Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01HL105826 e K02HL114749 (Dr. Sadayappan) e American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) e 13POST14720024 (Dr. Govindan). Os autores agradecem o apoio de Dr. Jimmy Page, Jill Clampit e Dr. John Hudson, MSD, pelo excelente suporte técnico e literatura no desenvolvimento do ensaio.

1. Uniplex cMyBP-C Assay <ol><li> Um dia antes do experimento, casaco da placa padrão nu 96 poços MSD com anticorpo de captura. Para cMyBP-C, usar um volume il de 30 de rato anticorpo anti-cMyBP-C monoclonal (gelatina livre), a uma concentração de 5 ug / ml diluído em tampão fosfato salino (PBS). </li><li> Uma vez que o poço é hidrofóbico, pipetar a solução para o canto inferior do poço; toque os lados da placa para espalhar a solução ao longo de todo o poço. </li><li> A placa é coberta com um selante de placa e incubadas O / N a 4 ° C sem agitação. </li><li> Remover a solução de anticorpo de captura tocando a solução ao longo de um lavatório e, em seguida, sobre uma pilha de toalhas de papel. A ligação não específica para a placa é bloqueada por adição de 150 ul de uma de 5% (w / v) de bloqueador Uma solução (BSA alto grau) em PBS a cada poço. </li><li> Selar a placa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, agitando a 700 rpm. </li><li> Durante o passo de bloqueio, preparar as normas e splos. Adicione a série padrão diluindo fragmento da proteína recombinante cMyBP-C (aminoácidos 1-271), para uma concentração de partida de 2,000 ng / ml em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS. Depois dilui-se sequencialmente por um factor de 5 em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS. Total de sete padrões + 1 em branco (1% (w / v) de bloqueador Um apenas PBS /) foram usadas. </li><li> Remover a solução de bloqueio e lavar a placa 3 vezes com 150 ul de 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Cada vez, remover a solução de lavagem através da inversão da placa de cima de uma pia. Após a terceira etapa de lavagem, vigorosamente apertar o prato sobre uma pia e seque a placa vigorosamente sobre uma camada de papel toalha até que esteja completamente seco. Este é um passo crucial, como volumes de incubação são pequenos, e qualquer solução de lavagem restante irá diluir significativamente a próxima incubação. </li><li> Pipetar 25 ul de padrões e das amostras nas cavidades. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente, agitando a 700 rpm durante 1 hora. </li><li> Preparar a solução de anticorpo de detecção de 1 ug / ml em 1% bloqueador A / PBS. A cuestômagos feito anticorpo cMyBP-C (aminoácidos epitopo 2-14) com MSD sulfo-TAG rotulagem serve como anticorpo de detecção. Kits estão disponíveis para SULFO-TAG rotulagem, tornando-se um procedimento relativamente simples para rotular qualquer anticorpo. </li><li> Repetir o passo de lavagem, tal como descrito na etapa 1.4. </li><li> Adicionar 25 ul de solução de anticorpo de detecção para cada poço, selar a placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora num agitador de placas definida a 700 rpm. </li><li> Durante o período de incubação, executar MSD da demo placa (placa com luzes LED) para garantir o funcionamento adequado do Imager Sector e software (consulte a seção de reagentes). Além disso, diluir o-tampão de leitura, que é fornecido pela MSD, por adição de 5 ml de 4x ler-tampão de 15 ml de água destilada. </li><li> Repetir o passo de lavagem, tal como descrito na etapa 1.4. </li><li> Adicionar 150 ul de leitura tampão em cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Certifique-se de evitar bolhas de ar (pipetagem reversa é um método adequado). Após a adição da leitura tampão, verificar imediatamente a placa no