עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי פרסים NIH / NCATS הקליני וTranslational המדע לאוניברסיטת פלורידה TL1 TR000066 וUL1 TR000064, תוספת גיוון מההורה גרנט R01AI056152 מהמכון הלאומי לבריאות, מענק מגיב BD Biosciences, ואת האוניברסיטה פלורידה.

כל השימוש בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש. 1. הכנת תערובות ומדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pH סטרילי PBS: 7.3 (1 ליטר) 0.23 גרם לאא 2 PO 4 1.15 גרם Na 2 HPO 4 9.0 גרם NaCl קח את נפח עם מים די. לעקר עם החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא תרבות מדיה (100 מיליליטר) 89 RPMI מיליליטר 10 מיליליטר 10% FBS 1 מיליליטר האנטיביוטיקה antimycotic (ABAM) 100 מיקרוגרם 50 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol (3.5 מיקרוגרם המניה 2-mercaptoethanol ל96.5 מיקרוגרם PBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% FBS FACS חיץ (Cell פלורסנט ההפעלה של מיון) (כדי לשמש במהלך cytometry זרימה) בPBS סטרילי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iTh17 מיקס (בהתבסס על מספר דוגמאות, לקבוע את עוצמת הקול דרוש לכל תערובות והתקשורת) 1.5 מיקרוגרם / מיליליטר אנטי CD28 20 ng / ml IL-6 5 ng / mlTGF-β </li></ol> 2. תאים יהיו מצופים בשלושה עותקים בתנאים הבאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מחויבת אנטי CD3, אנטי CD28 (זה תמהיל שליטת הפעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iTH17: צלחת מחויבת אנטי CD3, אנטי CD28, IL-6, TGF-β. </li></ol> 3. אנטי CD3 הנכנס פלייט (10 מיקרוגרם / מיליליטר) מומלץ כי הכנת צלחות אנטי CD3 הנכנס צלחת נעשה לפחות 4 שעות לפני מועד תאים יתווספו לצלחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl אנטי CD3 לבארות (אנטי CD3 הוא מדולל PBS סטרילי) של צלחת חדשה 96 גם U תחתון Microtest רקמות תרבות, ולהקיש על הצדדים של הצלחת כדי להבטיח כיסוי אחיד של הבארות. לדגור על C ° 37 עבור 4 שעות, ולאחר מכן שומרים במקרר עד שהגיעו הזמן להוסיף את תערובות ותאים לצלחת. </li></ol> 4. העכבר Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מבוסס על השימוש בC57BL / 6 מיקרופוןדואר, 3-8 חודשים של גיל, ושנרכש מהמעבדה ג&#39;קסון (בר הרבור, ME). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר באמצעות CO מחנק 2, ולאשר את המוות עם נקע בצוואר הרחם שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים לנתיחה עכברים ואזור חתך עם 70% אתנול ולהתחיל נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתצוגת הגחון, לתפוס את העור, כי הוא קדמי לפתיחת השופכה ולהתחיל לחתוך במספריים את קו האמצע הגחון עד שמגיע לאזור הסנטר. לנקוט באמצעי זהירות שלא לקרוע או לחתוך לציפוי הפנימי של קיר הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך לאחור על העור ולהצמיד כדי לאפשר גישה נוחה לבלוטות הלימפה בעת ההסרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות לימפה והטחול ייאספו כל יוסרו עם מלקחיים, והניחו בצלחת פטרי סטרילית המכילה 5 מיליליטר של autoMACS הפעלת המאגר נרכש מMiltenyi יוטכנולוגיים (ראה איורים 2 ו -3 לבלוטות לימפה ודיאגרמות הסרת טחול). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות הלימפה בבית השחי, כי הםנמצא ליד בית השחי (בית השחי) מאחורי שרירי החזה של כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות הלימפה זרוע הנמצאות ברקמות חיבור הממוקמים בסמוך זה לבית השחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות הלימפה בצוואר הרחם השטחיות שנמצאו בצווארו של כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות הלימפה מפשעתי אשר ממוקמות באזור הירך בשילוב של כלי דם 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגשת לבלוטות לימפה mesenteric, לחתוך דרך הצפק עד קו האמצע הגחון. בלוטות לימפה mesenteric נמצאות ברקמת החיבור שמחזיק את המעיים ביחד. בדרך כלל הם נמצאים בשרשרת של 4-8 צמתים, ועשויים להופיע כ&quot; מחרוזת פנינים &quot;. הקפד לשלוף את המחרוזת כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטחול נמצא באזור הבטן, מאחורי הקיבה ומעיים. להסיר אותה על ידי משיכת וניתוקו מהלבלב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחן את האיברים מתחת למכסת מנוע סטרילית באמצעות 2 שקופיות מיקרוסקופ חלבית. הנח בלוטות הלימפה או טחול עלבצד החלבית של שקופית אחת מיקרוסקופ, ולשפשף עם צד חלבית של השקופית השנייה ועד מתפורר. חזור על פעולה עד שכל בלוטות הלימפה והטחול כבר טחונים. </li></ol> הערה: מומלץ להתחיל עם בלוטות לימפה ולסיים עם הטחול, כמו הדם יעשה את זה קשה לראות את בלוטות הלימפה שנותרו במאגר autoMACs. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסנן איברי קרקע לתוך השעיה תא בודדת, להתחיל על ידי קיפול מעל פיסת ניילון 40 מיקרומטר כמה פעמים חומר, והצבה בחלקו העליון של צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. חומר הניילון צריך להיות בערך 3 x 3 פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 5 מיליליטר ו21 מחט G כדי לשאוב 5 מיליליטר של autoMACs ריצת איברי חיץ והקרקע. לוותר לאט לתוך חומר הניילון המקופל. תשמור על עצמך כדי למנוע ניקוב החומר עם המחט. </li></ol> הערה: לאחר ההשעיה תא בודד מושגת, הפתרון צריך להופיע כפתרון חיוור, עולה בקנה אחד עם שום visibחתיכות le של רקמה מוצקה. אם תישאר מוצקים, מחדש לשאוב ולוותר על דרך פיסה מקופלת חדשה מניילון להציב צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חדש. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לשמור על תאים על קרח כאשר אינו בשימוש. </li></ol> 5. הפרדת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות אופטימליות, להשיג לפחות 80% CD4 טהור + אוכלוסיית CD25 תאים באמצעות מפריד הנייד Pro autoMACS באמצעות MACS CD4 + CD25 + T רגולטוריים בידוד תא הערכה, העכבר. הפרוטוקול לשימור השלילי של אוכלוסיית CD25-תאי CD4 + מתקבל באמצעות Miltenyi ביוטכנולוגיים. </li></ol> 6. בידול Th17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אוכלוסיית CD25-תאי CD4 + אחרי פרידה עם מפריד הנייד Pro autoMACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים בדילול מלא ביחס 1:1000 עם trypan הכחול באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהריכוז כבר נקבע מספירת תאים, לדלל השעיה תא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת תרבות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את 96 צלחות גם עם הצלחת מחויבת אנטי CD3 לאחר 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות מצופות-CD3 אנטי עם 200 μl של PBS. חזור על 2 פעמים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף להוסיף 200 μl של PBS סטרילי לבארות מצופים אנטי CD3 ולהסיר PBS לתוך מיכל פסולת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של תמהיל iTh17 או תערובת שליטת הפעלת 100 μl (ראה # נקודה 2) לבארות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של תאים 100 μl לכל טוב שבו בכל תמהיל Th17 או תמהיל שליטת ההפעלה הושם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים לפחות 72 שעה או עד 5 ימים (ניתן להשיג בידול Th17 לאחר 72 שעה או לאחר 5 ימים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול Th17 ניתן להעריך על ידי ניתוח תאיים מכתים ותזרים cytometric, ELISA, או qPCR </li></ol> 7. הפעלת תא (נחוץ רק לתאי מכתים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 96 צלחות גם מחממות בסוף גם 72 שעות או 5 ימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נזכיר כי differentiatio Th17n יכול להיות מושגת לאחר שני 72 שעות או 5 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תנאי (שליטה למשל הפעלה או iTh17), להעביר תאים שנמצאים בשלושה עותקים לאחד טוב של צלחת תרבית תאים גם 24. התאים לתנאי אחד יש עכשיו כבר אספו לתוך אחד טוב של צלחת התרבות גם 24, בניגוד להיותו בשלושה עותקים בצלחת התרבות גם U התחתונה 96. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנפח הכולל של כל טוב בצלחת תרבית תאי 24 גם הוא החברה 600 μl. להעלות את עוצמת הקול של כל אחד גם למ&quot;ל 1 עם תקשורת תרבות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת PMA (אצטט phorbol Myristate) (50 ng / ml), ionomycin (1 מיקרומטר), והתואר הראשון (Brefeldin-) (10 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד בצלחת תרבית תאים גם 24 בריכוזים מופיעים ברשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על C ° 37 במשך 4 שעות. </li></ol> 8. מכתים תאיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם עם הסמנים תאיים ו תאיים הרצויים לניתוח התזרים cytometric. כדי לזהות את נוכחות oו IL-17, מכתים תאיים נעשה עם נוגדנים נגד IL-17A. סמני משטח תאיים מומלצים כוללים CD4, CD8, וCD25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תאית ציטוקין מכתים Starter Kit-מאוס מBD Bioscience עבור מכתים IL-17 תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, תאים גלולה, להסיר supernatant, ו resuspend תא גלולה ב200 μl FACS חיץ (2% FBS PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תאי resuspended ל96 תא זרימת cytometry צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים 5 דקות ב1,200 סל&quot;ד וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 PBS חיץ FACS μl, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל&quot;ד, וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב של FACS 100 μl חיץ ולהחיל של נוגדנים תאיים 100 μl תערובת (AB) (תערובת Ab תאית מורכבת בחיץ FACS). דגירה של 15 דקות ב RT, מכוסות בנייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב 8.1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2x חזור על צעד 8.1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בשל BD Cytofix / Cytoperm הצפת 100 μl. Incubאכלתי ל20 דקות ב RT, מכוסות בנייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של חיץ 1x BD פרם / לשטוף 100 μl, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל&quot;ד, וזורקים supernatant. חזור על פעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של תערובת Ab תאית. (תערובת תאית Ab הוא עשה ב1x BD פרם / לשטוף) דגירה במשך 15 דקות ב RT, מכוסה בנייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 8.1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב200 μl של BD מכתים הצפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תאי resuspended לcytometry זרימת צינורות המכילים 200 μl BD מכתים חוצץ (נפח סופי הוא 400 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 ° C עד דגימות מוכנות לקריאה. </li></ol></li></ol> 9. תזרים cytometric ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוכלוסיית תא חי שער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוכלוסיית התא החי, שער בCD4 + CD8-אוכלוסייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסוג CD4 + CD8-האוכלוסייה, שער על IL-17A + אוכלוסייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על תוצאות הניסוי הקודמות שלנו, של IL-17A + האוכלוסייה 100% יהיו + CD25. </li></ol></li></ol> * ספירת תאים מוחלטת סך הכל התקבלו לאחר איגום triplicates המדגם ** מספר מוחלט של CD4 + CD25 + IL-17A + תאים נקבע על ידי הכפלת המספר הכולל של תאים על ידי אחוז השער החי ואחוז התאים בסך הכל נושאים את סמני שושלת ספציפית, מסוג CD4, CD25, ו-IL-17A, כפי נקבע על ידי cytometry זרימה. 10. qPCR וELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מקום שאינו משמשים לניתוח התזרים cytometric בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf ו צנטריפוגות ב 13,000 סל&quot;ד 5-10 דק &#39;. התאים הנמצאים בתא גלולה לאחר צנטריפוגה ישמשו לניתוח qPCR. ניתוח qPCR בוצע באמצעות Cycler תרמית PTC-200 Peltier (BioRad). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant מן הצינורות centrifuged לELISAs. IL-17A ELISAs בוצע באמצעות צמד נוגדן TC11-18H10 (לכידה, מספר קטלוג 555,068) וביוטין TC11-8H4 (זיהוי, מספר קטלוג 555,067) שנרכש מBiosciences BD. IL-17A ELISA standards התקבלו מeBioscience (מספר קטלוג 14-8171-80). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant, resuspend התאים שנותרו כדי לשמש לqPCR ב175 מאגר תמוגה RNA μl (להשתמש באופן מיידי להפקת RNA, סינתזת cDNA, וqPCR, או בחנות ב-80 ° C לשימוש מאוחר יותר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בטבלה השנייה לרצפי פריימר לIL-17A ויקטין (גן בית שמירה) </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chen, Z., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+and+ROR&#947;T:+transcriptional+regulation+of+Treg+and+Th17.">Foxp3 and ROR&#947;T: transcriptional regulation of Treg and Th17.</a> International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).</li><li>Cua, D. J., Sherlock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-23+rather+than+interleukin-12+is+the+critical+cytokine+for+autoimmune+inflammation+of+the+brain.">Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain.</a> Nature. 421, 742-748 (2003).</li><li>El-Behi, M., Rostami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+views+on+the+roles+of+Th17+and+Th17+cells+in+experimental+autoimmune+encephalitis.">Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).</li><li>Inaba, K., Kroide, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+memory+T+lymphocytes+isolated+from+the+mixed+leukocyte+reaction.">Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction.</a> Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).</li><li>L, I. v. a. n. o. v. F. r. u. t. o. s. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+microbiota+direct+the+differentiation+of+IL-17-producing+T-helper+cells+in+the+mucosa+of+the+small+intestine.">Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine.</a> Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).</li><li>Jager, L. D., Dabelic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinase+Inhibitory+Region+of+SOCS-1+is+Sufficient+to+Inhibit+T+helper-17+Function+in+Experimental+Allergic+Encephalomyelitis.">The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis.</a> J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).</li><li>Kimura, A., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6:+regulator+of+Treg/Th17+balance.">IL-6: regulator of Treg/Th17 balance.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).</li><li>Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+transmitted+segmented+filamentous+bacteria+segregate+with+diabetes+protection+in+nonobese+diabetic+mice.">Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice.</a> PNAS. 108, 11548-11553 (2011).</li><li>Langrish, C. L., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation.">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).</li><li>Lau, K., Benitez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+1+diabetes+by+a+Lactobacillus+johnsonii+mediated+Th17+bias.">Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias.</a> J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).</li><li>Lee, Y., Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+TH17+cells.">Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells.</a> Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).</li><li>Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th17+and+regulatory+T+cells+in+mediating+and+restraining+inflammation.">Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation.</a> Cell. 140, 845-858 (2010).</li><li>O'Connor, W., Kamanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protective+function+for+interleukin+17A+in+T+cell-mediated+intestinal+inflammation.">A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation.</a> Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).</li><li>Picca, C. C., Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TCR+specificity+in+CD4+CD25++regulatory+T+cell+selection.">Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection.</a> Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).</li><li>Shah, K., Lee, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disregulated+balance+of+Th17+and+Th1+cells+in+systemic+lupus+erythematosus.">Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 12, R53 (2010).</li><li>Sospedra, M., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+Multiple+Sclerosis.">Immunology of Multiple Sclerosis.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).</li><li>Stockringer, B., Veldhoen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+function+of+Th17+T+cells.">Differentiation and function of Th17 T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGF&#946; in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24, 179-189 (2006).</li><li>Zou, Y., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+production+of+interleukin-17/interferon-&#947;+and+matrix+remodeling-associated+genes+in+experimental+Candida+albicans+keratitis.">Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-&#947; and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis.</a> Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).</li></ol>

אין גילויים להכריז.

