이 연구는 건강 보조금 국립 연구소 R01HL105826 및 K02HL114749 (박사 Sadayappan)와 미국 심장 협회 중서부 장학금에 의해 투자되었다; 11PRE7240022 (씨 Barefield)와 13POST14720024 (박사 Govi​​ndan). 저자는 기꺼이 분석을 개발하고 그들의 우수한 기술과 문학 지원을위한 박사 지미 페이지, 질 Clampit 박사 존 허드슨, MSD의 도움을 인정합니다.

1. Uniplex cMyBP-C의 분석 <ol><li> 캡처 항체 실험, 코트는 96 - 웰 MSD 베어 표준 플레이트 전날. cMyBP-C의 경우, 5 ㎍ / 인산에 희석 ML의 농도로 마우스 단일 클론 항 cMyBP-C 항체 (젤라틴 무료)의 30 μL 볼륨을 사용 (PBS) 염분 버퍼. </li><li> 잘 소수성이기 때문에, 잘 하단 모서리에 솔루션을 피펫, 다음 전체도에 걸쳐 솔루션을 확산 판의 측면을 누릅니다. </li><li> 플레이트는 플레이트 봉인으로 덮여 떨고없이 ° C 4에서 O / N을 배양한다. </li><li> 싱크대 후 종이 수건의 스택에 해결책을 눌러 캡처 항체 솔루션을 제거합니다. 판에 비 특정 바인딩은 5 % (W / V) 차단 각각의 well에 PBS에서 A (고급 BSA) 용액 150 μl를 추가하여 차단됩니다. </li><li> 700 rpm으로 흔들어 RT에서 1 시간 동안 접시와 부화를 밀봉하십시오. </li><li> 차단 단계에서 표준을 준비하고의불가능한 명령어. 1 % 2,000 NG / ML (W / V) 차단 PBS /의 시작 농도 - 재조합 cMyBP-C 단백질 조각 (271 아미노산 1)을 희석하여 표준 시리즈를 확인합니다. 다음 직렬 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에 5 배 희석. 7 기준 총 + 1 빈 (1 % (W / V) 차단기 A / PBS 만)을 사용 하였다. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 150 μL 0.05 % (v / v)의 Tween-20/PBS와 배 접시를 씻으십시오. 때마다, 싱크대 위의 반전 플레이트 세척 용액을 제거. 세 번째 세척 단계 후, 적극적으로는 싱크대 접시를 가볍게하고 완전히 건조 될 때까지 종이 타월 레이어에 적극적으로 판을 두드려. 배양 볼륨이 작아서 이것은 중요한 단계이며, 나머지 세척 솔루션은 크게 다음의 배양을 희석합니다. </li><li> 우물에 표준 시료의 피펫 25 μL. 1 시간 동안 700 rpm으로 흔들어 동안 RT에서 접시와 부화를 밀봉하십시오. </li><li> 1 % 차단 / PBS에 1 ㎍ / ㎖에서 검출 항체 솔루션을 준비합니다. CUMSD 설포-TAG 라벨 검출 항체의 역할에 - STOM은 cMyBP-C 항체 (14 항원 아미노산 2)를 만들었다. 키트는 어떤 항체를 레이블링하는 비교적 간단한 절차를 만들고, 설포-TAG 라벨에 사용할 수 있습니다. </li><li> 로 단계 1.4에서 설명한 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 각각의 well에 탐지 항체 용액 25 μl를 추가, 쉐이커 700 rpm으로 설정 한 접시에 1 시간 동안 RT에서 플레이트와 부화를 밀봉하십시오. </li><li> 배양 기간 동안 부문 영상 및 소프트웨어 (시약 섹션 참조)의 적절한 기능을 보장하기 위해 MSD의 데모 플레이트 (LED 조명 플레이트)를 실행합니다. 또한, 15 ML 증류수에 배속 읽기 버퍼의 5 ML을 추가하여 MSD에 의해 제공됩니다 읽기 버퍼, 희석. </li><li> 로 단계 1.4에서 설명한 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 well에 읽기 버퍼 150 μl를 추가합니다. 기포 (역 피펫은 적절한 방법이다)을 방지해야합니다. 읽기 버퍼를 첨가 한 후, 즉시 분야에서 접시를 스캔영상. </li></ol> 2. 3 복잡한 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 분석 <ol><li> 96 - 웰 3 - 플렉스 플레이트와 희석제 솔루션은 사용하기 전에 RT 평형을 할 수 있습니다. 