sectorImager. </li></ol> 2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB e cTnI Assay <ol><li> A placa de 96 poços 3-Plex e diluente soluções são deixadas a equilibrar à temperatura ambiente antes do uso. Esta placa é pré-revestido com anticorpos de captura para cMyBP-C, CK-MB e cTnI pela MSD. </li><li> Adicionar 25 ul de 1% (w / v) de bloqueador A / PBS a cada poço. Os lados da placa para assegurar que todo o poço é coberto pela solução. </li><li> Selar a placa com o selador de placa, coloque a placa em um shaker prato, e agitar a 700 rpm por 30 min. </li><li> No entanto, uma série de diluições de calibradores individuais é preparado. Porque cada poço tem três anticorpos de captura três calibradores necessidade de ser misturado e diluído em série antes da utilização. Diluir recombinante cMyBP-C, CK-MB (MSD), e TIc (MSD) em conjunto em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS, para criar uma amostra de 2,000 ng / ml cMyBP-C, com 100 ng / mL de CK- MB, e 25 ng / mL TIc (amostra A). </li><li> Um volume final de pelo menos 100 ul é preparado para cada padrão. Acompletar a série padrão, diluir em série das amostras são, por um factor de 5. Usar 25 ul da amostra A em 100 uL de 1% (w / v) de bloqueador A / PBS para criar amostra B. Em seguida, utilizar 25 ul de amostra B, em 100 ul de 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS para criar Amostra C , e assim por diante. Amostras de soro humano de 16 pacientes com IAM e 16 indivíduos controle foram usados ​​para medir cMyBP-C, CK-MB, e os níveis de cTnI. Estas amostras foram diluídas 2x em 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS. </li><li> Adicionam-se 25 ul dos padrões e das amostras diluídas aos 25 ul já presente nos poços da placa 3-Plex. É importante também incluir um espaço em branco (apenas solvente). Para estabelecer a técnica, as amostras são carregadas em triplicado técnicos. Caso contrário, as duplicatas são suficientes. </li><li> Selar a placa novamente (vedante de placa pode ser reutilizada) e incubar num agitador de placas (700 rpm) a temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Imediatamente antes da incubação é terminada, a solução de anticorpo de detecção é preparado. O diluente utilizado é de 1% (w / v) de bloqueador A em PBS. Todos thrOs anticorpos de detecção de ee SULFO-marcadas são diluídos em conjunto a uma concentração final de 1 ug / ml cada. Anticorpos de detecção são normalmente fornecidos com uma concentração estoque de 50x. </li><li> Para uma placa de 96 poços completo, é necessário 2,700 ml de solução total diluído (com erro de pipetagem incluídas). Adicionar 54 ul de cada um dos anticorpos de detecção de 2538 ul de 1% (w / v) de bloqueador de A / PBS. </li><li> Após 2 horas, retire soluções sacudindo vigorosamente a placa acima de uma pia. Lavar os poços 3x com 150 mL de 0,05% de Tween-20 em PBS. Adicionar 25 ul de solução de anticorpo de detecção para cada poço utilizando uma pipeta multicanal, e os lados da placa são virados para garantir que todo o poço é coberto pela solução. </li><li> Selar a placa e incubar durante 1 hora, agitando a 700 rpm. </li><li> Durante o período de incubação, executar MSD da demo placa (placa com luzes LED) para garantir o funcionamento adequado do Imager Sector e software. Também diluir o-tampão de leitura, que é fornecido pela MSD, por adição de 5 ml de 4x leituraamortecer a 15 ml de água destilada. </li><li> Repetir o passo de lavagem descrito no passo 2.8. </li><li> Adicionar 150 ul de leitura tampão em cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Evitando bolhas de ar é crítica (pipetagem reversa é um método adequado). Após a adição da leitura tampão, verificar imediatamente a placa na Imager sector. </li></ol>