כאן יש לנו תיארתי את הפרוטוקול כדי להשיג בידול Th17 במבחנה. המחקר של בידול Th17 חשוב, כמו בידול של T לימפוציטים מסוג למשנה Th17 הוא קריטי לחיסול היעיל של פתוגנים אנושיים 13. לעומת זאת, ייצור IL17 נקשר עם התקדמות מחלה אוטואימונית 13. השיטה של ​​בידול Th17 ישימה להגדרות מחקר רבות כפי שהוא יכול להיות מיושם על מודלים עכבריים מובהקים רבים של רגולציה ואוטואימוניות חיסונית. שיטה זו מסייעת לענות על שאלות בנוגע ליכולתם של לימפוציטים מסוג T, להתמיין לתא Th17, מצוינת בפרוטוקול זה על ידי הייצור של IL-17A והביטוי של גורם שעתוק RORγT, כדי לווסת את התגובה חיסונית. יתר על כן, הוכח על ידי אחרים שיכולים גם להיות מזוהים Th17 תאים על ידי הייצור של IL17F, Il22, ו-GM-CSF 8, 12. פרוטוקול זה הוא משמעותי ביחס לאחריםפרוטוקולים ידועים T התמיינות לימפוציטים, כגון Th1 או Th2 בידול, כי ניתן להשתמש בו כדי להשלים את הפרוטוקולים אלה כדי להבין טובים יותר כיצד פונקציות מפעיל לימפוציט T מתייחסות לפעולת מערכת חיסונית. ישנם מספר צעדים קריטיים בחשבון בעת ​​ביצוע ניסויים אלה. בידול Th17 יכול להיות מושגת באמצעות CD4 + CD25-אוכלוסייה טמאה, אבל לתוצאות האפקטיביות ואמינות ביותר, מסוג CD4 + CD25-אוכלוסייה של טוהר לפחות 80% הוא רצוי. השיטה שלנו מנצלת את הפרוטוקול המסופק על ידי Miltenyi יוטכנולוגיים למפריד הנייד שלהם autoMACS Pro. קיט + CD25 autoMACS CD4 + T רגולטורי בידוד תא, עכבר משמש לסלקציה שלילית של אוכלוסיית CD25-תאי CD4 +. סלקציה שלילית מאפשרת לשימוש בתאים נאיביים שלא היה שינו באופן פוטנציאלי על ידי אינטראקציות נוגדן. באמצעות סמנים פני תא מסוימים בניתוח התזרים cytometric יכול לאשר את הטוהר של apopulation. סמני המשטח המומלץ הם מסוג CD4, CD8, CD25 וכפי שהם יכולים בקלות לזהות את הסוג CD4 + הרצויים CD25-אוכלוסייה. B220 וCD11b עשוי לשמש לבדיקת תא B וזיהום מקרופאג, בהתאמה. דגימות מדוללת באופן עקבי ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר מומלץ גם כן מצאנו שהבידול האופטימלי תשואות הריכוז הזה. בעבר מצאנו כי ריכוזי תא שהיו גבוהים מדי או נמוכים מדי לעתים קרובות מוטרדים התרחבות סלולרית ותוצאות מוטות (כגון ייצור IL-17A מוטה). כמו כן, חשוב לזכור לשמור על דגימות קרח בכל העת כאשר אינו בשימוש. כדאיות תא היא גורם חשוב בהשגת בידול Th17 חיובי. זה יכול להיות אישר באמצעות ספירת תאים באמצעות דילולים trypan כחולים. מכיוון שפרוטוקול זה מעסיק המגון רקמה ידנית על ידי שחיקה בלוטות לימפה וטחול עם שקופיות מיקרוסקופ חלבית, זו יכולה להיות שיטת זמן רב. מו עיצוב אחדdification הוא לנצל dissociators רקמות אוטומטית כאופציה חלופית. במקרה שבידול Th17 הרצוי אינו מושגת, יש כמה טיפים ירי צרות שיש לשקול. ראשית, פקדים חייבים להיות גם לשקול בזהירות, כך שההיקף האמיתי של בידול Th17 ניתן למדוד כמו שצריך. אנחנו בדרך כלל לקבוע את מידת בידול Th17 על ידי השוואת תוצאות אלה לימפוציטים מסוג CD4 + T מקבל אנטי CD3 בלבד וגירוי אנטי CD28. זכור גם כי לימפוציטים מסוג CD4 + T צריכים להיות מופעלים בלהבדיל סדר. גם אחד צריך לבדוק חזותי תאים בתרבית תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את קיומו של ארור / תאי T מופעלים. תאי T מופעלים מופיעים חזותי באופן משמעותי גדולים יותר מאשר תאים שלא היה מגורה. התרחבות משובט גם ניתן לצפות באמצעות אשכולות גלויים של פיצוץ תאים שכבר נגזרו משיבוט תא T אחד. הפעלת תא יכולה להיות גם verified באמצעות השימוש בניתוח התזרים cytometric באמצעות אנטי CD4 ונוגדנים נגד CD25 לזהות תאים + הופעלו מסוג CD4 + CD25 4 כמו כן, חשוב לציין כי פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם עכברי C57BL / 6, לעומת זאת פרסמו נתונים מראה כי בידול Th17 עשוי להיות מושגת בזנים אחרים, כולל עכבר NOD ועכברי BALB / ג 5, 11, 20. יצוין, כי בידול Th17, כוללים תדירות כוללת ומספר מוחלט של לימפוציטים מסוג CD4 + T עוברים התמיינות, תלוי בגורמים גנטיים (כגון זן עכבר) 20, וגורמים סביבתיים (כגון מיקום מושבה) 5 ועשוי לדרוש אופטימיזציה. פרוטוקול הבחנה זו Th17 יכול לשמש כאמצעי רב ערך כדי לענות על עוד שאלות בנוגע לתפקודם של תאים בקבוצת משנה Th17. יש השיטה של ​​בידול Th17 שלנו יש כמה יתרונות משמעותיים. כפי שהוזכר בעבר השימוששל 80% CD4 טהור מינימום + אוכלוסיית CD25 התא מספקת תוצאת בידול יותר עקבית ויעילה. קלות בידוד באמצעות שימוש במפריד תא Pro autoMACS היא יתרון נוסף. יתר על כן השימוש באותות ציטוקינים והפעלה אופטימליים מספק תאי T עם הסביבה המתאימה שבו תוכל להבדיל. השלכות עתידיות עבור פרוטוקול זה כוללים קביעת האמצעים מכניסטית שבו תאי Th17 והייצור של IL-17A מעורבים בהתפרצות וההתקדמות של אוטואימוניות.