이 판은 MSD에 의해 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 대한 캡처 항체 사전 코팅. </li><li> 1 % (w / v)의 차단 각각의 well에 A / PBS의 25 μl를 추가합니다. 전체도이 솔루션이 포함되어 있는지 확인하기 위해 접시의 측면을 누릅니다. </li><li> 플레이트 봉인 플레이트를 밀봉 판 뿌리에 접시를 놓고 30 분간 700 rpm으로 흔들어. </li><li> 한편, 개별 교정기의 희석 시리즈는 준비가되어 있습니다. 각 잘 개의 캡처 항체를 가지고 있기 때문에 세 교정기는 혼합 수와 직렬로 사용하기 전에 희석해야합니다. 2000 NG / ML cMyBP-C, 100 NG / ML로 하나의 샘플을 만드는 1 %에 함께 재조합 cMyBP-C, CK-MB (MSD) 및 cTnI는 (MSD) (W / V) 차단기 A / PBS에 희석 CK- MB, 25 NG / ML cTnI는 (샘플). </li><li> 최소 100 μL의 최종 볼륨은 각 표준에 대한 준비가되어 있습니다. 에표준 시리즈를 완료 순차적으로 샘플 5 배 희석 있습니다. 시료 25 μl를 사용하여 100 ㎕의 1 % (W / V) 차단제 샘플 C를 만들려면 100 ㎕의 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에서 샘플 B의 25 μl를 사용하는 다음 예제 B.를 만들 수있는 A / PBS에 , 등등. MI 16 과목과 16 명의 대조군에서 혈청 샘플은 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 수준을 측정하는 데 사용되었다. 이러한 샘플은 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에 2 배 희석 하였다. </li><li> 3 플렉스 플레이트의 우물에 이미 25 μL를 기준 희석 한 시료 25 μl를 추가합니다. 또한 빈 (전용 희석제)를 포함하는 것이 중요합니다. 방법을 설정하려면, 샘플 기술 triplicates로드됩니다. 그렇지 않으면, 중복 충분하다. </li><li> 다시 플레이트를 밀봉 (플레이트 봉인을 재사용 할 수 있습니다) 2 시간 동안 RT에서 접시 흔드는 (700 RPM)에 품어. </li><li> 부화가 완료되기 전에, 탐지 항체 솔루션이 준비되어 있습니다. 사용 희석제는 PBS에 1 % (w / v)의 차단이다. 모든 THR전자 설포 태그가 검출 항체 1 ㎍ / ㎖ 각각의 최종 농도에 함께 희석된다. 탐지 항체는 일반적으로 50X 주식 농도에 제공됩니다. </li><li> 전체 96 - 웰 플레이트에 대해 총 희석 용액 2,700 μL를 (에러 포함 피펫과)가 필요합니다. 2,538 ㎕의 1 % (w / v)의 차단 PBS / 각 검출 항체의 54 μl를 추가합니다. </li><li> 2 시간 후, 적극적으로 싱크대 위에 접시를 가볍게 치면 솔루션을 제거합니다. 0.05 % PBS에서 트윈-20의 150 μL와 우물 배를 씻으십시오. 에 탐지 항체 솔루션의 25 μl를 추가하는 각 잘 멀티 채널 피펫을 사용하고 접시의 측면은 전체도이 솔루션이 적용되도록 탭합니다. </li><li> 플레이트를 밀봉하고 700 rpm으로 흔들어 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 배양 기간 동안 부문 영상 및 소프트웨어의 적절한 기능을 보장하기 위해 MSD의 데모 플레이트 (LED 조명 플레이트)를 실행합니다. 또한의 배속 읽기 5 mL를 추가하여 MSD에 의해 제공됩니다 읽기 버퍼, 희석15 ML 증류수로 버퍼입니다. </li><li> 단계 2.8에서 설명한 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 읽기 버퍼 150 μl를 추가합니다. 공기 방울을 피하는 것이 중요하다 (역 피펫은 적절한 방법입니다.) 읽기 버퍼를 첨가 한 후, 즉시 분야 영상의 플레이트를 검사합니다. </li></ol>

<ol>
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인간의 체액에 cMyBP-C 저하 및 배출과 관련된 위험 요인을 결정하는 : 전체 특허 출원 (05/04/12. 응용 프로그램 일련 번호 464분의 13, 466, 펍 번호 미국 2012 / 0282618 A1) 및 Date (날짜) 보류 인간의 체액에 cMyBP-C의 수준을 정량.