<ol>
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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

A plena aplicação da patente está pendente (Petição N º de série 13/464, 466, Pub. No. EUA 2012/0282618 A1 e Data:. 05/04/12) para determinar os fatores de risco associados com a degradação cMyBP-C e liberação no fluido corporal humano e quantificar o nível de cMyBP-C no fluido do corpo humano.

Neste estudo, mostra a aplicabilidade de um imunoensaio multiplex para a detecção de múltiplos marcadores cardíacos no soro de pacientes. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre ELISA tradicional. Primeiro, ECL no kit de ensaio é utilizado em vez de detecção colorimétrica. Em ECL, um sinal eléctrico estimula a produção local de propriedade medida (de luz), desacoplando assim o evento estimulação do sinal, o que reduz o fundo 14. Isto permite uma elevada sensibilidade, como pode ser visto na <...

A medição de baixas quantidades de proteína em amostras biológicas complexas, tal como o soro, é de crescente importância para a gestão clínica do paciente, assim como a ciência básica. Por exemplo, um aumento dos níveis séricos de marcadores cardíacos, tais como a troponina I, num ambiente clínico é consistente com enfarte agudo do miocárdio (MI) 1. Para detectar proteínas em amostras de soro, padrão de ensaio imunoenzimático (ELISA), é a técnica utilizada na maioria das vezes, uma vez que tem uma elevada sensibilidade e permite a quantificação absoluta de analito. No entanto, os testes ELISA tradicionais exigem uma quantidade relativamente grande de amostra (normalmente 100 l), tem alto sinal de fundo em alguns fluidos biológicos, e são restritas para a medição de um único analito por ELISA 2. Recentemente, uma nova técnica de imunoensaio foi introduzido que contorna muitos destes inconvenientes. Este ensaio modificado, desenvolvido pela MSD, utiliza electrochemiluminesccia (ECL) para a detecção de sinal, o que permite por um fundo muito baixo e uma sensibilidade aumentada, permitindo a utilização de pequenos volumes de amostra. Electroquimioluminescência é baseado na molécula repórter ruténio (II) trisbipyridal, que está ligado aos anticorpos de detecção. Esta molécula repórter emite luz a 620 nm após a estimulação eléctrica do fundo da placa de 96 poços, que tem eléctrodos de carbono integrados neles 3. Além disso, por meio de revestimento local, os anticorpos de captura múltiplas podem ser revestidos para um poço (até 10 numa placa de 96 poços), permitindo a quantificação simultânea de proteínas diferentes numa única amostra 4. Esta técnica tem sido recentemente usado para medir perfis de citoquinas pró-inflamatórias em soro 5,6. As placas de multiplex MSD comparam favoravelmente com outras plataformas de ensaio multiplex 7. Usando MSD como a plataforma de ensaio primário, desenvolvemos mais uma custom made placa 3-plex que cuma quantificar simultaneamente o nível de ligação às proteínas miosina cardíaca-C (cMyBP-C), creatina-quinase MB (CK-MB) e troponina I (cTnI), e os resultados foram comparados com detecção Monoplex de cMyBP-C. CK-MB e cTnI são biomarcadores bem estabelecidos para MI. No entanto, os aumentos destes biomarcadores pode ser causada por outras patologias que MI, por exemplo miocardite ou insuficiência renal 8. Isto argumenta a favor da adição de biomarcadores adicionais para aumentar a especificidade do diagnóstico de EM. Mostrámos recentemente que cMyBP-C é também um biomarcador potencial de MI 9. cMyBP-C é uma proteína associada filamento grosso que é expresso no coração, 10-12, mas não nos músculos esqueléticos ou lisa. Assim, o aumento do nível de cMyBP-C no sistema circulatório é um indicador específico de danos cardíacos 13. Neste estudo, comparou-se a detecção de Uniplex cMyBP-C com a utilização de um ensaio de 3-Plex personalizado para medir os níveis séricos decMyBP-C, CK-MB e cTnI no soro de pacientes com MI. No futuro, esta técnica de assinatura pode ser usado para diagnosticar MI em pacientes com dor torácica na sala de emergência. O conselho de revisão institucional (IRB), da Loyola University Chicago aprovou o estudo para o uso de amostras humanas deidentified eo uso do imunoensaio (LU # 20392).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Biomarcadores são cada vez mais importante na tomada de decisão clínica, bem como a ciência básica. Diagnóstico de enfarte do miocárdio (MI) é amplamente determinado por detecção de proteínas cardíacas específicas no soro ou plasma do paciente, como um indicador de lesão do miocárdio. Tendo recentemente demonstrado que a proteína de miosina cardíaca-C (cMyBP-C) é detectável no soro após o IM, propusemos como um biomarcador potencial de MI. Os biomarcadores são tipicamente detectados por sandwich enzyme-linked immunosorbent tradicionais. No entanto, esta técnica requer um grande volume de amostra, tem uma pequena gama dinâmica e pode medir apenas uma proteína de cada vez. Aqui, mostramos um imunoensaio multiplex no qual três proteínas cardíacas pode ser medida simultaneamente com elevada sensibilidade. Medindo cMyBP-C em Uniplex ou em conjunto com creatina quinase MB e troponina I apresentaram sensibilidade comparáveis. Esta técnica utiliza a Meso Scale Descoberta(MSD) método de multiplexação de uma placa de 96 poços juntamente com electroquimioluminescência para a detecção. Enquanto apenas pequenos volumes de amostra são necessários, elevada sensibilidade e uma grande gama dinâmica são alcançados. Usando esta técnica, medimos cMyBP-C, MB da creatina quinase e os níveis de troponina I em amostras de soro de 16 pacientes com IAM e compararam os resultados com 16 indivíduos de controle. Fomos capazes de detectar todos os três marcadores nestas amostras e encontrou os três biomarcadores para ser aumentado após o IM. Esta técnica é, portanto, adequado para a detecção sensível de marcadores cardíacos em amostras de soro.

Os princípios básicos e fluxo de trabalho do ensaio 3-Plex são mostrados na Figura 1, e o fluxo de trabalho geral está descrito na Tabela 1. Ensaios UNIPLEX trabalhar ao longo do mesmo princípio, excepto que toda a parte inferior também é revestida com um anticorpo de captura. A detecção do sinal é feito por ECL em que um sinal eléctrico é aplicado à parte inferior do poço. Isto, por sua vez, inicia uma produção local de luz através de uma reacção química da leitura ...

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A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarcadores de medição em amostras biológicas complexas é cada vez mais guiando tomada de decisão clínica. Nós descrevemos um método altamente sensível para medir simultaneamente miosina cardíaca binding protein-C, MB da creatina quinase e troponina I em amostras de soro de pacientes com infarto do miocárdio e controle de indivíduos saudáveis.

Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

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