אנו מודים מרקוס טאלי, נתן רועי, כריסטופר זיגלר, אמילי ברוס, ובנימין המלך לדיונים מועילים לבין המכון הלאומי לבריאות לתמיכה במחקרים אלה באמצעות מענקים T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), ו P20RR021905 (JB) .

הערה: זה קריטי, כי הפרוטוקול המתואר להתבצע באמצעות טכניקה מראש PCR קפדנית (ראה 28 עבור סקירה מצויינת על איך להקים מעבדה טרום PCR וכיצד לבצע ניסויים באמצעות טכניקה מראש PCR טוב). זה הכרחי כי כל חומרים כימיים וציוד חופשיים של DNA מוגבר המכיל את רצף היעד qPCR וכי הבקרות המתאימות נמצאים במקום כדי לזהות זיהום כזה. סקירה כללית של פרוטוקול מוצג באיור 1. 1. כן מדיה תאי זרע צלחות 48-היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל של מדיום הנשר שונה של שלמה Dulbecco (DMEM) המכיל בסרום שור 10% עוברית, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו -1% HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-אתאן חומצה sulfonic) פתרון חיץ על ידי הוספת 50 מ&quot;ל של בסרום שור העובר מומת חום 5 מ&quot;ל כל אחד פתרון חיץ פניצילין, סטרפטומיצין ו 100x HEPES 100x כדי בקבוק 500 מ&quot;ל של DMEM. ניתן לאחסן מגיב זה ב 476; C במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 2.5 x 10 4 תאים Vero E6 לכל היטב צלחת תרבות 48-היטב רקמות בנפח סופי של 500 μl של שלמה DMEM. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO 2 עבור 10 עד 18 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים הצליחו בסוף יום העבודה. בדוק מדגם וירוס בבארות ומשכפלים או בשלושה עותקים. הערה: בעוד פלטפורמה 48-ומבוססת עבור assay זה מתואר, זה צריך להיות אפשרי כדי לשנות את גודל assay למטה לשימוש צלחות 96 או 384 גם. </li></ol></li></ol> 2. לבצע Attachment תאי וירוס הערה: וירוס בשימוש בפרוטוקול זה, זן JUNV פספוסים 1 # (C # 1), שימש בהצלחה כחיסון מוחלשים חי למניעת JUNV המחלה 29. JUNV C # 1 נגזר XJ הארסית זן JUNV דרך מעבר סדרתי היא in vivo ו במבחנה נבדל זן XJ הורי על ידי 12 חומצות אמינו 30. becausדואר JUNV C # 1 רמת biosafety (מנהלת ליגה) הפתוגן -2 מדורג, העבודה המתוארת עבור סעיף זה חייבת להתבצע באמצעות 31 שיטות BSL-2 מתאימות. זה כולל שימוש בציוד מגן אישי (הגנה וחקר עיניים למשל, מעייל מעבדה, כפפות כפולות), ארון בטיחות ביולוגי בכיתה שנייה, וכן להבטיח כי כל האנשים קבלו הודעה כוללת הכשרה ואישורים המוסדיות נדרשים להתמודד האורגניזם הזה בשלום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מדגם # 1 JUNV C (ים) להיבדק אל PFUs הרצוי או להתמקד יחידות להרכיב DMEM המלא קר כקרח ולאחסן על קרח עד מוכן להוסיף היטב כל אחד. הערה: כחלופת ביצוע המחקרים המחייבים בוירוס המדולל השלם DMEM, להשתמש מדיום מינימאלי המכיל PBS עם ריכוז בסרום מופחת (2%) ו מאגר מתאים כדי לקבוע אם בסרום עלול לגרום להפרעות עם קובץ מצורף וירוס. פרוטוקולים מצורפים דומים לאיתור וירוסי אלטרנטיבה דיווחו שימוש בינוני RPMI 1640 ללא bicarboנייט המכיל אלבומין 0.2% שור, 10 מ&quot;מ (2- (morpholino) חומצה ethanesulfonic), ו 10 HEPES מ&quot;מ, pH 6.8 32. תקשורת מחייבת זה יכול להיות מעולה כדי למנוע שינויי pH שעלולה להתרחש כאשר התקשורת יוסרה -environment CO 2 של החממה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן בארות עם PFUs הנעות בין 200 ל -2,000 להגביל אירועים מצורפים פרודוקטיבי. כפי שניתן לראות בתרשים 2, assay זה הוא מסוגל לאתר מצורף באמצעות כמה כמו 20 PFU (או רבים ככל 2 x 10 6 PFU). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מיקס מאסטר של וירוס עבור חיסון על תאים. כל מדגם וירוס יהיה מחוסן על בארות כפולות בהיקף של 50 μl לכל טוב. לכן, אם התוספת של 2,000 PFUs של וירוס לכל טוב היא רצויה, לדלל 4,800 PFUs לתוך בנפח כולל של 120 μl של קרח קר להשלים DMEM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלוט על הספציפיות של assay, להשתמש זוג תואם של שורות תאים שחלה של אוגר סיני, כי אם לא להביע TfR1 (TRVb) או express hTfR1 (TRVb-1) כקובץ מצורף JUNV לתאים אלה צריך גם להיות מופחת או לא, בהתאמה 13,33. לחלופין, לטפל בתאים עם פרוטאז כגון K proteinase למנוע מצורף arenavirus 34 או כניסה 35. מסיסים hTfR1 או ch128.1 נוגדן monocolonal, שהוא ספציפי עבור hTfR1, יכול להיחשב גם כפי שהם ידועים כדי לחסום כניסת JUNV לתאים 13,36. בנוסף, טיפול מקדים של תאים עם מנוז חינם 14 או דגירה של חלקיקים עם נוגדנים מנטרלים ספציפי JUNV 37 יכול לעכב כניסת וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב, עם זאת, כי ריאגנטים אלה אחרונים וגישות, למרות חסימת כניסת JUNV, שלא אושרו לחסום מצורף, אם כי זה הוא הסבר סביר. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לקבוע באופן רשמי אם מצורף virion השפעה הגישות השונות הללו. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור צלחות מן 37 ° C החממה וכל אחד מהמקומות במקרר 4 ° C. או על קרח למשך 15 דקות כדי לעכב את היכולת של התאים מצופה לבצע אנדוציטוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לשאוב DMEM המלא מכל טוב ובמהירות לשטוף היטב כל פעמים באמצעות 100 μl של קרח הקר PBS (בופר פוספט) pH 7.4. לאחר מכן להוסיף 50 μl של הדגימות מראש מדולל הווירוס (מוכנות בשלב 2.1) על הבארות המתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים את הצלחת בניילון נצמד ומכניסים מיד או חזרה על קרח או במקרר 4 ° C. עבור 1 עד 1.5 שעות כדי לאפשר התקשרות וירוס להתרחש. שמור את הצלחת, לשטוף חיץ, ו דגימות נגיף קר על 4 מעלות צלזיוס במשך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הדגירה 4 ° C., לשאוב את הבידוד וירוס ולשטוף היטב כל 3 פעמים עם 200 μl של PBS קר כקרח. </li></ol> 3. ויראלי RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר רנ&quot;א נגיפי מ JUNV C # 1 חלקיקים מצורפים monolayers באמצעות הערכה המסחרית (למשל, ערכת RNeasy מיני) אקורדינג הפרוטוקול של היצרן. באופן ספציפי, בצע את &quot;הטיהור של RNA הכולל תאים של בעלי חיים באמצעות פרוטוקול טכנולוגית ספין&quot; בעמודים 23-28 בחוברת מיני RNeasy (4 מהדורת ה, אפריל 2006) בשינויים המפורטים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים כמצוין בשלב 1B ידי הוספת 350 μl של RLT חיץ תמוגה ישירות היטב כל אחד. מערבבים את החיץ מספר פעמים על מנת להבטיח תמוגה התא. שים לב תאים בקלות lyse במאגר זה תמוגה המלא ניתן לאמת על ידי הצגת בארות תחת מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את lysate התא וכתוצאה מכך לעמודת ערכה (3a הצעד) ובצע את שאר הפרוטוקול כמתואר. בשלב זה, הנגיף נוטרל על ידי חיץ תמוגה לכן השלבים הנותרים של הפרוטוקול יכול להיעשות מחוץ לארון biosafety בכיתה השני ספקו צינורות הערכה לא היו מזוהמים וירוס מדבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול את השלב האופציונלי 9 מתוך הפרוטוקול של היצרן, המהווה additצנטריפוגה ional של הטור לסיבוב כדי לחסל כל שריד אפשרי של הצפת הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב האחרון פרוטוקול של היצרן (שלב 10), elute רנ&quot;א מטוהרים מהעמודה ספין באמצעות 30 μl של DDH nuclease ללא 2 O. RNA חנות ב -80 ° C, בשלב זה או להשתמש ישירות assay qRT-PCR. כדי למנוע הידרדרות של דגימות רנ&quot;א נגיפי מטוהרים ידי nucleases, להשתמש ריאגנטים nuclease ללא וציוד ולשמור דגימות רנ&quot;א מופשר על הקרח. הערה: חוצצי RLT ו RW1 מכילים מלח guanidine ולא צריך להיות מעורב עם אקונומיקה. הצפת RW1 מכיל אתנול. </li></ol></li></ol> 4. qRT-PCR מדידה של הגנום הויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמיר RNA קטע S # 1 JUNV C לתוך cDNA עבור qPCR הבאים, לייחד