본 연구에서는 환자의 혈청에서 여러 심장 바이오 마커의 검출을위한 다중 면역의 적용을 보여줍니다. 이 기술은 기존의 ELISA를 통해 많은 장점이 있습니다. 첫째, 분석 키트 ECL은 비색 검출 대신 사용됩니다. ECL에서 전기 신호, 따라서 배경 14 감소 신호의 자극 이벤트를 연결을 풀기, 측정 속성 (빛)의 현지 생산을 자극한다. 이 표 2에서 볼 수 있듯이, 높은 감도 수 있습니다. <...

같은 혈청과 같은 복잡한 생물 학적 샘플, 단백질의 낮은 양의 측정은 환자의 관리뿐만 아니라 기초 과학에 대한 성장 임상 중요하다. 예를 들어, 임상 환경에서 이러한 트로포 닌 I와 같은 심장 바이오 마커의 혈청 수준에있는 증가는 급성 심근 경색 (MI) 1과 일치한다. 그것은 높은 감도를 가지고 있으며, 분석의 절대 정량을 허용으로 혈청에있는 단백질을 검출하는 표준 효소 결합 면역 분석 (ELISA)는 가장 자주 사용되는 기술이다. 그러나 전통적인 ELISAs는 샘플 상대적으로 많은 양의 (일반적으로 100 μL) 필요로하는 일부 생물학적 체액에서 높은 배경 신호를 가지고 있고, ELISA 2 당 하나의 분석의 측정으로 제한됩니다. 최근 새로운 면역 기술은 이러한 단점을 많이 우회하는 도입되었습니다. 이 수정 된 분석은, MSD에 의해 개발, electrochemiluminesc를 사용작은 샘플 볼륨의 사용을 가능하게 매우 낮은 배경과 감도를 증가 수 있습니다 신호 검출을위한 레퍼런스 (ECL). Electrochemiluminescence이 검출 항체에 부착 기자 분자 루테늄 (II) trisbipyridal을 기반으로하고 있습니다. 이 기자 분자들을 3에 통합 된 탄소 전극을 가지고 96 - 웰 플레이트의 바닥의 전기 자극에 620 nm의 빛을 방출한다. 또한, 현장 코팅을 사용하여 여러 개의 캡처 항체는 하나의 견본에 다른 단백질의 동시 정량 있도록 잘 하나 (최대 10 96 - 웰 플레이트에)으로 코팅 할 수 있습니다. 이 기술은 최근 혈청 5,6에서 염증성 사이토 카인 프로파일을 측정하는 데 사용되었습니다. MSD에서 멀티 플레이트는 호의적 ​​다른 멀티 플렉스 분석 플랫폼 7 비교합니다. 기본 분석 플랫폼으로 MSD 사용하여, 우리는 또한 3 플렉스 플레이트를 만든 사용자 지정을 개발하는 C동시에 심장 미오신 결합 단백 C (cMyBP-C), 크레아틴 키니 아제 MB (CK-MB), 및 심장 트로포 닌 I (cTnI는)의 수준을 정량화하고, 결과는 cMyBP-C의 monoplex 감지 하였다. CK-MB 및 cTnI는 미시간 잘 확립 된 생체 있습니다. 그러나 이러한 생체의 증가는 예를 들어, 심근염이나 신장 장애 8, MI 이외의 병리에 의해 발생할 수 있습니다. 이 MI 진단의 특이도를 높이기 위해 추가로 생체의 추가를 위해 주장하고있다. 우리는 최근 cMyBP-C는 MI 9에 대한 잠재적 인 바이오 마커 것으로 나타났습니다. cMyBP-C은 심장 아니라 골격이나 부드러운 근육에 10-12로 표현 두꺼운 필라멘트 연관된 단백질이다. 따라서, 순환 시스템의 cMyBP-C의 증가 수준은 심장 손상 13의 특정 지표입니다. 본 연구에서는 혈청 수준을 측정하기 위해 사용자 지정 3 복잡한 분석의 사용과 cMyBP-C의 uniplex 검출 비교cMyBP-C, CK-MB, 및 MI 환자의 혈청 cTnI는. 미래에이 서명 기법은 응급실에서 흉통 함께 제시 환자에서 MI를 진단하는 데 사용할 수 있습니다. Loyola 대학 시카고의 기관 심의위원회 (IRB)는 deidentified 인간의 샘플의 사용과 면역의 사용 (LU # 20392)에 대한 연구를 승인했다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

