מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

הפרוטוקול שלנו מכיר בצורך לשחזר טוב יותר את מחסום הדם-מוח האנושי במבחנה לצורך חקר מנגנונים תאיים מורכבים המשפיעים על ההתאוששות לאחר שבץ. המודל המשולש שלנו מפגין שלמות איתנה הקשורה בחלקה למידור גדול של תוספות באר, מה שמאפשר לנו להקטין את תדירות השינויים ולמנוע הפרעה לאוכלוסיות. המודל שלנו הוא כלי נהדר לחקר השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים במחסום הדם-מוח במהלך שבץ איסכמי ולאחריו.

הפרוטוקול שלנו מאפשר גילוי של מטרות וטיפולים חדשניים לשיפור ההתאוששות לאחר שבץ מוחי. הטיפולים הקיימים כיום בשבץ איסכמי הם רגישים לזמן וכתוצאה מכך אינם תמיד יעילים. התחילו בטיפוח HBVP בצלוחיות תרבית T75 עם משטח פעיל להדבקת תאים בתוך חממה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש.

ברגע שמגיעים למפגש, שאפו את מדיום הפריציטים הישן ושטפו את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS חם של דולבקו. שאפו את ה-PBS של דולבקו ונתקו את התאים מהבקבוקון באמצעות שילוב של ארבעה מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA חמה ומיליליטר אחד של PBS של דולבקו. לדגור את הבקבוקון במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני.

מבט תחת מיקרוסקופ כדי לוודא אם התאים מנותקים מהבקבוקון. הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום פריציטים חם המכיל 2% FBS לבקבוקון והעבירו את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של מתלה התא במשך שלוש דקות ב 200 גרם המאפשר לתאים ליצור גלולה בתחתית הצינור.

שאפו את המדיום מהצינור כדי להבטיח שכדור התא יישאר שלם. להשעות מחדש את גלולת התא במדיום פריציטים. חשב את כמות המדיום בהתאם למפגש התאים ומספר תוספות הבאר הדרושות.

קח 10 מיקרוליטרים של תאים תלויים מחדש, הכנס אותם לתוך שקופית ספירת תאים, וספור את מספר התאים. לקבוע את צפיפות התא ואת זרע 300, 000 תאים לכל להוסיף מיליליטר אחד של מדיום pericyte על הצד abluminal של מוסיף היטב. טפחו אסטרוציטים אנושיים ראשוניים באמצעות מדיום האסטרוציטים המכיל 2%FBS כמתואר בכתב היד של הטקסט.

לקבוע את צפיפות התאים ואת הזרע 300, 000 תאים לכל באר על החלק התחתון של תרבית רקמה שש צלחות היטב. מכסים את הצלחת כדי למנוע אידוי ודוגרים למשך הלילה. באופן דומה, טפחו HBMEC במנות תרביות רקמה באמצעות מדיום קלאסי שלם המכיל 10% FBS כמתואר בכתב היד של הטקסט.

הוציאו את תרבית הרקמה שש צלחות באר המכילות אסטרוציטים ואת תוספות הבאר המכילות פריסיטים מהאינקובטור. שאפו את מדיום האסטרוציטים מתרבית הרקמה שש צלחות באר והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום פריציטים ומיליליטר אחד של מדיום אסטרוציטים לכל באר. שאפו את מדיום הפריציטים מתוספות הבאר והכניסו אותם לתרביית הרקמה צלחות שש בארות המכילות את האסטרוציטים שנזרעו.

זרע HBMEC בצפיפות של 300, 000 תאים לכל באר בשני מיליליטר של מדיום קלאסי שלם על הצד האפי של אותה באר מוסיף. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS של דולבקו. עבור תרביות תאים משולשות הנתונות למחסור בחמצן-גלוקוז, יש להוסיף מדיום נטול גלוקוז הן לתאים האפיקליים והן לתאים הבזולטרליים.

החלף את מדיום התרבית בתרביות תאי בקרה בינוניות ונורמוקסיות טריות. הצבת תרביות בקרה משולשות בחממה של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הניחו צלחת פטרי המכילה 20 מיליליטר מים סטריליים בתא האינקובטור של היפוקסיה כדי לספק לחות מספקת של התרביות.

פתח את התא על ידי שחרור מהדק הטבעת, ולאחר מכן סדר את תרביות התאים על המדפים. אטמו את החדר על ידי אבטחת מהדק הטבעת. פתח את פתחי הכניסה והיציאה של התא וחבר את הצינורות מראש מד הזרימה של התא.

חברו את הצינורות מתחתית מד הזרימה למיכל הדלק באמצעות מסנן אוויר. פתח את שסתום בקרת זרימת המיכל על ידי סיבובו נגד כיוון השעון כדי לאפשר זרימת גז מינימלית. פתח באיטיות את שסתום ווסת הלחץ על ידי סיבוב בכיוון השעון.

שוטפים את התא עם תערובת הגז במשך חמש דקות בקצב זרימה של 20 ליטר לדקה. נתקו את התא ממקור הגז וסגרו היטב את שני מהדקי הפלסטיק הלבן. כבה את שסתום בקרת זרימת המיכל על ידי סיבוב בכיוון השעון.

סגור את שסתום וסת הלחץ על ידי סיבוב נגד כיוון השעון. מניחים את תא ההיפוקסיה באינקובטור קונבנציונלי שנקבע על 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. הכנס את מכשיר ה- TEER המעוקר לארון הביו-בטיחותי וחבר את האלקטרודות למד האפיתל וולט אוהם.

