efficace de arénavirus recombinants dans les cellules Vero approuvé par la FDA.

Sauvetage réussi d&#39;un arénavirus de type sauvage recombinant sera confirmée par la présence d&#39;antigènes viraux utilisant IFA (Figure 5). Dans le cas des virus recombinants trisegmented, sauvetage virale réussie peut être évaluée en observant l&#39;expression de GFP par microscopie à fluorescence (figure 6A). Sauvetage réussi sera confirmée par l&#39;évaluation expression Gluc (figure 6B). Les résultats représentatifs illustrant le sauvetage réuss...

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Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Sauvetage d&#39;arénavirus recombinantes à partir des ADNc clonés, une approche appelée génétique inverse, permet aux chercheurs d&#39;étudier le rôle des produits spécifiques de gènes viraux, ainsi que la contribution de leurs différents domaines et les résidus spécifiques, à différents aspects de la biologie des arénavirus . De même, les techniques de génétique inverse dans les lignées cellulaires approuvé par la FDA (Vero) pour le développement d&#39;un vaccin fournit de nouvelles possibilités pour la production de vaccins sûrs et efficaces pour lutter contre les arénavirus pathogènes pour l&#39;homme.

Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K vues.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Sauvetage d'arénavirus recombinantes à partir des ADNc clonés, une approche appelée génétique inverse, permet aux chercheurs d'étudier le rôle des produits spécifiques de gènes viraux, ainsi que la contribution de leurs différents domaines et les résidus spécifiques, à différents aspects de la biologie des arénavirus . De même, les techniques de génétique inverse dans les lignées cellulaires approuvé par la FDA (Vero) pour le développement d&...