מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

כדי להתחיל, הניחו את העכבר המגולח והמורדם על משטח חימום. צבטו את העור בפינצטה ליד הפטמה הרביעית וחתכו את העור המורם במספריים חדים כדי לבצע חתך בקו האמצע של כסנטימטר אחד. בצע חתכים עגולים סביב הבלוטה בשני כיוונים גולגולתיים וקאודלים, בזהירות לקלף את העור מן הבטן.

הסר כל דם אקסוגני מיד עם מלוחים פיזיולוגיים כדי למנוע אובדן הבא של רזולוציה אופטית. כדי למזער את איבוד הדם, אטמו את כלי הדם הבולטים בעזרת צריבה ידנית. לאחר מכן הקניט בעדינות את שכבת פני השטח עם מלקחיים עדינים כדי להסיר רקמת חיבור ושומן שטחית.

שמור על הבלוטה החשופה לחה עם מלוחים פיזיולוגיים. במידת הצורך, לטפל בבלוטה עם סוכנים אקסוגניים, למשל, סוכנים פרמקולוגיים או צבעים ספציפיים אברונים על ידי רחצה בלוטות חשופות במהלך הניתוח. הגן על דופן הבטן באמצעות סרט תרמופלסטי גמיש ושקוף למחצה.

מקם בזהירות את העכבר עם צד הבטן כלפי מטה על שלב מיקרוסקופ הפוך, כך שדש העור משתרע על זכוכית הכיסוי המרכזית. יש להגן על האזורים החשופים בעזרת שכבה דקה של ג'ל. הדביקו את הרגל האחורית ואת הזנב לבמה.

לאחר מכן הניחו ספייסר מחורץ בהתאמה אישית שהוכן משלושה מקלות כותנה מודבקים בין דש העור לדופן הגוף כדי לרפד את הבלוטה מחפצי תנועה הנגרמים על ידי נשימה ופעימות לב. הדביקו היטב כיסוי פלסטיק משני קצות פתח הבמה כדי למנוע את החלקת דש העור במהלך ההדמיה. יש להחדיר קטטר תת-עורי מתחת לעור הגבי המחובר לצינור, מזרק ומשאבה.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי, לאשר כי דש העור יציב עם זרימת דם נאותה. בצע מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי של עכבר הממברנה EGFP cyto או EGFP המסומן עם BODIPY 665676 ושני מיקרוסקופ פוטונים של עכבר קרום EGFP המסומן עם מונודנסילפנטאן ועכבר קרום tdTomato המסומן במונודנסילפנטאן. בעכברי EGFP cyto, הציטופלסמה של תאי אפיתל מפרישים סומנה באופן ברור על ידי EGFP.

במקביל, טיפות שומנים מוכתמות ב- BODIPY 665676 הופיעו כגופים פלואורסצנטיים עגולים, במיוחד לכיוון פני השטח האפיקאליים. ניתוח קיטועי זמן הראה כי BODIPY 665676 טיפות שומנים מוכתמות הנעות מאזור הבסיס לאזור האפי במהירויות משתנות ומתמזגות זו עם זו במעבר. בעכברי קרום EGFP, EGFP הדגיש את קרומי הפלזמה של תאי אפיתל נימים ומפרישים וטיפות שומנים מוכתמות BODIPY נראו ברחבי הציטופלסמה.

שני מיקרוסקופ פוטונים של בלוטות החלב של עכברי קרום EGFP או tdTomato אפשרו סקירה מקיפה יותר של מורפולוגיה של הבלוטה. סיבי קולגן על פני השטח מוצגים בערוץ monodansylpentane באמצעות הדור ההרמוני השני. בהמשך הפרנכימה מתגלה אפיתל ההפרשה עם קרום פלזמה בסיסי, רוחבי ואפי וטיפות שומנים מוכתמות מונודנסילפנטאן.

הלומן המרכזי הופך ברור יותר לתוך הנאדיות. פלואורופור tdTomato אדום היה שימושי במיוחד לסימון אנדותל נימי, בניגוד ל- EGFP בעכברי ציטו EGFP.