לימפוציטים מסוג CD4 + T (תאי T) לשחק תפקיד קריטי בהגנה בתיווך מערכת חיסון כנגד מיקרואורגניזמים מזהמים. לעומת זאת, תאי T גם קשר אינטימי עם תחילת ההתקדמות של מחלות אוטואימוניות כגון סוכרת מסוג 1, זאבת אדמנתית מערכתית, ודלקת מפרקים שגרונית. לימפוציטים מסוג CD4 + T להיות מופעלים באמצעות שילוב של קולטן תא T אינטראקציות (TCR) עם אנטיגן מאותו המקור / מורכב histocompatibility גדול השנייה מולקולות (MHCII), ואינטראקציות הקולטן CD28 עם B7.1/B7.2 ligands 15. בנוסף למתן גירוי TCR CD28 ושיתוף גירוי, תאי מציגי אנטיגן גם לספק סביבת ציטוקינים, הקובעת את מצב ההתמיינות של הלימפוציטים T, ובכך לכוון את התגובה של הלימפוציטים T לאנטיגן נתון. אינטראקציות הפתוגן מובחן / תא אנטיגן הצגה ליצור סביבות ציטוקינים שונות, אשר להטות T לימפוציטים למטה מסלולים שונים התמקדו באלייmination של הפתוגן ייזום. למרבה הצער, מסלולי מפעיל לימפוציט T, שנועדו במקור למיגור פולש פתוגנים, יכולים להיות מופנים בטעות נגד רקמות עצמי 15. לכן, הבנה טובה יותר של מצב הבידול של כל תת קבוצה של תאי CD4 + ברורה היא קריטית להבנה של איך לווסת את האיזון בין החיסול של פתוגנים וסובלנות לעצמי שלנו. בנוסף לTh1, Th2, ומסלולי התמיינות תאי T רגולטוריים מושרה, יכול גם להיות מונע על לימפוציטים מסוג T נאיבי ידי ציטוקינים במורד מסלול Th17. ואילו פתוגנים תאיים לחימה תאי Th1, תאי Th2 לחסל פתוגנים תאיים, ותאי T רגולטוריים (Tregs) למזער תגובות דלקתיות 1, 16; תאי Th17 לשחק תפקיד חשוב בחיסול חיידקים ופטריות תאיים. Th17 תאים בדרך כלל מצוינים על ידי ביטוי של גורם הייחוס ספציפי לשעתוק RORγT וייצור של IL-17A, אשר מקדם את ההפעלה של מקרופאגים ונויטרופילים 1, 7. תאי Th17 היו מעורבים בכמה הפרעות אוטואימוניות, ומודלים של המכרסמים הקשורים בם. כך, למשל, הודגם כי IL-23 (אשר נדרש כדי לקיים את הפנוטיפ Th17), אך לא IL-12, הוא האשם המרכזי בדלקת המוח אוטואימונית הניסויי (EAE), מודל המחלה המכרסם לטרשת נפוצה. זה לאחר מכן הוכח כי הפחתה בייצור IL-17 מתואמות לEAE מניעה 2, 6, 17. יתר על כן, תאי Th17 נקשרו עם הפרעות אוטואימוניות אחרות, כולל דלקת מפרקים וזאבת (לופוס) 10, 16. IL-23 p19 לקוי - / - עכברים הראו את מספרים נמוכים מאוד של תאי Th17, והם עמידים לפיתוח לא רק EAE, אלא גם בדלקת מפרקים קולגן-Induced, מודל לדלקת מפרקים שגרונית 10, 18. בנוסף, עכברים שטופלו בנוגדנים מנטרלים IL-17A בקע מירכי ספינהאה את התחלתה של דלקת מפרקים שנגרם קולגן נמצאה גם יש רזולוציה של נזק משותף 18. יצוין, כי תפקידיו של Th17 תאים בהתקדמות של מחלות אוטואימוניות עדיין לא מאופיינים כמו מחקר שנעשה לאחרונה הראה גם תפקיד המגן של תאי Th17 בסוכרת מהסוג 1 9, 11 ודלקת מעיים 14. מחקרים אלה מאשרים את החשיבות של בידול Th17 באוטואימוניות. בבידול Th17 מבחנה היא שיטת צורך במחקר בתאי T, כי יש לפחות שתי שאלות המביכות שדורשות חקירה נוספת: 1) איך בדיוק IL-6 אין להסדיר את האיזון בין Treg ובידול Th17, ו 2) מה הם המנגנונים המדויקים מאחורי IL-מושרה 17 מחלות דלקתיות? השיטה שלנו מעסיקה תאי CD4 + CD25-T מהטחול ובלוטות לימפה של עכבר C57BL / 6. חשוב לציין כי למרות שזה אפשרי כדי לגרום לבידול Th17 באמצעות טמאאוכלוסייה, רכישה לפחות 80% CD4 טהור + אוכלוסיית תאי CD25-T שוללת כל דאגה של זיהום ומבטיחה תוצאות בידול Th17 מוצלחות יותר. על מנת להשיג בידול Th17 תקין, תאים מסוג CD4 + CD25-T מודגרת בנוכחות אנטי CD3 ואנטי CD28, המספקים אותות הפעלה, 1 ו -2, בהתאמה, ו-IL-6, וTGF-β. למרות שזה כבר דווח כי IL-23 לבדו יכול לשמש כדי להשיג בידול Th17, זה היה מאוחר יותר הוכיח כי IL-23 הוא הכרחי ליציבותה של אוכלוסיית תאי Th17, אבל IL-6 ו TGF-β הוא חיוניים לבידול Th17 3, 18, ​​19. מחקרים עכבריים הראו כי קולטן IL-23 מתבטא בתאים מסוג CD4 + T רק לאחר שהם כבר מגורה עם IL-6 ו TGF-β 13, 18. כמו כן, תאי Th17 יהיו בהצלחה לפתח בנוכחות של IL-חסימת 23 נוגדנים כל עוד IL-6 ו TGF-β נמצאים 18, 19. ככזה, prov פרוטוקול בידול Th17 זהאידו התנאים המתאימים כדי לגרום לבידול Th17 בהצלחה. פיתוח הבנה טובה יותר של מנגנוני בידול Th17 ו-IL-17 ייצור נוכחי ההזדמנות לפיתוח תרופות טובות יותר שמטרתה הפרעות אוטואימוניות 13.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Polyestrene Petri Dish</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>0875713A</td>