바이오 마커뿐만 아니라 기초 과학, 의사 결정 임상에서 점점 더 중요 해지고 있습니다. 진단 심근 경색 (MI)는 주로 심근 손상의 지표로 환자의 혈청 또는 혈장 내 심장 특정 단백질을 감지하여 구동된다. 최근 심장 미오신 결합 단백 C (cMyBP-C)은 MI 후 혈청에서 감지 할 수 있다는 것을 보여 한, 우리는 MI에 대한 잠재적 인 바이오 마커로 제안했다. 바이오 마커는 일반적으로 전통적인 샌드위치 효소 결합 면역 분석에 의해 감지됩니다. 그러나,이 기술은 큰 샘플 볼륨을 필요로하는 작은 동적 범위를 가지고 있으며, 한 번에 하나의 단백질을 측정 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 3 개의 심장 단백질은 높은 감도를 동시에 측정 할 수있는 멀티 플렉스 면역을 보여줍니다. 크레아틴 키나제 MB와 심장 트로포 닌과 uniplex 또는 함께 cMyBP-C를 측정하는 나는 비교 감도를 보여 주었다. 이 기술은 메조 스케일 검색을 사용하여검출 electrochemiluminescence과 함께 96 - 웰 플레이트에 멀티플렉싱 (MSD) 메소드. 단지 작은 샘플 볼륨이 필요하지만, 높은 감도와 넓은 다이나믹 레인지를 얻을 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 cMyBP-C, 크레아틴 키나제 MB와 심장 트로포 닌 MI 16 과목에서 혈청 샘플에서 나는 수준을 측정하고 16 대조군과 결과를 비교 하​​였다. 우리는이 샘플에서 세 마커를 감지 할 수 있었고, MI 후 증가 할 세 가지 바이오 마커를 발견했다. 이 기술은 따라서 혈청 샘플에서 심장 생체의 과민 한 탐지에 적합합니다.

3 복잡한 분석의 기본 원칙과 워크 플로우는 그림 1에 표시되며 전체 워크 플로우는 표 1에 설명되어 있습니다. Uniplex의 분석은 전체 바닥이 잘 한 캡처 항체로 코팅 된 것을 제외하고는 동일한 원리에 따라 작동합니다. 신호 검출 전기 신호가 잘 하단에 적용되는 ECL에 의해 이루어집니다. 이것은, 차례로, 검출 항체에 설포-TAG 레이블 읽기 버퍼의 화학 반응을 통해 빛의 현...

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A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

복잡한 생물학적 시료의 측정 생체 점점 의사 결정 임상 지침입니다. 우리는 동시에 심장 미오신 결합 단백 C, 크레아틴 키나제 MB, 심근 경색 및 건강한 대조군과 과목에서 혈청 샘플에서 심장 트로포 닌 I를 측정하는 매우 민감한 방법을 설명합니다.

Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

a-sensitive-specific-quantitation-method-for-determination-serum

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K 조회수.  Loyola University Chicago. 복잡한 생물학적 시료의 측정 생체 점점 의사 결정 임상 지침입니다. 우리는 동시에 심장 미오신 결합 단백 C, 크레아틴 키나제 MB, 심근 경색 및 건강한 대조군과 과목에서 혈청 샘플에서 심장 트로포 닌 I를 측정하는 매우 민감한 방법을 설명합니다.

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PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

연구

생물학

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within the brain, ascorbate acts in a neuroprotective and neuromodulatory manner that involves ascorbate cycling between neurons and vicinal astrocytes - a relationship that appears to be crucial for brain ascorbate homeostasis. Additionally, emerging evidence strongly suggests that ascorbate has a greatly expanded role in regulating cellular and systemic iron metabolism than is classically recognized. The increasing recognition of the integral role of ascorbate in normal and deregulated cellular and organismal physiology demands a range of medium-throughput and high-sensitivity analytic techniques that can be executed without the need for highly expensive specialist equipment. Here we provide explicit instructions for a medium-throughput, specific and relatively inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Ascorbate plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. Here we describe a medium-throughput, specific and inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

배양 된 세포의 내부와 세포 외 아스 코르 빈산의 결정에 대한 신속하고 특정 마이크로 분석

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

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