רנ&quot;א נגיפי (שנוצר בשלב 3.1.4) כדי RT בנפח כולל של 50 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את תגובת RT, ראשון ליצור תערובת אמן המכילה כל אחד ריאגנטים הבאים לכל תגובה: 6.75 μl של nuclease-חינם DDH 2 O, 5 μl של המניה 2 מיקרומטר של S פריימר RT 2098- ל 2075- (5&#39;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 &#39;), אשר הוא משלים באזור NP של RNA הגנומי קטע S, 5 μl של 10X PCR חיץ השנייה, 11 μl של פתרון 25 מ&quot;מ MgCl 2, 1.25 μl (62.5 יחידות) של האנזים RT, 1 μl (0.4 יחידות) של מעכב RNase, ו -10 μl של 500 מיקרומטר המניות של dNTPs. הערה: במהלך שכפול arenavirus, 4 מינים רנ&quot;א נגיפי S קטע נוצרות: א RNA הגנומי באורך מלא (vRNA) חברה RNA באורך מלא antigenomic (vcRNA) (כי הוא המשלים השני של vRNA), ושני mRNAs subgenomic קידוד גני NP ו- GP, בהתאמה. פריימר RT הרשום כאן הוא ספציפי רק עבור מקטע S vRNA, אך לא את vcRNA, NP mRNA, או GP mRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבבים את תערובת מאסטר RT ואז aliquot 40 μl לתוך צינורות 0.2 מ&quot;ל PCR בודדים. הוסף 10 μl של רנ&quot;א נגיפי על צינור אחד. כלול i) לא צינור מלא תבנית (למשל. להוסיף 10 μl של nuclease ללא DDH 2 O עד 40 μl של מיקס מאסטר) ו ii) אין שליטה האנזים RT (למשל להוסיף 10 μl של מדגם רנ&quot;א נגיפי ידוע חיובי עד 40 μl של תמהיל אמן שלא קיבלו כל אנזים RT) למסך זיהום של חומרים כימיים RT עם DNA מוגבר המכיל את רצף היעד ויראלי. כלול RNA חילוץ מתאי נגוע עם מיקס מאסטר מלא RT לשלוט על סגוליות assay בנוכחות RNA הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, כולל מדגם רנ&quot;א נגיפי ידוע חיובי מיקס מאסטר המלא לאימות האיכות של ריאגנטים RT. ראוי לציין, כי היקף התגובה RT ניתן להפחית עד 25 μl במידת הצורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא צינורות RT לתנאי האופניים הבאים: 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 48 ° C למשך 30 דקות, ו 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שים לב ניתן לאחסן דגימות ב -20 ° C, בשלב זה או שמשאירים אותה כל הלילה את thermocycler על ידי הוספת שלב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perform qPCR בנפח כולל של 25 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מאסטר qPCR על ידי שילוב של הבאים: 2.5 μl (מלאי 9 מיקרומטר) של כל פריימר PCR קדימה S1937 + כדי 1958+ (5&#39;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 &#39;) הפוכה PCR פריימר S 2001 ל 1982- (5 &#39;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&#39;), 2.5 μl (של המניה 2 מיקרומטר) של S החללית qPCR 1960+ כדי 1975+ (5&#39;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 &#39;), ו -12.5 μl של המאסטר 2X אוניברסלי qPCR לְעַרְבֵּב. ראוי לציין, כי פריימר קדימה דיווחו כאן, שהוא ספציפי עבור JUNV C # 1, שונה על ידי 1 NT מהרצף פריימר דווח במקור 38, אשר מטרות JUNV זן ארסי רומרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבבים את הפתרון ולאחר מכן להוסיף 20 μl לכל qPCR היטב. הוסף 5 μl של כל תגובת RT על בארות qPCR המתאימות. לנהל qPCR בשלושה עותקים עבור כל דגימה הנבדקת. ראוי לציין, כי עוצמת התגובה PCR יכול להיות מופחת מעט ככל 12.5 μl במידת הצורך. הערה: התוכנה קשורההמכונה qPCR יפיק מספרי עותק מוחלטים של RNA הגנומי JUNV C # 1 קטע S ידי עריכת השוואה בין הערך של כל מדגם לא ידוע על שורה של דילולים רמים פלסמיד המקודד את גן JUNV C # 1 NP, המהווה את היעד של פריימר qPCR ו חללי להגדיר. את assay qPCR יכול לספק quantitation רק עבור ערכים ליפול בטווח של עקומת סטנדרט. מסיבה זו, כוללים את כמויות פלסמיד הבאים (בבארות בשלושה עותקים): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, ו -5 x 10 7 עותקים לכל טוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת qPCR לתוך thermocycler ולהפעיל את תנאי התגובה הבאים: 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולנתח את הנתונים כדי לקבוע את הכמות הנוכחית רנ&quot;א נגיפי כל דגימה על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקים עקומת סטנדרט באמצעות מדגם חדש מטוהר של פלסמיד המכיל את זפת qPCRלקבל רצף, יש לקבוע תחילה את מספר עותק פלסמיד בפתרון זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את המשקל המולקולרי של הפלסמיד. אם הרצף של פלסמיד כולו ידוע, לחשב זה באמצעות הנוסחה הבאה: MW = ([A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13). זכור לכלול את המספר הכולל של נוקלאוטיד מסוים נמצא על כל גדיל של פלסמיד גדילים הכפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הגודל של פלסמיד ידוע אבל הרצף המדויק שלה הוא לא, לחשב את MW בהנחה שכל זוג בסיס dsDNA יש MW 600. הערה: הפלסמיד NP pCAGGS-JUNV C # 1 משמש כאן יש MW של 4.2 x 10 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר MW של פלסמיד נקבע, לחשב כמה עותקים רבים לכל μl נוכחי הפתרון פלסמיד מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית לחשב את מיקרוגרם הכולל של פלסמיד בתמיסה, ולאחר מכן להמיר את זה כדי שומות של פלסמיד (למשל אם 69 מיקרוגרם של פלסמיד כלול 300 μl של מים, אז 6.9 x 10 -5 גרם של פלסמיד * 1 חפרפרת / 4.2 x 10 6 גרם של פלסמיד = 1.6 x 10 -11 שומות של פלסמיד), אשר ניתן להמיר להעתיק מספר (למשל 1.6 x 10 -11 שומות של פלסמיד * 6.022 x 10 23 מולקולות / שומה = 9.8 x 10 12 מולקולות (או עותקים)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את העותקים הכולל של פלסמיד הפתרון פלסמיד על ההיקף הכולל של שהפתרון לקבל עותקים לכל μl (למשל 9.8 x 10 12 עותקים / 300 μl = 3.28 x 10 10 עותקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון הזה כראוי כך 5 כרכים μl ניתן לטעון לצלחת PCR כדי לספק את טווח המספרים עותק נדרש כדי ליצור עקומת סטנדרט. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Arenaviridae. , 331-373 (1993).</li><li>Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+reservoirs+of+arenaviruses.">Mammalian reservoirs of arenaviruses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).</li><li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+50.">Ch. 50.</a> Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).</li><li>Parodi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sobre+la+etiologia+del+brote+epidemico+de+Junin+(Nota+previa).">Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa).</a> Dia Medico. 30, (1958).</li><li>Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lassa+fever,+a+new+virus+disease+of+man+from+West+Africa.+I.+Clinical+description+and+pathological+findings.">Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).</li><li>Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).</li><li>Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+emerging+fetal+teratogen.">Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).</li><li>Fischer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation.">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).</li><li>Palacios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases.">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).</li><li>Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenaviruses:+genomic+RNAs,+transcription,+and+replication.">Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).</li><li>Meyer, B. J., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+heterogeneity+in+the+termini+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+genomic+and+antigenomic+RNAs.">Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs.</a> J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10, e0120043 (2015).</li><li>Radoshitzky, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+receptor+1+is+a+cellular+receptor+for+New+World+haemorrhagic+fever+arenaviruses.">Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses.</a> Nature. 446, 92-96 (2007).</li><li>Martinez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+human+DC-SIGN+and+L-SIGN+for+entry+and+infection+of+host+cells+by+the+New+World+arenavirus,+Junin+virus.">Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).</li><li>Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Junin+arenavirus+cell+entry.">Characterization of Junin arenavirus cell entry.</a> J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).</li><li>Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+cellular+proteins+in+Junin+arenavirus+entry.">Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry.</a> Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).</li><li>Nunberg, J. H., York, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Curious+Case+of+Arenavirus+Entry,+and+Its+Inhibition.">The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition.</a> Viruses. 4, 83-101 (2012).</li><li>Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).</li><li>Klaus, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+cargo+receptor+ERGIC-53+is+required+for+the+production+of+infectious+arenavirus,+coronavirus,+and+filovirus+particles.">The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles.</a> Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).</li><li>Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+entry+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus.">Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).</li><li>Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+screen+for+genes+that+affect+Junin+virus+entry+uncovers+voltage-gated+calcium+channels+as+a+therapeutic+target.">siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target.</a> Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).</li><li>Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+superinfection+of+Vero+cells+persistently+infected+with+Junin+virus.">Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus.</a> Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).</li><li>Brandenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+poliovirus+entry+in+live+cells.">Imaging poliovirus entry in live cells.</a> PLoS Biol. 5, e183 (2007).</li><li>Petersen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Major+Cellular+Sterol+Regulatory+Pathway+Is+Required+for+Andes+Virus+Infection.">The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection.</a> PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+studies+of+virus+interaction+at+the+host+cell+surface+using+enteroviruses+and+real-time+PCR.">A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR.</a> Virol J. 6, 217 (2009).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+attachment+mediated+by+apolipoprotein+E+binding+to+cell+surface+heparan+sulfate.">Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate.</a> J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).