השימוש בווירוסים רקומביננטיים הוא טכנולוגיה רבת עוצמה הן כדי לפענח את מנגנוני השכפול הנגיפי והן כדי לספק פלטפורמות פיתוח לחיסונים. כמו כן, דור של מלאי ויראלי באיכות טובה הוא חיוני עבור כל מחקר ויראלי מן המחקר הבסיסי ביותר למחקרים יישומיים. הצלת וירוסים רקומביננטיים, קציר אופטימלי, הקפאה, ו titration של מניות RSV הן שיטות קריטיות עבור כל המחקרים הווירולוגיים.
הם עשויים להיחשב מסורתיים אך נשארים עדינים ודורשים מומחיות ספציפית. יום לפני ההמרה, להשעות BSR-T7/5 תאים במדיום מלא ב 0.5 מיליון תאים לריכוז מיליליטר. להפיץ שני מיליליטר של ההשעיה התא ל הבאר בצלחת שש באר.
דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני עד שהם מגיעים 80-90% confluency למחרת. כדי להציל כל וירוס, תחילה לערבב מופשר וקטורים גנטיקה הפוכה בצינור, ולאחר מכן להמשיך transfection, בעקבות פרוטוקול היצרן reagent transfection. לאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטרים של מדיום הסרום המופחת לווקטורים המעורבים.
בצינור אחר, לדלל 10 microliters של זה reagent transfection ב 250 microliters של מדיום סרום מופחת. בעדינות מערבולת שני הצינורות ולחכות חמש דקות. מערבבים את התוכן של שני הצינורות ומחכים 20 דקות בטמפרטורת החדר.
בינתיים, לשטוף את התאים BSR-T7/5 עם מיליליטר אחד של מדיום סרום מופחת ולהפיץ 1.5 מיליליטר של אנטיביוטיקה מדיה חיונית מינימלית חינם בתוספת 10% סרום עגל עוברי ל הבאר. במידת הצורך, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה של 20 דקות, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תערובת ההטרמפציה לתוך כל באר.
דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. כדי לפקח על יעילות החילוץ, התבונן ב-GFP פלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 20 פעם ביום. ביום השלישי של ההתפרות, תאי שריטה בכל באר של צלחת BSR-T7/5 מנודים שש בארות.
מעבירים תאים ועל-טבעיים של כל באר לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של שני מיליליטר. כדי לשחרר את הנגיף שחולץ ממברנות התא, מערבולת כל צינור במרץ לפחות 30 שניות. עבור ההגברה הראשונה של הנגיפים שניצלו, תחילה להסיר את מדיום התרבות מצלחת HEp-2 זרע יום קודם לכן, ולאחר מכן להוסיף במהירות 500 microliters לכל באר של המתלה הנגיפי מעבר אפס טרי.
מניחים את צלחת HEp-2 ב 37 מעלות צלזיוס על נדנדה נדנדה לתסיסה רכה במשך שעתיים. כדי לייצר את המעבר הראשון של הנגיפים שניצלו, השלך 500 מיקרוליטרים של האינוקולום והוסף שני מיליליטר של MEM עם 2% FCS. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים.
כדי לפקח על הזיהום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 20, התבונן בהגדלת GFP של תאי HEp-2 הנגועים בהשעיית מעבר אפס פעם ביום. תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, להתבונן במראה של סינקטיה קטנה וניתוק תאים, אשר משקף את האפקט הציטופתי RSV. כדי להגביר את הווירוסים שניצלו, תחילה לדלל את ההשעיה הנגיפית של MEM ללא FCS כדי לקבל השעיה של שלושה מיליליטר ב 50, 000 PFU למיליליטר, ולאחר מכן להסיר את המדיום מן הבקבוק HEp-2.
מוסיפים במהירות את ההשעיה הנגיפית של שלושת המיליליטרים ומדרגים את הבקבוק ב-37 מעלות צלזיוס על נדנדה לתסיסה רכה במשך שעתיים. הבא להסיר ולזרוק את inoculum ולהוסיף 15 מיליליטר של MEM עם 2%FCS. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד ארבעה ימים.
כדי להעריך את הזמן הנכון לקצור את הנגיפים, בדוק את מורפולוגיה התא פלואורסצנטי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה 20X. שים לב כי זה בדרך כלל כאשר 50%-80% של שכבת התא HEp-2 מנותק עקב אפקט ציטופתי RSV המתרחשת בין 48 ל 72 שעות לאחר ההדבקה. לאחר מכן לגרד את כל התאים באמצעות מגרד תאים.
לאסוף הן את התאים ואת supernatant יחד ולהעביר אותם צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. הוסף 1/10 של נפח פתרון שימור RSV 10X. Vortex הצינורות במרץ במשך חמש שניות צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 200 פעמים g כדי להבהיר את ההשעיה.