 <td>60 mm x 15 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>autoMACS Running Buffer</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-091-221</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Premium Microscope Slides, Frosted</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>12-544-3</td>
 <td>3" x 1"1 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>309632</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Corning 15 ml Centrifuge Tubes</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CLS430791</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon 40 microns</td>
 <td>Miami Aquaculture</td>
 <td>Nylon 40/26</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtest tissue culture plate 96 well U bottom </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>35-3077</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Corning Costar 24 well cell culture plates</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CL3524</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Tubes 1.5 ml</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>05-408-129</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553057</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553294</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IL-6 Recombinant Protein</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>14-8061-62</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TGFbeta</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>240-B-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan blue solution 0.4 %</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>66H2364</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>558107</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>APC Rat Anti-Mouse CD8a</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE Conjugated Anti-mouse CD25</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>E01155-516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>560820</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>51-2041AK (559311)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-091-221</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ABAM </td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>30-004-CI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI</td>
 <td>Corning, Cellgro</td>
 <td>10-040-CM</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B 2-MercaptoEthanol</td>
 <td>MP Biomedical</td>
 <td>194834</td>
 <td>Hazardous</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin Calcium Salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>13909-1ML</td>
 <td>Hazardous</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brefeldin A (BFA)</td>
 <td>MP Biomedicals</td>
 <td>159027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Capture mAb </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555068</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Detection mAb </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555067</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ELISA IL-17A Standard</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>14-8171-80</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IL-2 ELISA Kit</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555148</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TMB Substrate Reagent Set </td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>autoMACS Pro Cell Separator</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-092-545</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Napco series 8000 WJ CO2 Incubator</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC-200 Peltier Thermal Cycler</td>
