The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

1. הכנת תרבות מדיה וכלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 200 מיליליטר של Biggers ויטן וויטן (BWW) 17 פתרון עובד על ידי הוספת 5.54 g NaCl, .356 גרם KCl, 0.25 גר &#39;CaCl 2, 0.162 g H 2 P KO 4, ו.294 MgSO g 4-1 ליטר של מים מילי- Q . זהו פתרון המניות ויכולים להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס עד חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפתרון המניות, להוסיף 420 מ&quot;ג של NaHCO 3 -, 200 מ&quot;ג גלוקוז, 6 מ&quot;ג נתרן פירובט, 600 מ&quot;ג בסרום שור אלבומין, 0.74 חומצת החלב מיליליטר נתרן, ו 4.0 מיליליטר של חיץ HEPES 193 מיליליטר של מניית BWW. זהו הפתרון עובד, והוא תמיד עושים טרי ביום וequilibrated עד 37 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את הצינורית, לקחת פוליאתילן צינורות (PE) עם קוטר פנימי של 0.4 מ&quot;מ וקוטר חיצוני של 1.1 מ&quot;מ ולהחזיק בחום נמוך יותר (בדרך כלל מתנול להבה) באופן שהצינורות מתחילים להתמוסס. מייד למשוך את צינורות outwארד למתוח ולהפוך את הקוטר החיצוני צר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cut לייצר צמצום קצה אחד המאפשר לcannulation קל יותר של צינור הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקצה השני של הצינורית לכ -15 סנטימטרים. הכנס מחט G 30 לקצה הקהה, ולצרף מזרק 3 מ&quot;ל לזה (חזר בו באופן מלא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך שופר יניקה על ידי חיתוך אורך 20 סנטימטרים של צינור PE (4.2 מ&quot;מ קוטר פנימי, קוטר חיצוני 6.4 מ&quot;מ). הכנס שופר לקצה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בעל שפופרת זכוכית מיקרו-נימים וזכוכית מיקרו-הנימים עצמו (3 μl בדרך כלל לעכבר, 40 μl לחולדה). </li></ol> 2. ההסרה של Epididymides מעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי נהלים שאושרו IACUC ספציפיים לכל מוסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את בעלי החיים ולעשות חתך קטן בצק האשכים כדי לחשוף את יותרת האשך. משוך את האשך ויותרת אשך מתוך החלל בעזרת זוג המלקחיים # 5 של השען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את צינור הזרע כך שלפחות 1-2 סנטימטר להישאר מחובר ליותרת אשך cauda. בנוסף, חתך את הצינורות הפרוקסימלי efferent ורקמות חיבור יותרת האשך לאשך ולהסיר את מסלול הרבייה של גבר כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מסלול הרבייה של גבר כולו תחת מיקרוסקופ לנתח עם מגוון הגדלה בצו של 5-40X. </li></ol> 3. cannulating יותרת האשך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת את הצינורית למיקרוסקופ, כך ש1-2 סנטימטר של הסוף הצטמצם (קונוס-צורה) הוא חופשי וגלוי דרך העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח זוג # 5 המלקחיים של שען ובעדינות לאחוז כל צד של צינור הזרע ולמשוך את צינור הזרע אל הצינורית, כך שהצינורית נכנס לצינור הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח באורך של משי שאינו נספג שחור קלוע טופל (גודל 5-0) ולקשור קשר סביב צינור זרע cannulated. כאשר fr לחץ האוויר להבטיח את הקשר הוא משך בחוזקה כדי להחזיק את הצינורית בתוך צינור הזרעאום המזרק מיושם. </li></ol> 4. מדרדר או backflushing של הזנב epididymal תאים-זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות # שענים 5 מלקחיים, לתפוס את הקצה הדיסטלי של epididymides cauda ולהסיר את albuginea Tunica על מנת לחשוף את אבובית epididymal יחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש במלקחיים, משוך בעדינות את אבובית החוצה כדי לחשוף ולאחר מכן להפריד כדי ליצור פתח לזרע להשתחרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף בעדינות את 3 מיליליטר (עכבר) או 20 מיליליטר מזרק (עכברוש), כדי לגרש את האוויר מהמזרק לתוך צינור הזרע. בלחץ המתאים, תאים-זרע יתחילו לבוא לאט מתוך אבובית השבורה בקצה הדיסטלי של יותרת האשך cauda. בשלב זה, חלים יניקה לשופר לצייר תאי הזרע אל תוך נימי הזכוכית. הערה: בדרך כלל בעכבר, ניתן לקבל 2-3 μl של תאי זרע בהתאם לגילו של בעל החיים. רצון חולדה, בתשואה ממוצעת 30-40 μl. </li></ol> 5. כביסהוlysing תאי הזרע בהכנה לפרוטאומיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את תאי הזרע מזכוכית הנימים לתוך 1 מיליליטר הפתרון של פתרון BWW (37 ° C) על ידי בעדינות נושבת לתוך הפומית או הצמדת מזרק וגירוש אוויר כדי לדחוף את הזרע החוצה של הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי הזרע מתפזרים, לשטוף 3x (XG 300, 5 דקות) עם BWW 1 מיליליטר להסרת חלבונים מזהמים. לאחר לשטוף הסופי, להסיר את supernatant. הערה: בשלב זה, אפשר להקפיא את תאי הזרע לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize חלבונים באמצעות 4 בחורים%, 2 M thiourea, ו -50 מ&quot;מ טריס, pH 7.4 עבור שעה 1 עם vortexing לסירוגין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר lysing התאים, צנטריפוגה (10,000 XG, 20 דקות), לקחת supernatant ולהעביר צינור חדש. הערה: בשלב זה, ניתן לבצע כימות חלבון. </li></ol> 6. דיסולפיד בונד הפחתה ואלקילציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;מ DTT כריכוז סופי לחלבוני lysed, ווארטלשעבר ודגירה על RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;מ idodoacetamide כריכוז סופי לlysate, מערבולת לדגור על RT במשך 30 דקות בחושך. </li></ol> 7. ממטרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלורופורם מתנול לזרז את המדגם על ידי הוספת נפח של 1 lysate (400 μl כדוגמא), להוסיף כרך אחד (400 μl) של מתנול ונפח 0.5 כלורופורם (200 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת המדגם וספין (10,000 XG, 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב ששני שלבים יופיעו הבאים צנטריפוגה. מחק את כל אבל 2 מ&quot;מ של השכבה העליונה (נזהר שלא להפריע לממשק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח (400 μl) של מתנול, צינור היפוך בעדינות 1-2x לערבב ושוב ספין (10,000 XG, 15 דקות). בטל supernatant לבזבז וגלול אוויר יבש במשך 3-4 דקות. </li></ol> 8. טריפסין עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש טריפסין באמוניום ביקרבונט 25 מ&quot;מ המכיל אוריאה 1 M ליחס של 50: 1 (W / W; חלבון: טריפסין) וטופחו אובהrnight על 37 מעלות צלזיוס רצוי בסל&quot;ד 700 על thermomixer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין (10,000 XG, 15 דקות) לגלולת חומר לא מעוכל. העברת supernatant לצינור חדש. </li></ol> 9. Phosphopeptide העשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע טיהור והעשרה של phosphopeptides מtryptic לעכל כפי שתואר קודם לכן 18. לדלל פפטידים tryptic של פי 10 במאגר DHB [חיץ DHB מורכב: 350 מ&quot;ג / מיליליטר 2,5 חומצת dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (V / V) ACN (אצטוניטריל), 2% (V / V) TFA (trifluoroacetic חומצה)] ולהחיל לייבוש Tio 2 חרוזים (200 מיקרוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר על הכתף בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם חיץ DHB, ספין ולהסיר supernatant. לאחר מכן לשטוף את המדגם שלוש פעמים עם חיץ לשטוף [80% ACN (V / V), 2% TFA (V / V)] כדי להסיר את DHB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסיבוב האחרון, ישירות elute phosphopeptides באמצעות חיץ elution על ידי הוספת 25 μl של אמוניום הידרוקסיד 2.5%, פתרון pH ≥ 10.5. Sלהצמיד ולהסיר את supernatant. מייד לנטרל עם ~ 0.3 חומצה פורמית μl. </li></ol>

<ol>
	<li>Blandau, R., Rumery, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+swimming+movements+of+epididymal+spermatozoa+to+their+fertilizing+capacity.">The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity.</a> Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).</li><li>Tournade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diff&#233;rence+de+motilit&#233;+des+spermatozo&#239;des+pr&#233;lev&#233;s+dans+les+divers+segments+de+l&#8217;&#233;pididyme.">Diff&#233;rence de motilit&#233; des spermatozo&#239;des pr&#233;lev&#233;s dans les divers segments de l&#8217;&#233;pididyme.</a> C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).</li><li>Wyker, R., Howards, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+studies+of+the+motility+of+rete+testis+and+epididymal+spermatozoa.">Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).</li><li>Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+germ+cell+gene+expression.">Male germ cell gene expression.</a> Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).</li><li>Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).</li><li>Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+structure+and+remodelling+during+sperm+maturation+in+the+epididymis.">Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis.</a> J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).</li><li>Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Epididymis. 3, 1072-1120 (2006).</li><li>Lacham, O., Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+epididymal+and+testicular+spermatozoa+microinjected+under+the+zona+pellucida+of+the+mouse+oocyte.">Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte.</a> Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).</li><li>Bedford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+duct+ligation+on+the+fertilizing+ability+of+spermatozoa+from+different+regions+of+the+rabbit+epididymis.">Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis.</a> J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).</li><li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+function+of+the+epididymis.">Studies on the function of the epididymis.</a> Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).</li><li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+spermatozoa+in+the+rabbit+epididymis:+effect+of+castration+and+testosterone+replacement.">Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement.</a> J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).</li><li>Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+sperm+maturation+in+vitro+in+epididymal+cell+cultures+of+the+tammar+wallaby+(Macropus+eugenii):+disruption+of+motility+initiation+and+sperm+morphogenesis+by+inhibition+of+actin+polymerization.">Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization.</a> Reproduction. 124, 107-117 (2002).</li><li>Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SRC+as+a+key+PKA-stimulated+tyrosine+kinase+involved+in+the+capacitation-associated+hyperactivation+of+murine+spermatozoa.">Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa.</a> J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).</li><li>Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+consequent+stimulation+of+the+tyrosine+kinase+c-Abl+by+PKA+in+mouse+spermatozoa;+its+implications+during+capacitation.">Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation.</a> Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).</li><li>Baker, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Titanium+Dioxide+To+Find+Phosphopeptide+and+Total+Protein+Changes+During+Epididymal+Sperm+Maturation.">Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation.</a> J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).</li><li>Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Ejaculatory+Changes+in+the+Metabolic+Status+of+Rat+Spermatozoa+as+Measured+by+GC-MS.">Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS.</a> Metabolomics. 11, 1-14 (2012).</li><li>Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The culture of mouse embryos in vitro. , (1971).</li><li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).</li><li>Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+using+titanium+dioxide.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide.</a> Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).</li><li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+titanium+dioxide+micro-columns+to+selectively+isolate+phosphopeptides+from+proteolytic+digests.">The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests.</a> Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).</li><li>Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+signal+transduction+pathways+during+epididymal+maturation+is+calcium+dependent.">The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent.</a> Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).</li><li>Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+HSP-90+During+Mammalian+Sperm+Capacitation.">Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation.</a> Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).</li><li>Jones, R., Mann, T., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidative+breakdown+of+phospholipids+in+human+spermatozoa,+spermicidal+properties+of+fatty+acid+peroxides,+and+protective+action+of+seminal+plasma.">Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma.</a> Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).</li><li>Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+activation+and+second+messenger+signalling+in+spermatozoa+from+rat+cauda+epididymidis.">Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis.</a> Reproduction. 125, 175-183 (2003).</li><li>Nolan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-specific+protein+kinase+A+catalytic+subunit+C{alpha}2+orchestrates+cAMP+signaling+for+male+fertility.">Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).</li><li>Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+role+of+SRC+in+capacitation-associated+tyrosine+phosphorylation+of+human+spermatozoa.">Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).</li><li>Leclerc, P., Goupil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+human+sperm+tyrosine+kinase+c-yes.+Activation+by+cyclic+adenosine+3',5'-monophosphate+and+inhibition+by+Ca(2).">Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2).</a> Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).</li><li>Krapf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Ser/Thr+phosphatases+induces+capacitation-associated+signaling+in+the+presence+of+Src+kinase+inhibitors.">Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors.</a> J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).</li><li>Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+spectral+counting+in+quantitative+proteomics.">Role of spectral counting in quantitative proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).</li><li>Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+isotopic+labeling+and+mass+spectrometry+to+analyze+capacitation-associated+changes+in+the+phosphorylation+status+of+mouse+sperm+proteins.">Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins.</a> J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הצעדים הקריטיים לניתוח proteomic מוצלח ושחזור של תאי זרע הם: 1) טוהר החומר המוצא; 2) הסרת מלחים וחומרי ניקוי לא רצויים; 3) denaturing חלבונים במלוא היקפם כדי לאפשר טריפסין לעכל תשואה גבוהה של חלבונים ו- 4) מזעור מדגם הטיפול כדי לצמצם את אובדן פפטיד. כדי backflush יותרת האשך cauda בהצלחה, זה הכרחי כדי לאתר את האזור שממנו הזרע תצא. במקרה של שני עכברים ועכברים, זה בשיא של האזור הקעור, באמצע אזור הזנב של יותרת האשך (ראה איור 2 א). אם אחד מגיע צעד נוסף לעבר צינור הזרע, backflushing קלה יותר ושיעור ההצלחה הוא בדרך כלל גבוה יותר. עם זאת, זה בא על אובדן מספרי זרע. לחלופין, אם אחד מנסה להעביר לקרבה גדולה יותר לקורפוס, אז הסכום של לחץ דרוש כדי לדחוף את הזרע בחזרה דרך epididymצינוריות אל היא לעתים קרובות כל כך גבוהות, שניזק ליותרת האשך באופן בלתי נמנע מתרחש. Backflushing של יותרת האשך מבוצעת באופן מסורתי באמצעות שמן מינרלי מים רוויים ותמיסת מלח מאוזנת במזרק עצמו כמדיום כדי להסיר את תאי הזרע 22-25. שני ההליכים הם פוטנציאל בעייתיים של LC-MS. ראשית, מינרלים עלולים לחסום את ננו-עמודי ננו-C18 המשמשים בעצם בעולם לניתוח וטיפול proteomic יש לקחת כל כך אף אחד, כי הוא מועבר בנוהל. במקרה זה, זה בלתי אפשרי להמשיך והמדגם איבד במהות. זה ניתן להתגבר על ידי השימוש בBWW או פתרונות מלח מאוזנים אחרים במזרק, עם זאת, למרות שזה מוצלח, אנו מוכרים כי רבים הזרע הפכו ניע בהקדם פתרון BWW בא במגע ומעורבב עם epididymal הזנב תאים. כדי לעקוף בעיה זו פשוט backflush תאי הזרע עם אוויר. לא רק הוא quality של תאי זרע דומה לזו של שיטות המבוסס על נוזל, אבל הכמות זהה. Phosphoproteomics הוא אולי אחת הדרכים היחידים להקים בי מסלולי איתות מתרחשים בהודעה שפיכה-תאים-זרע. אחד מהמסלולים העיקריים שאנו חוקרים הוא התהליך של capacitation. תאים-זרע חייבים לעבור &quot;capacitation&quot; לפני שהוא מסוגל להיקשר לביצה. בפועל, זו מושגת בעצם על ידי דוגרים תאים-זרע לתקופה של זמן (דקות 40 עכבר; עכברוש 1.5 שעות; 3-24 שעות אדם) בפתרון BWW עם אלבומין בסרום. בעבר, אנחנו ואחרים הראינו תפקיד במשך כמה קינאז המעורב בcapacitation. של עניין, מחיקה של PKA μ II לייצר עכברי תאי זרע ששוחים באופן ספונטני במבחנה, אך לא יכול לעבור היפר 26. האחרון הוא סימן היכר של capacitation, לפיה תאי זרע לשנות את דפוס השחייה שלהם ממהירות גבוהה, משרעת נמוך, לנמוךמהירות, משרעת גבוהה הכה תדירות. הראינו קינאז במורד הזרם מעורב בתהליך זה כולל pp60-cSRC (SRC) 13,27 c-כן 28 ו- c-ABL 14. מעניין, עיכוב של SRC מפסיק זרחון טירוזין capacitation תלוי 13. עם זאת, ניתן להתגבר עם חומצת okadaic, המצביע על כך SRC אינו מעורב ישירות בתחילה הכללית של זירחון טירוזין 29 אך עשוי להסדיר phosphatase 29. הבעיה בשימוש בBWW כמדיום כדי לאלץ את תאי זרע אל מחוץ ליותרת האשך היא שהופעל בעבר תאים-זרע של העכבר, רק לקחת כ 40 דקות לcapacitate. בהתחשב בכך שבידוד של תאי זרע יכול לקחת 5 דקות / עכבר ולעתים קרובות כמה עכברים משמשים בניסוי, ולאחר מכן תאי זרע יהיו בשלבים שונים של בגרות בתחילת הניסוי. כדי להתגבר על זה, לחץ אוויר יכול לשמש כדי לדחוף את תאי הזרע מאשך הזנב לצינורית זכוכית. לא רק שכל inact הזרעive ובעצם כפי שהם היו נמצאים בסביבת הזנב, זה עושה את זה ניתן להשוות phosphoproteomics הלא-נעים ובניע. לדוגמא טיפול לphosphoproteomics צריכה להישמר עד למינימום כאשר משווים את תאי זרע בשתי מדינות פונקציונליות שונות. השימוש בכלורופורם מתנול על פני שיטות מסורתיות אחרות של משקעים חלבון 1) מצמצם את הצורך בצעדים נוספים כביסה, 2) מסיר כמעט את כל עקבות של מלחים ושומנים ו 3) יש יכולת מוכחת כדי לזרז חלבוני שפע נמוכים מעל TCA 19. ממטרים חלבון לפני עיכול טריפסין מומלץ שכן לא רק זה לעזור ללפגל חלבון (שעוזר לעיכול טריפסין), אבל מסיר רב של מטבוליטים MS-עולה בקנה אחד הנוכחים בתא. ההשוואה של phosphopeptides הזרע ניתן לעשות זאת במספר הדרכים. ברמה הבסיסית, השוואה פשוטה של ​​phosphopeptide זוהה במדגם אחד, שלבעודמדגם בתהליך המכונה &quot;ספירת רפאים&quot; ניתן לעשות זאת. עם זאת ביקורת הייתה בגישה זו בעצם בגלל לימודי proteomic מוקדמים באמצעות חזרות נמוכות (לדיון מלא יותר לראות Lundren et al. 30). גישה מתוחכמת יותר היא להסתכל על עוצמת ההמונית הורה פפטיד ולהשוות את זה עם דוגמאות האחרות (השוואה ללא תווית). בדוגמא מוצגת באיור 4, ניתן לראות פפטיד נעדר מהלא-נעים ב( למעלה איור 4), אך קיים בניע תאים-זרע (בחלק תחתון איור 4) ממ &#39;/ z 650-670. תהליך זה, המכונה כימות ללא תווית מבוססת MS הוא אסטרטגיה ללא תווית. אסטרטגיה חלופית הנפוצה להפחית את כמות הריצות הנדרשות לכימות proteomic היא להשתמש איזוטופים. ככל שהמסה של איזוטופ היא שונה, ספקטרומטר המסה יכול לשמש כדי להשוות את העוצמות של eluting פפטידים. עם זאת, שלא כמו רוב סוגי תאים אחרים, כמה תיוג איזוטופי לא יכול להיות מיושם על תאי זרע. לדוגמא, התוספת של איזוטופים יציבים (איזוטופ אחד כבד מקבלת הוסיפה למדגם אחד, בעוד בגרסה קלה יותר מקבלת הוסיפה למשנהו) ניתן להשתמש בתרבית רקמה. כאשר איזוטופים מתמזגים בחלבון, ניתוח פרוטאומיקה יכול להתבצע על ידי שילוב של שתי הדגימות (ריבוב). עם זאת, במקרה של תאי זרע, זה לא יכול להיעשות, פשוט מכוח העובדה ש1) תיוג איזוטופ דורש כמה קטעים (עד 8) בתרבית רקמה ו- 2) תאי הזרע אין שעתוק הגנים גרעיני ותרגום, ולכן, הם לא יכולים לשלב איזוטופים לכל החלבון שלהם בכל מקרה. אחת דרכים לעקוף זאת היא להורות עכברי radiolabelled, לעומת זאת, אלה הם ידועים לשמצה יקרים. גישה חלופית היא להשתמש בתג כימי. הדבר נעשה כאשר עכברים-capacitated לא היו בהשוואה לעכברים capacitated. במקרה זה, D 0 וD <sub&gt; 3 -label שימש להבחין בין מדגם אחד למשנו בספקטרומטר המסות 31. גישות אחרות יכולות לכלול השימוש בiTRAQ (תג isobaric לquantitation יחסי והמוחלט), לפיה lysines מסומנים כימי עם איזוטופים מסה שונים; iCAT (תג זיקת איזוטופ מקודד) לפי cysteines מסומנים עם איזוטופים מסה שונים ותיוג מים כבד וקל. בכל מקרה ומקרה, עם זאת, דבר אחד צריך להיות כל הזמן בראש. MS מדווח רק את מה שקיים במדגם, ואת זה הוא השתקפות של כל מה שקרה שלדוגמה עד לנקודה ש. מזעור טיפול מדגם תוך מיקסום התשואה בכל שלב הוא הכרחי לניתוח proteomic מוצלח.

לאחר שיצא מהאשך, תאים-זרע הם מאוד מובחנים עדיין להפליא, תאים אלה הם לא בוגרים 1,2. ככזה, אין להם פונקציונליות מלאה, כולל היכולת לשחות ונקשר לביצית 3. למרות שנדרשה התבגרות נוספת של תא הזרע, זה לא יכול להתקיים באמצעות מסלולים הקנונית, שכן בשלב זה של תהליך התמיינות התאים שלהם, הם לא מסוגלים שעתוק הגנים וחלבונים נוספים ביוסינתזה 4. היכולת ביולוגית המוקנה תאי זרע שהם עוזבים את האשך והזן חלק ממערכת הרבייה של הגבר הידוע ביותרת האשך 5. יותרת האשך הוא צינור בחוזקה מפותל, מובחן מאוד שמחבר את צינורות efferent (של האשך) לצינור הזרע וקיים בכל יונקי זכרי 6. תאי זרע בהדרגה לרכוש פוטנציאל דישונם במהלך ירידת epididymal, בהסתמך על סביבת luminal המשתנה שהוא created על ידי תאי האפיתל epididymal המקומיים 7. פעילויות הקליטה מחדש הפרשה והשונות הנמצאות בסביבת המעשה epididymal לשנות את הזרע עצמו, שינוי הרכב חלבונים, הפחמימות ושומנים בדם שלה 6. החשיבות של יותרת האשך, במיוחד באזור הראשוני &#39;Caput&#39; של מבנה זה כבר באה לידי ביטוי באמצעות טכניקות קשירה כירורגית 8. תאים-זרע נשמרים בתוך האשך על ידי קשירת צינור efferent הם לחלוטין חסרים כל יכולת להפרות את הביצית 9-11. בנוסף לסביבת epididymal, מסלולי העברת אותות תוך עבודת תאי הזרע כדי שלאחר translationally לשנות את ההשלמה תא זרע הקיימת. לדוגמא, תאים-זרע מהאזורים המוקדמים של יותרת האשך להציג דפוסים שונים של זירחון חלבון בהשוואה לאזורים אלה האחרונים 5,12. הדבר אינו מפתיע שכן יש הבדלים עצומים בגapability של הזרע מאזורים אלה. לדוגמא, תאים-זרע מהמוקדם, Caput יותרת האשך הם immotilite. בניגוד לכך, תאי זרע מאזור cauda יעברו קדימה תנועתיות מתקדמת להציב פעם אחת במדיום איזוטוני. מאחר ותאי זרע epididymal אינם מסוגלים סינתזת חלבון דה-נובו, כל המסלולים הפנימיים המסדירים את תפקוד זרע חייבים להיות הדרך לאחר translational שינויים (PTM). מכאן, זה מתקבל על הדעת שפרוטאומיקה, ובפרט החקירה של PTMs כגון זרחון חייבת להיות דחף גדול אם ברצוננו להבין התבגרות תא זרע. שיטה חלופית להשגת תאי זרע מepididymidies להשתמש רטרו-backflushing 13-16. למרות שטכניקה זו היא בהחלט זמן רב יותר ולוקחת מידה רבה יותר של מיומנות על ידי המפעיל, התאים-הזרע המתקבלים בעקביות להפגין טוהר העולה על 99.99%. בנוסף, בניגוד לכל הטכניקות האחרות, ca תאים-הזרעn להיות מבודד במצב שקט, מה שמאפשר ללמוד כיצד תנועתיות זרע היא יזמה. כהכנת מדגם הוא ההיבט החשוב ביותר לניתוח proteomic, בידוד של תאי זרע הפך לאחד ההיבטים החשובים ביותר של מחקרי זרע-proteomic. פרוטוקול זה מספק הסבר כיצד תאי זרע מבודדים מיותרת אשך cauda. בעקבות זאת, הליך העשרת 2 phosphopeptide TIO מתואר, תוך התייחסות ספציפית על איך לחלץ פפטידים מתאי הזרע מובחנים מאוד. גישת MS יכול לשמש כדי להבחין phosphopeptides שינוי אם היו להשוות את תאי זרע epididymal הזנב במדינה אחת (immotile או אי-capacitated) למשנהו (ניעתי, capacitated, acrosome הגיב, וכו &#39;) מה שהופך את זה בגישה רבת עוצמה כדי לחקור זרע פונקציה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>195464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-D Quantitation Kit</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>80-6483-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonia Solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>1300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10077.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O6440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine-L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes (free acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetic acid free acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Res. Org.</td>
			<td>0090M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10158.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll (sterile)</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>GEHE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td>
			<td>PIE78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Medical Store</td>
			<td>CH 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10247.4V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure Grade</td>
			<td>Amresco (Astral)</td>
			<td>AM0497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Gold-Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">NN2038R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">SS035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4.2 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Braided silk (5-0)</td>
			<td style="width:175px;">Dynek</td>
			<td style="width:129px;">CSS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TiO2 beads (from disassembled column)</td>
			<td style="width:175px;">Titansphere</td>
			<td style="width:129px;">6HT68003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C7B30</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">C0856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphopeptide analysis of rodent epididymal spermatozoa

תאים-זרע הם די ייחודיים בין סוגי תאים. למרות שמיוצרים באשכים, שני שעתוק הגנים הגרעיני והתרגום כבויים פעם התא העגול מראש הסמן מתחיל להאריך ולהתמיין למה שהכיר מורפולוגית כתא זרע. עם זאת, תא הזרע הוא מאוד לא בוגר, שאין לו יכולת לתנועתיות או הכרת ביצה. שני האירועים הללו מתרחשים ברגע מעבר תאי זרע איבר משניים הידוע ביותרת האשך. במהלך מעבר היום ~ 12 שלוקח לתא זרע לעבור יותרת האשך, לאחר translational שינויים של חלבונים קיימים לשחק תפקיד מרכזי בהבשלה של התאים. היבט מרכזי אחד כזה הוא זרחון חלבון. כדי לאפיין אירועי זירחון התרחשו במהלך התבגרות זרע, שתי אוכלוסיות תאי זרע טהורות וטרום-חלוקה של phosphopeptides יש לקבוע. באמצעות גב טכניקות שטיפה, שיטה לבידודה של o תאי זרע הטהורהאיכות גבוהה f ותשואה מepididymides דיסטלי או הזנב מתוארת. הצעדים לsolubilization, עיכול, וטרום-חלוקה של phosphopeptides הזרע דרך Tio 2 כרומטוגרפיה זיקה מוסברות. ברגע בודד, ניתן להזריק לתוך phosphopeptides MS לזהות שני אירועי זירחון החלבון על שאריות חומצת אמינו מסוימות ולכמת את הרמות של מקום זירחון לוקח במהלך תהליכי התבגרות הזרע.

איכות התוצאות מכל ניתוח proteomic תלויה מאוד בחומר המוצא. עם MS המודרני, זיהומים קלים בהכנות מדגם קלות הרימו. לכן, זה קריטי, במקרה של פרוטאומיקה תא זרע, לבחור שיטה שנותנת זרע טהור ביותר. כפי שמודגם באיור 1, backflushing מדרדר משמשת לאחזור תאי זרע מאשך cauda. זה כרוך cannulating צינור הזרע עם צינורות PE שמאפשר ליישם לאט לחץ אוויר מהמזרק המצורף. איור 1 א ממחיש את יותרת האשך cauda יחד עם צינור הזרע. איור 1 הוא מקרוב זריקה של איך צינור הזרע קשור בי צינורית מוחדרת. בעושה, כל כך, תאים-זרע משתחררים בסוף נכרת של אבובית אחד מepididymides הזנב. כפי שניתן לראות באיור 2 א, התאים-הזרע מופקים מאזורי השיא של caudיותרת האשך ונשאב לתוך נימי זכוכית במצב שקט (איור 2). יש לכך כמה יתרונות על פני שיטות מסורתיות &quot;לשחות למעלה&quot;, לא פחות מ מהם היא היכולת לבצע ניתוח phoshoproteomic של תאי זרע לפני ואחרי ההפעלה של תנועתיות. התאים-הזרע אז יכול להיות מגורשים לתקשורת של הבחירה של אחד. איור 2C (צד שמאל) מדגים כיצד הזרע נראה מייד לאחר גירוש לתקשורת BWW. רבים מהתאים בכבדות יחד. עם זאת, לאחר 10 דקות של יכולת התאים הוא הוכיח כי הם לשחות החוצה להומוגניות לפתרון (איור 2 ג, צד תאים מימין). מאז טכניקת backflushing יש השפעה קטנה מאוד על תאי הזרע, אנו מקבלים קרובים ל -100% ותנועתיות התאים לפזר במהירות לכלי התקשורת ללא פרובוקציה חיצונית. בניסוי backflushing טיפוסי, זרע התאושש מהשויצרי העכבר מכילבין 1-5 x 10 6 תאים. זה תלוי מאוד בגילו של בעל החיים ויכול להשתנות מזנים שונים של עכברים. בעכברוש נורבגי, אנחנו בדרך כלל להשיג 200 x 10 6 תאים-זרע, ± 20%. איור 2 ד מייצג את טוהר של תאי זרע המתקבל מיותרת אשך cauda החולדה. חוץ מהמדגם עצמו, אחד הנושאים המרכזיים הנוגעים להכנת מדגם הוא התשואה של עיכול טריפסין. ממטרים חלבון ממלאים תפקיד מרכזי, לא רק בהסרת חומרי ניקוי לא רצויים ומלחים, אשר שניהם אינם מתיישב עם MS, אלא גם בdenaturing חלבונים. מצאנו הממטרים מתנול, כלורופורם לעבודה הטוב ביותר. לא רק שדווח בהליך זה כדי לזרז חלבונים בשפע נמוכים יותר טובים מאחרים, כולל ממטרים TCA 19, אבל יש לו יתרונות נוספים. בעקבות המשקעים TCA, זה לעתים קרובות יש צורך להתקין מחדש את ה- pH לאחר השעיה של גלולה TCA שיכול להישאר דיחומצי. למרות גלולה זירז של TCA ניתן לכבס בפתרונות אורגניים גבוהים כדי להסיר את החומצה, זה מוסיף לדגום טיפול וirreproducibility של תוצאות. אי לנטרל את החומצה יגרום תשואות פפטיד tryptic עניות. הממטרים מתנול, כלורופורם הוא לא רק מהירים, אבל לא להפוך לחומצת המדגם. איור 3 ממחיש את גלולה החלבון לראות בדרך כלל משל מדגם בין שלבי ביניים התחתונים ועליונים 100 מיקרוגרם. הבידוד של phosphopeptides יכול להתרחש במספר הדרכים; עם זאת שחזור תלוי איך המדגם כבר טיפל עד וכולל שלב זה. אחת השיטות הנפוצות יותר, הוא פיתוח Tio 2, שפותח במקור על ידי הקבוצה של מרטין לארסן 18,20,21. למרות שתואר כתהליך להשתמש בmicrocolumns, אנחנו יכולים להשיג נתונים לשחזור באמצעות כרומטוגרפיה אצווה. הצלחת התהליך תלויה מאוד בחיץ elution, אשר חייב להיות מטורף<html> דואר עם ההרכב הנכון; אחרת phosphopeptides לא eluted בכלל. שחזור של נתונים הפרוטוקול והנציג מTio 2 מועשר phosphopeptides מזרע epididymal cauda בהלא נעימה ב( למעלה איור 4) ומדינת ניעתי (למטה איור 4) ממ &#39;/ שניתן לראות z 650-670. אנחנו הוכחנו כי מדובר בטכניקה מאוד לשחזור גם בעת שימוש משכפל ביולוגי 17. הפסים הכחולים המופיעים לאורך הזמן הם פפטידים משחררי מC18 ננו-טור כריכוז של עליות אצטוניטריל. ברור, באוכלוסיית הניע (n = 3 הראה, n = 8 פועלים בדרך כלל), יש אשכול פפטיד, עם מסת monoisotopic סביב טווח Da 651.5 שאינם קיימת לחלוטין בטווח הלא-הנעים ב. ספקטרומטר מסת טנדם לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות הפפטיד הזה. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; תמונת Cannulation של יותרת האשך cauda (א) ליותרת אשך cauda: איור 1.. הצינורית עצמו הדביקה את לחשוף כ 1-2 סנטימטר של הסוף-משך מראש. זה מוכנס לתוך צינור הזרע באמצעות מלקחיים # 5watchmakers קנס. (ב) הצינורית מוחזקת במקום על ידי קשירת משי משובח סביב קטע המכיל את שני צינור זרע ואת הצינורית. מהעכבר, כ 2-3 μl של תאי epididymal הזנב ונוזל נאספים בריכוז של 1 x 10 6 / μl. מהעכברוש (עולם), כ 30-40 μl של נוזל מתקבל בריכוזים דומים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> איור 2: נימי זכוכית המשמשות לאיסוף תאי זרע epididymal מוסמך. אבובית אחת מהשיא של דואר cauda ()<html> pididymis הוא מבודד ושבורה. המיקום המשוער שממנו זה מתרחש מוצג. (ב) בחלק העליון של התמונה מראה צינור נימי זכוכית ריק והתחתון מראה אחד מעכברוש backflushed בעבר. אין זיהום דם וזיהום תאי אפיתל מינימאלי. (ג) כפי שתאי הזרע עדיין חי בנוזל epididymal, הם לא התחילו להפעיל. כאשר תאי הזרע בתחילה גורשו לפתרון BWW, הם יוצאים כ&quot; מחרוזת &quot;קומפקטית (צד שמאל). היכולת של התא הוקמה בקלות, שכן לאחר 10 דקות רוב התאים-הזרע לשחות לפתרון ללא כל הפרעה חיצונית (צד ימין). (ד) תמונה של aliquot של תאי epididymal הזנב מייד אחרי שהם כבר עזבו לשחות מתוך מדגים את טוהר של התאים. g3highres.jpg &quot;/&gt; איור 3:. ממטרים מתנול-כלורופורם ברגע שהתאים-הזרע היה solubilized, החלק המסיס הוא מתנול, כלורופורם זירז כדי להבטיח denaturation של החלבונים וההסרה של חומרים מזהמים. גלולה החלבון מופיעה בממשק בין שלבי מתנול / מים וכלורופורם. השכבה העליונה היא הסירה בזהירות כדי לא להפריע גלולה זו. זה נפוץ לעזוב על 2-3 מ&quot;מ של השלב העליון באופן שלא הולך לאיבוד חלבון. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4:. פרופיל phosphopeptide אופייני Tio 2 -enriched שימוש בפרוטוקול המתואר, תאים-זרע epididymal הזנב היו מבודדים בשתי immotile (למעלה, N = 3) או מדינות ניעתי (למטה, N = 3). אשכול פפטיד עם מסה מונו-איזוטופי של ~ 651.5 Dמוצג להיות נוכח באוכלוסיות הניע אבל נעדרו לחלוטין בimmotile אלה (החץ). השוואות מסוג זה מכונים &quot;(המבוסס MS-) ללא תווית&quot;. מסת פפטיד וזמן שמירה משמשים לאחר מכן כדי למקד את המתחם לספקטרומטריית טנדם-מסה ולזהות את החלבון שממנו נגזר פפטיד.

Watch this Scientific Journal Video about Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa at JoVE.com

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

ניתוח Phosphopeptide של מכרסמים epididymal תאים-זרע

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  University of Newcastle. Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Video: Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

עקרונות של ניתוח מכרסמים למנתח חדש

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

מכרסם עבודת לב דגם לחקר ביצועי שריר לב ואת צריכת חמצן

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents have become essential models for cardiovascular research. However, spontaneous lethal cardiac arrhythmias that often cause mortality in heart disease patients are rare in rodent models of heart disease. This is primarily due to the species differences in cardiac electrical properties between human&#160;and rodents and poses a challenge to the study of cardiac arrhythmias using rodents. This protocol describes an approach to enable efficient transgene expression in mouse and rat ventricular myocardium using echocardiography-guided intramuscular injections of recombinant virus (adenovirus and adeno-associated virus). This work also outlines a method to enable reliable assessment of cardiac susceptibility to arrhythmias using isolated, Langendorff-perfused mouse and rat hearts with both adrenergic and programmed electrical stimulations. These techniques are critical for studying heart rhythm disorders associated with adverse cardiac remodeling after injuries, such as myocardial infarction.

The present protocol describes methods for transgene expression in rat and mouse hearts by direct intramyocardial injection of the virus under echocardiography guidance. Methods for the assessment of the susceptibility of hearts to ventricular arrhythmias by the programmed electrical stimulation of isolated, Langendorff-perfused hearts are also explained here.

ביטוי טרנסגני נגיפי בלבבות מכרסמים והערכת הסיכון להפרעות קצב לב

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...