לעקר את האלקטרודות ב 30 מיליליטר של 70% איזופרופיל אלכוהול תמיסת מינימום של 30 דקות. הפעל את מכשיר ה- TEER והגדר את הפונקציה לאוהם. הסר את האלקטרודות מתמיסת האלכוהול 70% איזופרופיל והנח אותן ב-20 מיליליטר של PBS של Dulbecco למשך 30 דקות לפחות עד שהקריאה הדיגיטלית במכשיר TEER תקרא אפס אוהם.

מכניסים את הפתח הארוך של האלקטרודה דרך אחד משלושת הפתחים בהאנגר הבאר של הבאר הריקה מורידים אותה עד שהיא נוגעת בתחתית הבאר. ודא כי הפתח הקצר מונח מעל התרבות apical בתחתית הבאר. המתן עד לביטול ערכי הקריאה הדיגיטלית במכשיר TEER לפני הקלטת הערך.

החזירו את האלקטרודות ל-PBS של דולבקו כדי לשטוף אותן בין המדידות. המשך לאסוף את כל מדידות ה- TEER עבור שני פקדי הוספה ריקים נוספים. אסוף את מדידות ה- TEER של לוחות הדגימה כפי שהודגם קודם לכן.

לאחר ביצוע כל המדידות האלקטרודה חזרה לתמיסת אלכוהול 70% איזופרופיל למשך 30 דקות. לאחר מכן נתק את האלקטרודות ממכשיר TEER ואפשר להן להתייבש באוויר. חישוב ערכי TEER.

שאפו את המדיום מהתא הבזולטרלי והחליפו אותו בשני מיליליטרים של מדיום צמיחת תאי אנדותל אדום חופשי פנול במודל מחסום הדם-מוח של תרבית תאים משולשת. שטפו את התאים בתא האפיקלי פעמיים עם HBSS. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת הדקסטרן FITC בתא האפיקלי וכסה את הצלחת ברדיד אלומיניום, ולאחר מכן הנח את הצלחת באינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעה אחת.

קח 100 microliters של בינוני מן התאים basolateral ולהעביר אותו לתוך צלחת שחורה 96 היטב. מדוד את הפלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרו-לוחות כאשר העירור ואורכי גל הפליטה מוגדרים ל-480 ו-530 ננומטר, בהתאמה. זרע 200 מיקרוליטרים של HBMEC, אסטרוציטים ראשוניים, ו- HBVP במרכז פולי-D-ליזין מצופה 35 מ"מ זכוכית תחתית כלים בצפיפות של 150, 000 תאים לכל צלחת.

לפני זריעת HBMEC, מצפים את תחתית הכלים עם גורם ההצמדה. אפשרו לתאים להתחבר למשטח הזכוכית על ידי השארתם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר ההגעה למפגש, יש להשליך את מדיום התרבית ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום נטול גלוקוז שחומם מראש למחסור בחמצן-גלוקוז או מדיום רגיל לבקרה.

לאחר טיפול במחסור בחמצן-גלוקוז, החליפו את המדיום במדיום המותאם להדמיה בכל הכלים, ולאחר מכן בצעו הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים עם מסנן GFP ואינקובטור מיקרוסקופ קונפוקלי בשלב העליון כמתואר בכתב היד של הטקסט. שלמות המחסום של מונולייר האנדותל בתצורות מודל מחסום הדם-מוח שצוינו הוערכה על ידי קביעת TEER לפני ואחרי מחסור בחמצן-גלוקוז, כמו גם לאחר 24 שעות של חמצון מחדש. במשך ארבע שעות החסך בחמצן-גלוקוז גרם לירידה משמעותית בערכי TEER רק במונוקולטורה של HBMEC ובמודל התרבית המשותפת עם HBMEC ו-HBVP.

רמות נמוכות אלה הגיעו לרמות הבסיסיות לאחר 24 שעות של חמצון מחדש. ערכי ה-TEER במודל התרבית המשולשת היו גבוהים משמעותית מאלו שבבקרות הקו-תרבית הכפולות או בבקרת מונוקולטורה מיד לאחר מחסור בחמצן-גלוקוז. החדירות העל-תאית של מונו-שכבות אנדותל למסה מולקולרית של 20 קילו-דלטון, FITC dextran, הוגדלה באופן דרסטי במונוקולטורה של HBMEC ובמידה פחותה במודל התרבית המשותפת עם HBMEC ו-HBVP בהשוואה לבקרות נורמוקסיות.

יתר על כן, רמות חדירות דקסטרן FITC של 20 קילודלטון היו הנמוכות ביותר במודל מחסום המוח-דם המשולש מבין כל הדגמים בתנאים נורמוקסיים ומחסור בחמצן-גלוקוז. לא נצפו שינויים ב-70 קילו-דלטון, שטף דקסטרן של FITC על פני מונו-שכבות אנדותל באף אחד מהמודלים. כל הסוגים האנושיים העיקריים שנחשפו למחסור בחמצן-גלוקוז הפגינו פלואורסצנטיות ירוקה חזקה, מה שמוכיח שהתאים החיים המצולמים היו היפוקסיים.

לאחר זריעת פריסיטים וסקולריים במוח האנושי בצד האבלומינלי של תוספות באר, חשוב מאוד לכסות אותם עם צלחת הפוכה כדי למנוע אידוי. במודל שלנו אנו משתמשים בקוטר נקבוביות קטן יחסית, 0.4 מיקרומטר, של בארות פוליאסטר, מה שהופך אותו למתאים לסינון של מועמדים לתרופות לכל מחלה הדורשת חציית מחסום הדם-מוח לטיפול. טכניקה זו מספקת הזדמנות מצוינת לדמיין שינוי של חלבונים ומובילים במידת הצורך.