העבר את העל-טבעי לצינור של 50 מיליליטר. Vortex בקצרה aliquot ההשעיה בצינורות קריוגניים שכותרתו עם תגים עמידים בפני אלכוהול. טובלים את הצינור באלכוהול מקורר מראש, מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות ומאחסנים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי לבצע בדיקת טיטרציה פלאק, תחילה להפוך 2X מינימום חיוני בינוני על ידי דילול מסחרי 10X MEM עם מים סטריליים והוספת L-גלוטמין, 1, 000 יחידות לכל פניצילין מיליליטר, ומיליגרם אחד לכל סטרפטומיצין מיליליטר. לנער את הדילול במרץ ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 900 microliters של MEM ללא FCS לשישה צינורות. להפשיר את הווירוס aliquots ומערבולת אותם במרץ במשך חמש שניות.
כדי לבצע דילול סדרתי, תחילה להוסיף 100 microliters של הנגיף ל 900 microliters של המדיום בצינור הראשון. שים את הכובע על הצינור ומערבבים את תוכנו על ידי מערבולת במשך כמה שניות, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של הדילול הראשון ל 900 microliters של המדיום בצינור השני. שים את הכובע על הצינור והמערבולת.
חזור על הליך זה עד הצינור השישי. כתוב את שם הווירוס ואת הדילול המלא על HEp-2 12 צלחות באר. הוסף סימן כדי להתאים את הצלחת ואת הכיסוי שלה כי הם עשויים להיות מופרדים במהלך הכתם.
מוציאים את המדיום מהצלחות ומפיצים 400 מיקרוליטרים של דילול אחד ל באר. הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עבור סחוף וירוסים. במהלך ההספח וירוס, להכין את שכבת-על תאית microcrystalline על ידי התאמת ה- pH של MEM 2X סביב 7.2 עם פתרון סודיום ביקרבונט סטרילי ב 7.5% בעקבות מחוון הצבע.
כדי להשיג 100 מיליליטר של כיסוי, להוסיף 10 מיליליטר של MEM 2X, 10 מיליליטר של 2.4% השעיה תאית monocrystalline, ו 80 מיליליטר של MEM בתוספת 2%FCS ומערבבים במרץ. בסוף הדגירה בת השעתיים, הוסיפו שניים עד שלושה מיליליטר של כיסוי לכל באר של צלחות 12 בארות מבלי להסיר את האינוקולום. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שישה ימים.
כדי להכתים את התאים בתווית סגולה גבישית, ראשית לנער בעדינות את הצלחות כדי להוריד את כיסוי תאית microcrystalline. הסר את supernatants ולשטוף את התאים פעמיים עם 1X PBS, ולאחר מכן להוסיף אחד עד שני מיליליטר של הפתרון סגול גביש ולחכות 10 עד 15 דקות. הסר את הפתרון, אשר ניתן לעשות בו שימוש חוזר עבור כתם צלחת הבאים.
לבסוף לחשב את titers וירוס כשבר של מספר לוחות גלויים בארות של הלוחות היבשים ואת נפח inoculum ואת הדילול. ביצוע הסתערות פלאק על השליטה השלילית, מעודף רק עם פלסמידים הביטוי של N, P, L, ו M2-1 גילה שום פלאק בדילול הנמוך ביותר. הטיטרים שהתקבלו מהתאים המפוסכים היו צפויים להיות מעל 100 PFU למיליליטר אם ההצלה הייתה יעילה.
הטיטרים גדלו במעברים כדי להגיע למיליון עד 10 מיליון PFU למיליליטר במעבר אחד או שניים. הודות לווירוסים פלואורסצנטיים אלה, ניתן לראות ולמדוד בקלות עיכוב של ביטוי RSV על ידי siRNA המתמקד בחלבון N ובחלבון התאי IMPDH. לעומת זאת, אות GFP חזק על תאי בקרה מומרים עם siRNA שאינו מיקוד או תאים מומרים עם siRNA נגד החלבון התאי GAPDH נצפה ונמדד.
כמו כן וירוסים אלה אפשרו תצפית קלה של עיכוב של כפל RSV על ידי תרכובת סמים אנטי ויראלית. מעקב אחר החלבון הפלואורסצנטי M2-1 בתאים נגועים HEp-2 הראה IBs וגרגרי IB הקשורים כמבנים דינמיים מאוד. IBs נצפו כמבנים ניידים וספירתיים מסוגלים להתיך ו ליצור תכלילים כדוריים גדולים יותר.
גרגירי IB הקשורים עברו מחזורי פירוק הרכבה רציפים עם היווצרות גרגירי IB קטנים שצמחו, התמזגו לגרגרי IB גדולים הקשורים, ואז נעלמו. הפרוטוקול של טיטריון פלאק של RSV באמצעות שכבת-על תאית microcrystalline עשוי להיות מותאם בקלות לתאים אחרים ו /או וירוסים אחרים. זה ידרוש התאמת הריכוז של תאית microcrystalline.