</li><li>Shannon-Lowe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus-induced+B-cell+transformation:+quantitating+events+from+virus+binding+to+cell+outgrowth.">Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth.</a> J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).</li><li>Mifflin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+up+a+PCR+laboratory.">Setting up a PCR laboratory.</a> CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).</li><li>Maiztegui, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+live+attenuated+vaccine+against+Argentine+hemorrhagic+fever.+AHF+Study+Group.">Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group.</a> J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).</li><li>Goni, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+attenuated+Junin+virus+vaccine+strain+candidate.">Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate.</a> Virus Genes. 32, 37-41 (2006).</li><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).</li><li>White, J., Matlin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fusion+by+Semliki+Forest,+influenza,+and+vesicular+stomatitis+viruses.">Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses.</a> J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).</li><li>McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+human+transferrin+receptor+cDNA+in+Chinese+hamster+ovary+cells+deficient+in+endogenous+transferrin+receptor.">Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor.</a> J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).</li><li>Borrow, P., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-binding+protein(s):+a+candidate+cellular+receptor+for+the+virus.">Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus.</a> J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).</li><li>Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cellular+receptors+for+the+South+American+hemorrhagic+fever+viruses+Junin,+Guanarito,+and+Machupo.">Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo.</a> 346. , 476-491 (2006).</li><li>Helguera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+recognizing+the+apical+domain+of+human+transferrin+receptor+1+efficiently+inhibits+the+entry+of+all+new+world+hemorrhagic+Fever+arenaviruses.">An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses.</a> J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).</li><li>Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+monoclonal+antibodies:+characterization+and+cross-reactivity+with+other+arenaviruses.">Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses.</a> J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Helenius, A., Marsh, M., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Semliki+forest+virus+penetration+by+lysosomotropic+weak+bases.">Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases.</a> J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).</li><li>Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion+and+nucleocapsid+delivery+into+the+cytoplasm+are+distinct+events+in+some+flaviviruses.">Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses.</a> PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול אנו מתארים הוא פשוט וחזקים בתנאי השיקולים הקריטיים הבאים הם נצפו. ראשית, טכניקה מראש PCR קפדנית חייבת להיות מועסקת (ראה 28 לבחינה מעולה). זה הכרחי כי כל חומרים כימיים וציוד חופשיים של DNA מוגבר המכיל את רצף היעד qPCR וכי הבקרות המתאימות נמצאים במקום כדי לזהו?...

Arenaviruses הם משפחה של מעטפת, וירוסים RNA חד-גדילי שנשמרים בעיקר במכרסמים בטבע 1-3. בעוד וירוסים אלה בדרך כלל להקים זיהום אסימפטומטית, עיקש במאגרי מכרסם 1,2, הם יכולים לגרום למחלות קשות בבני אדם 3. מיני פתוגניים חשובים לכלול את וירוס העולם החדש חונין ​​(JUNV) 4 ואת העולם הישן לסה הווירוס 5, אשר הם סוכני האטיולוגי של קדחת מדממת ארגנטינית בדרום אמריקה קדחת לסה באפריקה, בהתאמה. וירוס choriomeningitis לימפוציטית (LCMV), וירוס אב הטיפוס של המשפחה 6, נפוץ ברחבי עולם ואחראי על מגוון של מצב מחלה כולל דלקת קרום מוח אצל אנשים עם מערכת חיסון תקין 6, למומים מולדים חמורים בעובר 7 מתפתח, או קטלנית גבוה immunosuppressed אנשים הבאים 8,9 השתלה מוצק איברים. חוסר ארצות הבריתמזון ותרופות (FDA) -approved חיסונים או antivirals היעילה להילחם וירוסים אלה מדגישים את הצורך הקריטי לפתח אסטרטגיות רומן למקד אלה מתעוררים / מחדש המתעוררים פתוגנים טיפוליים. הגנום arenavirus מורכב משני המגזרים RNA חד-גדילי, גדול (L) (~ 7.2 kb) וקטנים (S) (~ 3.6 kb) מגזרי 10. מגזר S המקודד את nucleoprotein ויראלי (NP) ו גליקופרוטאין המעטפה (GP) בעוד קטע L מקודד פולימראז ויראלי (L) וחלבון מטריקס (Z). The L ומגזרי RNA S גנומי (vRNAs) ארוזים לתוך virions 10-12. השלב הראשוני של זיהום arenavirus הוא מצורף של חלקיקים נגיפיים לארח התאים דרך אינטראקציה בין GP ויראלי קולטני התא המארח המתאים אשר עבור JUNV, כולל קולטן transferrin האדם 1 (hTfR1) 13,14. בעקבות עיקול, חלקיקים JUNV נלקחים לתוך התא באמצעות אנדוציטוזה בתיווך clathrin 15.חלקיקים אז תנועה אל אנדוזום מאוחר שבו pH הנמוך של תא זה מעורר את ההפעלה של GP 16,17. לאחר ההפעלה, מוסיף פפטיד היתוך בקידוד GP לתוך קרום endosomal, ייזום היתוך בין ממברנות ויראלי endosomal. תוצאות היתוך מוצלחות שחרורו של vRNAs ארוז virion לתוך הציטופלסמה, שם הם משרתים כתבניות שכפולות שעתוק הגנומי. כאשר כמויות מספיקות של חלבונים מבניים ויראלי vRNAs נוצרות, חלקיקים חדשים להרכיב ניצן מהתא הנגוע כדי להשלים את מחזור החיים 18. כדי להקל על גילוי האסטרטגיות חדשות כדי למקד את arenaviruses פתוגניים טיפולי, הקבוצה שלנו התמקדה בזיהוי גורמים מארחים כי הם קריטיים עבור התפשטות נגיף, אבל אפשר לוותר עליהן עבור המארחת. בהקשר זה, המגדיר את הבמה המדויקת (ים) של מחזור החיים של הנגיף נשלט על ידי גורמי מארח שכזו נדרשת בכדי להנחות אתפיתוח של אסטרטגיות נגיפים. בזאת, אנו מתארים assay כמותית (q) RT-PCR מבוסס כי ניתן להשתמש כדי למדוד מצורף arenavirus תאים לצורך זיהוי אם חלבונים מארחים נבחרים ו / או מולקולות אנטי להשפיע בשלב ראשוני זה של כניסה ויראלי 19. גישות חלופיות למדידת מצורף arenavirus תאים כיכבו virions שכותרתו עם ביוטין 20, צבעי ניאון 21, או איזוטופים רדיואקטיביים 22. חסרונות שיטות אלה יכולים לכלול את הדרישה עבור כמויות גדולות של וירוס קלט (למשל multiplicities גבוהה של זיהום (משרד פנים)), שימוש רדיואקטיביות, ו / או צעדי טיפול נוספים להכנת וירוס קלט (למשל ריכוז ו / או תיוג של וירוס) . בפרט, השימוש גבוה משרד פנים מקשה להבחין פרודוקטיבי לעומת אירועים מצורפים פרודוקטיבי 15,23. את assay qRT-PCR המבוסס המתואר כאן ניתן לזהות אירועים מצורפים באמצעות כמה כמו 20 פלאק עבוריחידות מינג (PFUs) של הנגיף, אשר מיתרגם משרד הפנים של 0.0004 עבור צלחת 48-היטב. לכן, הרגישות החזקה של assay מתגברת על הדרישה גבוהה משרד פנים וכן כל צעדי תיוג וירוס או ריכוז. יתר על כן, assay יכול להיות אני) מותאם למדוד אנדוציטוזה virion וכן שחרורו של הגנום וירוס לתוך הציטופלסמה הבא פיוז&#39;ן ii) מותאם לשימוש עם וירוסים אחרים באמצעות הפיתוח של חומרים כימיים qRT-PCR ספציפי וירוס (לדוגמות, ראה 24-27).

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>100x</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>100x</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>1x</td></tr><tr><td>Vero E6 cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well plate</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>do not mix buffers RLT or&amp;nbsp; RW1 with bleach</td></tr><tr><td>QIAshredder homogenizer</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/&amp;micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>4311235</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0260</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0010</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor (5000U/100 &amp;micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0119</td><td></td></tr><tr><td>RT primer 5&amp;rsquo;-AAGGGTTTAAAAAT&lt;br/&gt;GGTAGCAGAC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>250 nmol DNA oligo</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>Forward qPCR primer&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>Reverse qPCR primer 5&amp;rsquo;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>TaqMan Probe 5&amp;rsquo;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4316033</td><td>HPLC purified</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL)</td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4376598</td><td>or other qPCR instrument</td></tr></tbody></table>

highly sensitive assay for measurement of arenavirus-cell attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

כדי להגיע לרגישות וטווח דינמי של assay qPCR, כמויות ידועות של פלסמיד המקודד את הגן NP של # 1 JUNV C (טווח 5-5 x 10 7 עותקים) היו נתונים qPCR כמפורט בסעיף 4 לפרוטוקול. Assay הוא רגיש והוא יכול לזהות באופן מהימן מעטים ככל 5 עותקים של חומצת גרעין היעד (איור 2). י...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment at JoVE.com

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

highly-sensitive-assay-for-measurement-of-arenavirus-cell-attachment

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Views.  University of Vermont. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Video: Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Biology

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

Source: Tai, C., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows assessment of the impact of the test compound on viral envelope fusion with endosomes.

בדיקה להערכת ההשפעה של תרכובות בדיקה על כניסה נגיפית ואיחוי בתאים מארחים

Note: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

Cell-Based AAV Neutralizing Antibody Assay: A Colorimetric Technique to Detect Neutralizing Antibodies Against Specific Adeno-Associated Viruses in Serum

Start plating HT1080 cells on day one by diluting the cells to a concentration of 1 x 105 cells/mL in pre-warmed complete DMEM media.
Then, seed 100 microliters of cells, per well, into clear 96-well flat-bottomed plates to the concentration of 1 x 104 cells per well. Incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide overnight for 16 to 22 hours.
On day two, generate serial dilutions of the serum samples of interest in 1.5-milliliter microcentrifuge tubes using pre-warmed complete DMEM.
To each tube with diluted serum samples, add 66 microliters of the 7.5 x 106 viral genome per microliter virus working solution. Mix the virus/serum dilutions by pipetting, and then, place the tubes containing the virus/serum mixtures in an incubator at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide for 30 minutes, to allow potential neutralization to occur.
After 30 minutes, pipette 100 microliters of the virus/serum mixture to each well on the 96-well plate containing 1 x 104 cells per well, then, wrap the plate in a foil to place in an incubator at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide overnight for 16 to 24 hours.
On day three, aspirate the media from the wells of the 96-well plate using a fume hood vacuum without disrupting the adhered cells, and add 50 microliters of 4% paraformaldehyde to each well. After wrapping the plate in foil, leave it for 10 minutes at room temperature.
Later, wash and aspirate the cells twice with 200 microliters of PBS at room temperature. After the second wash, pipette 200 microliters of pre-warmed PBS into each well, and wrap the plate in foil followed by incubation at 65 degrees Celsius for 90 minutes to denature endogenous alkaline phosphatase activity.
Following incubation, add 50 microliters of the freshly prepared, dissolved BCIP/NBT into each well, and incubate the wrapped plates at room temperature for 2 to 24 hours. Later, take photos of each well using a 4x objective lens in a light microscope camera, ensuring the consistent use of the same exposure, white balancing, and light settings for all assays.