 <td>Biorad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation and th17 differentiation of na&iuml;ve cd4 t lymphocytes

תאי Th17 הם תת קבוצה ברורה של תאי T שנמצא לייצר אינטרלוקין 17 (IL-17), ונבדלים בפונקציה מתת התא האחר T כולל Th1, Th2, ותאי T רגולטוריים. Th17 תאים צמחו כאשם מרכזי בתגובות חיסוניים דלקתיות נלהבים מדי קשורות עם הרבה הפרעות אוטואימוניות. בשיטה זו אנו מטהרים לימפוציטים מסוג T מבלוטות הלימפה של הטחול ועכברי C57BL / 6, ולעורר תאי CD4 + T מטוהרים תחת שליטה וסביבות Th17 וישכנע. הסביבה וישכנע Th17 כוללת גירוי בנוכחות נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28, IL-6, וTGF-β. לאחר דגירה לפחות 72 שעות ועד חמישה ימים על 37 מעלות צלזיוס, תאים מנותחים לאחר מכן ליכולת לייצר IL-17 באמצעות cytometry זרימה, qPCR, וELISAs. יכולים להיות מנוצלים על תאי CD4 + CD25-T Th17 המובחן כדי להבהיר את התפקיד שתאי Th17 לשחק בתחילת ההתקדמות של אוטואימוניות ודה מארח נוסףfense. יתר על כן, התמיינות Th17 של CD4 + CD25-לימפוציטים מדגמי נוקאאוט / מחלה עכבריות מובחנים יכולה לתרום להבנה של פלסטיות גורל תא שלנו.

פרוטוקול הבחנה זו Th17 מתחיל עם ההסרה של הטחול ובית השחי, זרוע, mesenteric, צוואר הרחם, ובלוטות לימפה מפשעתי. ניתן למצוא ייצוג של המיקומים של כל אחד באיורים 2 ו -3. איורים 1 ו 5 שניהם מספקים ייצוג חזותי של השיטות שתוארו בפרוטוקול זה. פרוטוקול Th17 זה מתמקד בבידול מאוכלוסיית הלימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T. חשוב לציין באיזו יעילות הפרדת תא Pro autoMACS מעשירה CD4 הרצוי + CD25-אוכלוסייה מהצומת ונקוותה סך הלימפה והטחול (איור 4). , צומת unfractionated נקוותה לימפה וsplenocytes, ושברי autoMACS המופרדים הוכתמו עם נוגדני antiCD4 וantiCD25 אחרי ניתוח התזרים cytometric (איור 4). איור 4A מציג פרופיל מייצג של אחוז מסוג CD4 + CD25 +וCD4 + CD25-ימפוציטים הווה ב, בלוטות לימפה ונקווה unfractionated וטחול על ידי cytometry זרימה. הליך הבידוד מספק גם אוכלוסייה מסוג CD4 + CD25 + Treg מועשר מעכברי C57BL / 6 אשר יכול לשמש בניסויים נוספים (איור 4). איור 4C מציג העשרת התא הרצויה שלנו עם אוכלוסייה שהיא 84% תאי CD4 + CD25-T, עם הרוב המכריע של CD4 + CD25 + Tregs הוסר. יש לנו באופן עקבי אוכלוסיית תא שאינו הלימפה קטנה, שנמצאת בסוג CD4 + המועשר CD25-, אבל האם זה לא יפריע לתהליך ההתמיינות (איור 4C). אוכלוסיית התא שלנו העשירה מסוג CD4 + CD25-T מסייעת להבטיח בידול Th17 מוצלח יותר. איור 5 מראה סכמטי של הליך בידול Th17 שלנו. + CD25-CD4 האוכלוסייה המועשר שלנו גם היא מודגרות בתנאי ההבחנה Th17 (אנטי CD3, אנטי CD28, IL-6, וTGF-β) או שליטה (אנטי CD3, אנטי CD28). ניתן לראות באיור 6 שבעוד דגירה של לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T עם אנטי CD3, אנטי CD28 במשך 5 ימים הניבו לימפוציטים מסוג CD25 + T, דגירה בתנאי גרימת Th17 הניבה משנה של IL17 הפקה מסוג CD4 + CD25 + לימפוציטים. אנא עיין בטבלת 1 לדוגמאות של CD4 + CD25 + IL-17A + תשואות מספר מוחלטות לתא לאחר דגירה של 5 ימים בתנאי iTh17. מצב בידול Th17 נוסף ניתן להעריך באמצעות PCR כמוני וELISA. איור 7 מציג נתונים לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T מועשרים מודגרות תחת שליטה או תנאי Th17 וישכנע. לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T מודגרות בתנאי Th17 להסדיר את-IL17A, אשר יכול להיות הוברר דרך qPCR (איור 7 א) וELISA (איור 7). גורם שעתוק Th17 הספציפי RORγT גם שהוגברו על ידי תאים מסוג CD4 + CD25-T מודגרות בתנאי Th17 וישכנע, וניתן לקביעה through qPCR (איור 7 א). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50765/50765fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי בידול Th17. 1. בארות סמל של צלחת גם 96 תחתית-U עם אנטי CD3 (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בדילול מלא PBS. 2. צלחת מקום בחממה במשך 4 שעות ב 37 ° C. בעוד צלחת היא דוגרת, לנתח בלוטות לימפה (LN) וטחול מעכבר. טוחן את האיברים ולסנן לקבל השעיה תא בודדת. בודד תאי CD4 + CD25-T באמצעות ערכת בידוד תאי CD4 + CD25 + T רגולטורים ומפריד Pro Miltenyi autoMACS. CD4 + CD25-תאים צריך להיות מדולל ל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. 3. לאחר 4 שעות של הדגירה הצלחת 96 גם היא מלאה, לשטוף בארות עם PBS (200 μl / טוב) 3x. 4. הוספת 100 μl מסוג CD4 + תאי CD25-T לצלחת-מאוגדים (PB) בארות אנטי CD3 מצופים. 5. הוספת 100 μl אנטי CD28 או 100 μl coc iTh17<html> ktail (antiCD28, TGF-β, ו-IL-6). 6. דגירה צלחת במשך 3 או 5 ימים ב 37 ° C. הדגירה הבאה להעריך בידול על ידי צביעה תאית, qPCR, ו / או ELISA. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50765/50765fig2.jpg" /> איור 2. מדריך Dissection LN. א) ניתן למצוא לימפה צומת זרוע 1 ברקמת החיבור הממוקמת בסמוך זה לבית השחי (בית השחי) של עכבר. ב &#39;) ניתן למצוא בלוטות לימפה בבית השחי 1 בכל בית השחי, מאחורי שרירי החזה. C) בלוטות לימפה mesenteric ממוקמים ב רקמת חיבור של המעיים. הם דומים למחרוזת פנינים. ד &#39;) 4 בלוטות לימפה בצוואר הרחם שטחיות נמצאות בצוואר של העכבר. E) 2 בלוטות לימפה מפשעתי (1 בכל צד) יכולות להיות ממוקמות באזור הירך במיקום שבו 3 כלי דם נפגשים . <html> . = &quot;תמיד&quot;&gt; בתוך עמודים <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50765/50765fig3.jpg" /> איור 3. טחול מדריך לנתיחה. טחול עכבר נמצא בצד השמאל של הגוף מאחורי הקיבה ומעיים. פשוט להסיר על ידי משיכת והפרדה עם המלקחיים. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50765/50765fig4.jpg" /> איור 4. ברים ניידים מLN נקווה ותאי טחול לפני ואחרי תאי הפרדת LN Pro autoMACS.) והטחול היו מוכתמים, לשעבר vivo, להקים אוכלוסיות תאי בסיס לפני ההפרדה. ההפרדה הבאה, מסוג CD4 + CD25 + (ב) ו CD25-שברים מסוג CD4 + (ג) היו מוכתמים להעריך טוהר של CD4 + CD25 + ואוכלוסיות לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T, בהתאמה. כל הדגימות הוכתמו מסוג CD4 + ו + CD25 נוגדנים ונותחו על ידי cytometry זרימה. jove_content &quot;עבור: together.within-לשמור על עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50765/50765fig5.jpg" /> איור 5. Th17 בידול. דגירה תאים לתקופה של עד 5 ימים. קציר תאים מכתימים תאיים וqPCR; supernatants קציר לELISA. <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50765/50765fig6.jpg" /> איור 6. בידול Th17 הוערך על ידי cytometry זרימה. לימפוציטים מסוג CD4 + CD25-T הודגרו בנוכחות מאוגד צלחת אנטי CD3, אנטי CD28, IL-6, וTGF-β (iTh17) או צלחת בכריכה אנטי CD3 ואנטי CD28 בלבד (בקרה) עבור 5 ימים. תאים לאחר מכן הופעלו עם PMA וionomycin עבור 4 שעות ב 37 ° C. לאחר הפעלה, תאים היו מוכתמים אנטי CD4, אנטי CD8, אנטי CD25, ונוגדנים נגד IL-17A לניתוח התזרים cytometric להעריך בידול Th17. iTh17 = Th17 ג התרמהonditions. <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50765/50765fig7.jpg" /> איור 7. בידול Th17 הוערך על ידי qPCR וELISA. לימפוציטים מעכברי C57BL / 6 מוינו ותאי CD4 + CD25-T הודגרו בנוכחות, אנטי CD28 (מיליליטר 1.5 מיקרוגרם / אנטי CD3 (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בכריכת צלחת ), IL-6 (20 ng / ml), וTGF-β (5 ng / ml) או) תאי צלחת בכריכה אנטי CD3 ואנטי CD28 בלבד (בקרה) למשך 5 ימים. היו אז נקטפו להעריך RORγT Supernatants וביטוי הודעת IL-17A באמצעות qPCR. B) נקצרו להעריך ביטוי חלבון IL-17A על ידי ELISA.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÂ¯ve CD4 T Lymphocytes at JoVE.com

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

isolation-and-th17-differentiation-of-nave-cd4-t-lymphocytes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

34.3K Views.  The University of Florida.  עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגוב?...

Video: Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל