פרסום זה מומן על ידי האנזימים במחקר מחקר סביבת תיאום הרשת נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע בארה&quot;ב (DEB # 1,021,559). מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע בארה&quot;ב (DEB # 1,021,559), והמחלקה של משרד האנרגיה של מדע (מחקר הביולוגי וסביבתית) בארה&quot;ב. כל דעות, ממצאים ומסקנות או המלצות לידי ביטוי בחומר זה הם אלה של הכותבים ואינם בהכרח משקפות את הדעות של NSF האמריקאי.

1. Assay קמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית 3 צלחות גם עמוקות: &quot;דוגמא&quot;, &quot;MUB סטנדרטי&quot;, ו &quot;סטנדרטי MUC&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כל תקן (MUB של 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, ו100 מיקרומטר) ומצע (BG, CB, לנדנד, Phos, XYL, AG, LAP) לתוך מאגרים נקיים נפרדים, prelabeled (אוריינטציה בשורות) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה סטנדרטית MUB המתאים לתוך בארות המקבילה צלחת MUB סטנדרטית (טבלה 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של 0 MUB מיקרומטר לשורה של צלחת סטנדרטית MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של 2.5 מיקרומטר MUB לשורה ב &#39;של צלחת סטנדרטית MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl 5 MUB מיקרומטר לתוך C השורה של צלחת סטנדרטית MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של 10 MUB מיקרומטר לD שורה של צלחת סטנדרטית MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של 25 MUB מיקרומטר לתוך E השורה של צלחת סטנדרטית MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של 50 MUB מיקרומטר לתוך השורה F של צלחת סטנדרטית MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של 100 μMUB M לשורת G של צלחת סטנדרטית MUB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 1.3.1 - 1.3.8 לסטנדרטי MUC לתוך בארות המתאימות הצלחת סטנדרטית MUC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> slurries אדמה הכנה עבור כל דגימת קרקע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 2.75 גרם של אדמה לחה שדה לתוך בלנדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 91 מיליליטר של 50 חיץ מ&quot;מ. ערבב על גבוה דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים תוכן בלנדר לתוך קערת זכוכית נקייה לפחות רחבה ככל פיפטה 8 ערוצים עם בר ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על צלחת ומערבבים, לערבב תרחיף אדמה על נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 800 μl של תרחיף קרקע לעמודה ראשונה של הצלחת לדוגמא (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור ל1 עמודת st לסטנדרטים של MUB וצלחות MUC הסטנדרטי (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את בלנדר מוט, צלחת ומערבבים ומערבבים עם DI H 2 O או חיץ בין דגימות קרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4.1 - 1.4.7) עבור כל דגימה, עוברים לטור הבא עם כל דגימת קרקע שלאחר מכן (לוחות 1 ו2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את המצע המתאים (בדוגמא זו, 200 מיקרומטר ריכוזים) לתוך בארות המתאימות הצלחת לדוגמא (טבלה 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של מצע BG לשורה של צלחת לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של מצע CB לשורה ב &#39;של צלחת לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של מצע נאג לתוך C השורה של צלחת לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של מצע Phos לD שורה של צלחת לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של מצע XYL לE שורה של צלחת לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של מצע AG לשורת F של צלחת לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של מצע LAP לשורת G של צלחת לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 1.5.1 - 1.5.7 לכל צלחת מדגם טמפרטורת דגירה. </li></ol></li></ol> 2. דגירה של צלחות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הצלחות עמוקות היטב (&quot;דוגמא&quot;, &quot;סטנדרטי MUB&quot;, ו &quot;סטנדרטי MUC4 ;) עם מחצלות צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך כל צלחת (אטום) ביד עד לפתרון הוא מעורב באופן יסודי (~ 10x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צלחות בחממה מתאימה לתקופת הנדרשת זמן דגירה (לוח 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את הזמן ראשוני כשעה 0. גם להקליט פעמים הדגירה המתאימות, כך שאתה יודע מתי להסיר את הצלחת מן החממה (לוח 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף כל תקופת דגירה, צנטריפוגה הצלחות אטומות במשך 3 דקות ב ~ 2,900 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסמכה, להעביר 250 μl מכל טוב של הצלחות גם עמוקות מודגרות לתוך בארות מקבילות בצלחות 96 היטב עם תחתית שטוחות שחורות (צלחת אחת שחורה תשמש לכל צלחת גם עמוקים מודגרות). חשוב להעביר דגימות מהצלחות גם עמוקות מודגרות לאותו בארות (כלומר A1 ... A12, וכו &#39;) בצלחות השחורות עם תחתית שטוחה 96 היטב (טבלת המס&#39; 1, 2). </li></ol> 3. מדידות ניאון עלfluorometer Microplate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הוראות יצרן לקורא צלחת fluorometric משמש, להגדיר את אורך גל העירור ל365 ננומטר ואורך גל פליטה 450 ננומטר (או להשתמש במסננים מתאימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את שלוש צלחות על fluorometer. חשובות: דגימות וצלחות סטנדרטיות (כלומר MUB או MUC) יש לקרוא תוך שימוש באותו הרווח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ספקטרופוטומטר לעלייה אוטומטית ולקרוא את צלחות MUC וMUB רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רווח למצב ידני, ולהקטין את הערך מלהיות אופטימלי למספר הנמוך ביותר הבא, מעוגל לחמש הקרובים ביותר, לכל צלחת רגילה. חזור 2x לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הרווח לאוטומטי ולהפעיל את הצלחת לדוגמא. הפעל מחדש את הצלחת לדוגמא באופן ידני כדי להתאים את הרווח הגבוה ביותר עבור כל אחת מהצלחות רגילה (כלומר MUB וMUC). </li></ol></li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את נתוני הקרינה עקומת סטנדרט לגיליון אלקטרוני לMUB (לוח 4 א) וסטנדרטי MUC (4 ב טבלה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת ריכוזים (מיקרומטר) עד (μmol) (4 א שולחנות ו -4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתוני הקרינה עקומת הסטנדרט של כל מדגם, לחשב את השיפוע, חיתוך-y, ו-R 2 ערכים עבור MUB וMUC (μmol) ריכוזים סטנדרטיים. R 2 ערכים מקובלים יעלה 0.98 עבור כל דגימה (4 א שולחנות ו -4). זה עשוי להיות שימושי כדי להמחיש עקומות סטנדרטיות בעלילה פיזור; עם הקרינה קורא זממה כמשתנה התלוי (ציר ה-Y) והריכוז סטנדרטי (μmol) זמם כמשתנה הבלתי תלויה (ציר x) (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכל להשתמש במדרון MUB וMUC הסטנדרטי עקום וערכי חיתוך-y לחישוב המדגם + נתוני הקרינה גלם מצע לEEAS פוטנציאלי. עליך להזין ראשון המדגם + נתוני הקרינה גלם מצע לתוך גיליון אלקטרוני חדש (לוח 5 א </strong&gt;). אתה גם צריך להיכנס לזמן הדגירה (HR) ומשקל יבש אדמה עבור כל דגימה (5 ב טבלה). שים לב, בזמן הערכים שהוזנו בדוגמא זו הם 3 שעות, כי הדגימות הודגרו ב ° C25 (לוח 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הערכים ליירט עקומה סטנדרטיות מערכי הקרינה המדגם המקביל ולאחר מכן לחלק ידי שיפוע העקום המקביל הסטנדרטי (לוח 5 ג). כדי להשיג זאת, לסדר מחדש את משוואת קו רגילה לפתור למדגם ריכוז אנזים (x); x = (י.ב.) / מ &#39;שבו: = קריאת y [הקרינה מדגם גלם; b = ליירט מMUB או עקומת MUC תקן; מ&#39; = שיפוע מMUB או עקומת תקן MUC]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל μmol מדגם, מהצעד 4.3.1 לעיל, על ידי 91 מיליליטר (חיץ בשימוש בתרחיף אדמת נפח) (5D טבלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקבל ערך הפרד בשלב 4.3.2 על ידי המדגם ספציפי זמן הדגירה ומסה יבשה אדמה (5e טבלה): AMT אנזים [. (&amp; #956; mol) x 91 דגירה x מיליליטר (HR) x אדמה יבשה (ז) x 0.8 מיליליטר x 1,000] הערה: 0.8 מיליליטר הוא הנפח של תרחיף המשמש גם בכל אחד, ו -1,000 מתקן לכמות הקרקע בפועל בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את הערך שהושג בשלב 4.3.3 על ידי 1,000 כדי לקבל את היחידות הרצויות (אדמה / hr היבש פעילות nmol / g) (5F טבלה). </li></ol></li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

המדידה מבוססת המעבדה של EEAS אדמה הפוטנציאלי יכולה לספק תובנות חשובות תגובות חיידקים לסביבת אביוטי, והשלכותיהם על תפקוד מערכת אקולוגית. התוצאות של ערכת נתוני דוגמא זו מראות כי הבדלים מינימאליים קיימות בפעילות אנזים קרקע או קינטיקה בין חלקות טיפול האקלים. עם זאת, מגמות הפוכות בין חלקות יעודדו חקירה נוספת של משתנים שעשויים להשפיע על הייצור של EEAS חיידקים כגון רטיבות קרקע, pH קרקע או גידול צמחים. בסך הכל, הערכת EEAS במונחים של (1) EEA הכללי בקרקעות, (2) stoichiometry EEA (3) אנרגיית חלקות ארניוס / הפעלה, ו (4) ש 10 מספק קשת רחבה של גישות שיכולים להצביע על תהליכים ברמת המערכת האקולוגית שממנו לאפיין וחסונה דינמיקה תפקודית מערכת אקולוגית בקרקע. מבחני EEA הקרינה מבוססת תפוקה גבוהה הם כלי שימושי שנמצא בשימוש נרחב כדי לבחון EEAS פוטנציאל בקרקעות וסביבות אחרות. חשוב לציין, פעילויות פוטנציאליות משקפות את גודל בריכת אנזים, אך לא על ידי עצמם לכמת שיעורי ייצור או למחזור אנזים 46. למרות הטכניקה היא פשוטה יחסית, הבדלים לכאורה בין קטין מעבדה פרוטוקולים יכולים לעכב את ההשוואה של תוצאות 13. למרבה הצער, אין לנו כרגע שולט חיובית סטנדרטית מתאימה לEEAS. השימוש ביחסי stoichiometric הוא גישה אחת להתגבר על אתגרים אלה. אחרת, כניסתו של טכניקות תפוקה גבוהה קידמה את המחקר של אנזימים בסביבה 4. פרשנות מדוקדקת של הנתונים המופקים על ידי מבחני אלה עשויות להבהיר את המגמות חשובות בפעילות חיידקים. חוסנו של הפרוטוקול נובע מהיכולת לבחור לתנאים ספציפיים לדוגמאות בודדות, אבל זה יכול גם לגרום למגבלות. סדרה של שינויים שתידרש על מנת להבטיח דגימות נמדדות במדויק ל<html> אתרי תחום פרט: חוצץ החיץ שתבחר יהיה תלוי ברמת החומציות של הקרקע. חציצה גם מייצבת את עוצמת הקרינה של הסטנדרטים הניאון, שהוא מאוד pH תלוי 27,47. חיץ pH, כי בדרך כלל אנו משתמשים על מנת להפוך את תרחיף האדמה הוא אצטט 50 מ&quot;מ נתרן או חיץ טריס אשר נבחר לקבועה של החיץ מסוים חומצת דיסוציאציה (pKa) לאדמת ההתאמה הטובה ביותר - רמות ה-pH מדגם. נתרן אצטט יש pKa של 4.76, וטריס יש pKa של 8.06 כך הכמויות של שני מאגרים אלה ישתנו כדי להגיע pKa הרצוי למדגם הבודד. חיץ פוספט (pKa = 7.2) כבר הציע לקרקעות ניטרליות / מעט בסיסיות. עם זאת, אנו מזהירים לבדיקת השתנות אנליטיות במחקרים ראשוניים לפני השימוש במאגר הזה, כמו ריכוזי פוספט גבוהים עלולים להפריע לפעילות אנזים. טיפול ואחסון של מצעי ניאון jove_content &quot;&gt; מבחני הקרינה יכולים לסבול מהפרעות שנגרמו על ידי זיהומים ו / או חוסר יציבות של תרכובות רבות ניאון כאשר הם נחשפים לאור, ולכן נדרשת זהירות בעת הטיפול במצעי ניאון. אנו ממליצים בחום מזעור כל חשיפה לאור שלכותרתו fluorescently מצעים וMUB וסטנדרטים MUC . שימוש בבקבוקי זכוכית בצבע ענבר או כיסוי הזכוכית ומכולות המשמשת להכנת ואחסון מצעים וסטנדרטים ניאון מומלץ מאוד; רדיד אלומיניום לעטוף כלי זכוכית ומיכלי עובד היטב בדומה לכך, ביעילות ביחסינו צלחות והעברה לחממות כהות היא התרגול הטוב ביותר אנו ממליצים.. אחסון מצעים וסטנדרטים (-20 מעלות צלזיוס) במשך זמן רב יותר ללא מחודשיים (בזמן שהגנה עליהם מפני אור); ומצעי הפשרה (5 מעלות צלזיוס) ~ 24-48 שעה לפני תחילת assay האנזים (ים). עיצוב ושכפול לחשבון הטוב ביותר עבור גם לווריאציות מדגם כן, יישום Negativפקדי assay דואר ו( אם אפשר) assay משכפל מומלץ. וריאציה מתרחשת בדרך כלל כתוצאה מהבדלים בכמות חלקיקי אדמה בכל טוב ושגיאות pipetting. לכן, ערבוב חזק וטכניקת pipetting טובה באופן משמעותי לצמצם גם לוריאציה כן. יתר על כן, אנו ממליצים בחום יישום בקרה שלילית assay (חיץ + פתרון מצע) כדי לפקח על חוסר עקביות מצע לאורך זמן. זה יכול להיות במעקב בקלות בעת קריאת צלחות אנזים על ידי השוואת בארות בקרה שליליות (בדרך כלל אנו משתמשים בטור האחרון על צלחות 96 היטב). פקדי מצע שליליים הם בדרך כלל יציבים, ולכן מגביר את האות הרבה מעל גבול גילוי, זה מעיד על זיהום או חוסר יציבות מצע, הדורש החלפה של המצע ו / או פתרונות סטנדרטיים. כדי למקסם את התפוקה, הפרוטוקול שלנו כולל מספר EEAS הפוטנציאלי בmicroplate גם עמוק אחת, למרות שפרוטוקולים אחרים לבצע סוג אחד שלassay לכל צלחת (כלומר מצע אחד לכל צלחת) מאז EEAS שונה מתרחש בקצב שונה. בכל מקרה, אנזים אופטימיזציה חייבת להתבצע על קרקעות לפני ביצוע גבוה זו גישה או גישת צלחת אחת לאורך כל דרך. מצעים מרובים ניתן להשתמש בצלחת אחת, אם שיעורי התגובה הם עקביים יחסית לכל אנזים בתוך תקופת הדגירה הזמן. הפרוטוקול שלנו ממליץ ~ 2.75 אדמה גרם כדי להפוך את פתרון slurry, בעוד ~ 1 גרם מומלץ בפרוטוקולים אחרים 24. אנו מציעים כי באמצעות יותר אדמה (אם אפשר) הוא גישה יעילה ללכידה טובה יותר בתוך מדגם הווריאציה אדמה ברמות פעילות אנזים. בפרוטוקול זה, אנו דגירה 800 μl של תרחיף אדמה עם 200 מצע μl, בעוד שאחרים דגירה רק 200 μl של תרחיף אדמה עם 50 μl של מצעים. זה פשוט פונקציה של קנה מידה עד שסופו של דבר לא משנה את הפעילות הנמדדת. ישנם גם יתרונות מעשייםלשימוש בנפחים גדולים יותר. אחד, קל יותר, כדי למנוע חלקיקי אדמה תוך pipetting למתאים צלחות 96 היטב עם תחתית שטוחות שחורות לפני הקלטת עוצמות על fluorometer. שנית, הנפח נוסף הוא שימושי במקרה של דליפות מקריות בעת העברת הצלחות 96 היטב עם תחתית שטוחות השחורות לfluorometer לפני הקלטת עוצמות הקרינה הקשורות לאנזים. אפילו סטיות קלות בנפח באופן משמעותי תקטן הקרינה בין בארות. לבסוף, בשל אופי התפוקה הגבוה של פרוטוקול זה, שאנחנו בדרך כלל בוחרים להסתמך על שכפול ניסיון לייצג את השונות ברמות פעילות אנזים ולא ביצוע assay משכפל. זה תמיד להתאמן הכי טוב לכלול משכפל אנליטיים, אבל בפועל, אנחנו מרגישים הפרוטוקול שלנו מספק איזון מאוזן בין משכפל אנליטיות והניסיוני שניתן משאבים מוגבלים. כמו כן, הגישה שלנו משתמשת באדמה יחסית הומוגני יותר טוב (2.75 ז) לכל assay 25, אשר טבועהntly יורד בתוך אדמת וריאציות. ההחלטה להשתמש במשכפל אנליטיים יש לשקול בזהירות על ידי בדיקה לטעויות אנליטיות במחקרים ראשוניים 48. עם זאת, אנו ממליצים שעיצובים ניסיוניים עם פחות מ 4 חזרות לטיפול קבוצתיים צריכים מאוד לשקול שימוש assay משכפל. קרקע, כרכי הצפת, ואופטימיזציה של ריכוז המצע חיץ האדמה: יחס ריכוז מצע הוא משתנה חשוב שמשפיעה במידה רבה את הקרינה שנמדדה בעת ביצוע מבחני אנזים. כמות הקרקע בתרחיף הוסיפה לassay או ריכוז המצע ייתכן שיצטרך להיות מותאם בהתאם לפעילות של אנזימים בדגימת הקרקע. 44,4 הכמויות שנבחרו לדוגמא זו התבססו על בדיקות קודמות של קרקעות אלה כדי להבטיח שזמיני מצע nonlimiting, ושאנחנו מדידת שיעורי פוטנציאל מרביים בתנאי assay (מקסימום V)5. עם זאת, עבור דגימות קרקע שיש ריכוזים גבוהים של אנזימים, כמות של אדמה או ריכוז מצע חייבת להיות מוגברת. מצאנו כי הגדלת ריכוז מצע (והתאמת העקומה סטנדרטית בהתאם) יכולה להשפיע על הליניאריות של העקומה. לכן, אנו ממליצים לצמצם כמויות קרקע ו ​​/ או התאמות פרופורציונליות לחיץ כרכים במידת צורך. בכל מקרה, זה חשוב כדי לייעל את ריכוז מצע עבור כל סוג קרקע assayed בגלל EEAS נמדד יכול להיות שונה בכל סדר הגודל גדול יותר בין ריכוזי מצע הרוויים ותת רוויים 26. לכן הבדלים בין טיפולים ניסיוניים (וכו &#39;) רגישים לסוג השני טעות סטטיסטית ופחות סיכוי להיות מזוהים בתנאים להרוות-Sub, ושגיאה סטטיסטית 27,35. כדי לייעל את ריכוזי מצע, מבחני אנזים ראשוניים צריכים להתבצע על דגימות קרקע נציג תוך שימוש במגוון רחב של ריכוזי מצע. לאחרהקלטת הקרינה, פשוט להתוות את הנתונים (בדומה לדוגמא העקומה הסטנדרטי; איור 1) כדי לזהות את ריכוז המצע (ציר x) מקביל לאנזים פעילות (ציר y) שבו הרמות מעל המדרון (~ 0). כמו כן, ריכוז המצע המתאים לנקודה שבה רמות המדרון מעל (~ 0) היא אינדיקציה טובה לריכוז המצע האופטימלי לקרקע מסוימת. assay זה סופו של דבר מודד הקרינה לאורך זמן נתון המיוצר על ידי מחצית fluorogenic שהוא ביקע מן המצע כתוצאה מdepolymerization מצע בתיווך אנזים. לכן, שלב 5 (בנוסף מצע) הוא קריטי וחייב להתבצע ביעילות רבה ככל האפשר על מנת למזער את הזמן בין מועד בו המצע מתווסף לקרקעות וכאשר מבחני מודגרת. כמו כן, ברגע שהמצע בא במגע עם המדגם, תגובות אנזימטיות יתחילו להתרחש. אנו ממליצים להשתמש רב ערוציתפיפטה מסיבה זו. הוא מומלץ בחום ללהתייעל באמצעות פיפטה רב ערוצית לפני היום אתה מבצע מבחני האנזים שלך. כדי להשיג זאת, אתה יכול להתאמן pipetting עם מים עד שאתה יכול בקלות להעביר כרכים לתוך צלחות 96 היטב עם pipettor שלך. אדמת מרווה מרווה מתייחסת לירידה בעוצמת הקרינה הנגרמת על ידי חלקיקים ו / או חומר אורגני בslurries-incubations האדמה 26. מרווה יכולה להיות מושפעת על ידי התאמת האדמה: יחסי חיץ 25. בשל הקרינה רקע מדגימות בודדות, זה הוא קריטי כדי להפעיל סטנדרטים עם דוגמאות כדי להסביר את רקע הקרינה (מרווה). למרות שחלק מפרוטוקולים להשתמש בריכוז אחד לאחר הבדיקה כי האות היא ליניארי, אנו ממליצים בחום יישום שליטה להרוות סטנדרטית עבור כל דגימה לשליטה הטובה ביותר להשפעות של מרווה. הימנעות מלעשות זאת תגרום לדוכןעקומת ארד אינו ישימה למדגם, והערכה לא נכונה של פעילות האנזימטית. התוספת של תקנים לslurries קרקע אינה רגיש לזמן, כתוספת סטנדרטית אינה משפיעה על הקרינה הרקע של המדגם. NaOH בנוסף התוספת של NaOH משמשת בפרוטוקולים מסוימים כדי לייעל מדידות פעילות אנזים fluorometric בגלל הצבע פלואורסצנטי שוחרר מהמצעים סינטטיים מפגין הקרינה שיא ב-pH&gt; 9.0 26,49. כאשר שוקל את ההצעה הזאת, ריכוז NaOH צורך pH תרחיף קרקע (כלומר ל-pH&gt; 9) ישתנה בהתאם לאדמה בפרט וחיץ pH משמש 26. עם זאת, אחרים טוענים כי NaOH לא עשוי להיות נחוץ משום שעוצמת אות היא בדרך כלל גבוהה מאוד אפילו ב-pH נמוך יותר, וכי זה מציג מקור נוסף לשגיאת מדידה. לדוגמא, ההשפעה של תוספות NaOH בpH התרחיף וfluore כך MUB או MUCscence שינויים לאורך זמן 25. מצעים MUB קשורים הוכחו להפגין הקרינה מוגברת עקבית עבור 20 דקות הבאות נוספה NaOH לפני הרמות להתחדד, בעוד MUC הוכיח יציב ירד הקרינה עד 60 דקות 26. לכן, חשוב לבצע סטנדרטיזציה של הזמן בין בנוסף NaOH ומדידת הקרינה. לחלופין, אם רמות הקרינה הן במידה מספקת לזיהוי ללא בנוסף, ביצוע מבחני ללא הוספת NaOH הוצע כחלופה מקובלת באותה מידה 26. טמפרטורה רגישות טמפרטורה צריכה להילקח בחשבון כאשר מחליטים טמפרטורת דגירה. אם העניין העיקרי הוא הבנת קינטיקה אנזים, באמצעות שלוש או יותר טמפרטורות כפי שמודגם באמצעות חלקות ארניוס (בסעיף התוצאות) היא גישה חזקה. אם האתר לדוגמה יש טמפרטורה אופיינית נמוכה כגון אדמת אדמה קפוא, אז duration של דגירה ייתכן שיהיה הצורך הוארך כדי לאפשר לאנזימים להגיב בטמפרטורות הדגירה קרות יותר. בעוד קינטיקה אנזים המסורתית מצביעה על כך שעלייה בטמפרטורה צריכה לגרום לפעילות אנזים מוגברת, מצאנו כי אנזימים יכולים להיות אתר ספציפי במונחים של רגישות טמפרטורת 50. לכן, כדי להבין את פוטנציאל פעילות האנזים ספציפי לאתר זה קריטי, כי טמפרטורת דגירה ומשך להיות מותאם כדי לשקף ערכי אתר שדה. מסקנה וווים הם נהגים קריטיים של תהליכי biogeochemical בקרקעות, ולכן אנחנו צריכים להיות מסוגלים למדוד את פעילותם. ישנם אתגרים רבים למדידת EEAS בקרקעות, כולל הפרעה ועיכוב. למרות אתגרים אלו, פרוטוקולים סטנדרטיים (כמו זה המתואר כאן) יכול להיות מיושמים באופן אוניברסלי למדידת EEAS עבור מגוון רחב של אנזימים. למרות שזה די קל להפיק נתונים איכות הבאות פרוטוקולים אלה, בפירוש מחדש של נתונים אלה בהקשר אקולוגי דורש שיקול זהיר של מה שהמבחנים הללו באמת מדידה, ואיך EEAS בתנאי assay עשוי להיות שונה מאלה תחת בתנאים באתרה.

אנזימים תאיים (וווים) המיוצרים על ידי חיידקי אדמה, פטריות, וקדום מעורבים בתהליכי biogeochemical רבים מספור, וממלא התפקיד מרכזי בעיבוד, ייצוב, ויציבות של חומר אורגני בקרקע ורכיבה על אופניים מזינים במערכות אקולוגיות יבשתית 1. על ידי הפקה וווים, חיידקים אדמה לפרק ולהפוך את חומר אורגני פולימרים למולקולות מסיסים קטנות יותר, ובכך משחררים מיקרו ואבות מזון קשורים בעבר, המאפשר לצמחים וחיידקים לקלוט חומרי מזון זמינים בקרקע. וווים נחקרו במשך עשרות שנים, בעיקר על ידי מדידת פעילותם במבחני מעבדה 2-4, מכיוון שקשה מאוד לזהות ולכמת באופן ישיר אנזימים. פעילות תאית אנזים (EEA) נשלטת באופן חזק ביותר על ידי הריכוז של אנזימים ומצעים המתאימים. השפע של שונה C-, N-, ואנזימי P-משפילים בקרקעות נשלטים על ידי גורמים רבים including יומסה של חיידקים, הרכב קהילה, זמינות מצע, מיקרו אקלים, ודרישות stoichiometric 5,6. עם זאת, בEEAS אתרו בתוך סביבת הקרקע מושפעת גם מטמפרטורה 7,8, המחייב של אנזימים לטיט אדמה ומאפייני humic 2, ואילוצי דיפוזיה 9, אשר בסופו להסדיר את בריכת האנזים הפעילה, במונחים של גודל, זמינה מצע , ושיעורי תחלופה 10-12. לכן, הכרה בתנאי קרקע באתר היא קריטית בעת שימוש במבחני אנזים המעבדה לפרש פונקציה של חיידקים אדמה על פני אתרים סביבתיים שונים. שיעורים רבים ושונים של EEA ניתן לכמת במבחני מעבדה תוך שימוש במגוון של מצעים סינטטיים (עיין &quot;רשימה של ריאגנטים טבלה&quot; לקבלת פרטים נוספים). פרוטוקולים מסוימים לנצל מצעים במבחנים שהם מצמידים לתגובת colorimetric שניתן לאתרם בספקטרופוטומטר, Wבשעה שהייתי. כולל הפרוטוקול שאנו מתארים כאן, לנצל את מצעים המאוגדים מחצית ניאון אחרים, מבחני EE הקרינה הם בדרך כלל רגישים יותר (על ידי סדר הגודל) מאשר מבחני colorimetric (אשר משתמשת במחצית chromogenic המקושרת עם מצע סינטטי) 12-14. רגישות בזיהוי EEA כוללת שני היבטים: האחד קשור לכמות של המתחם של עניין מזוהה ואחרת הקשורות לפעילות האנזים הנמוכה ביותר לגילוי הפוטנציאלית. שיטות לP-nitrophenol colorimetric ניתן למצוא מבחני מבוססי (PNP) בעבר עובד 15,16. בקיצור, אדמה (בדרך כלל הסתנן ל&lt; 2 מ&quot;מ והאוויר יבש) הוא טופח על pH טמפרטורה אופטימלי או בשדה רלוונטי. הקצב שבו מוצר התגובה שפורסם נקבע colorimetrically עם ספקטרופוטומטר 14. הרגישות גבוהה יותר של מבחני אנזים הקרינה נובעת בחלקו לזיהוי רגיש יותר של הפרדת מחצית fluorogenic קשורים substrאכלתי השפלה ולא ספיגת הקלטה לאחר הפרדת מחצית chromogenic ספציפית באורך גל מסוים. שני אינדיקטורים הניאון סינטטיים הנפוצים ביותר הם 4-methylumbelliferone (MUB) 17 ו7-אמינו-4-methylcoumarin (MUC) 18,19. מצעי MUC צמודים קשורים בדרך כלל עם מצעים סינטטיים N-עשירים כגון חלבונים ו / או חומצות אמינו. טכניקות פלורסנט פותחו לראשונה עבור דגימות מימית 20,21, והיישום שלהם לקרקעות דורש בקרות מרווית אות והפרעות 22,23. מבחני יכולים גם להתנהל באמצעות כימיה מסורתית &quot;ספסל העליון&quot; עם כמויות גדולות, או יכולים להיות מועסקים בפרוטוקולי microplate מבוססים, עם תפוקה מוגברת אבל אולי טעות מדידה גבוהה יותר. אמנם יש מספר פרוטוקולים שצוטטו בהרחבה לגילוי ניאון של EEAS בקרקעות 24, מעבדות רבות משתמשות בשינויים קלות על פרוטוקולים אלה, לעתים קרובות בטעות או עקב הבדלים בציוד מעבדה או חומרים כימיים. הבדלים קטנים לכאורה בפרטים של פרוטוקולים יכולים מאוד להשפיע נמדדו EEAS 25,26 וחוסר אנזימים סטנדרטיים עושה את זה מאתגר כדי לכייל מבחני בין מעבדות שונות. לפיכך, יש צורך חשוב להפצת פרוטוקולים מפורטים לעידוד סטנדרטיזציה של מבחני EEA. בפרוטוקול שלנו, דגימות קרקע מוכנות על ידי שילוב של דגימות קרקע עם חיץ pH ומאחד עם בלנדר. אז slurries מחוסן עם כמות nonlimiting של כותרתו fluorescently C-, N-, או מצע P-עשיר, שנבחר בהתאם לשאלת המחקר הספציפית של עניין. שימוש slurries אדמה במבחני האנזים משמש כביקורת כדי למזער מגבלות דיפוזיה מצע. Moieties הניאון הם הרווה עד שהם הבקיעו מהמצעים שלהם, ואת פעילות ובכך אנזים יכולה להתגלות כצבע פלואורסצנטי משתחרר מהמצע בy-תגובה זרז אנזים. עוצמת הקרינה הגוברת בזמן משקפת את שיעור התגובה-זרז אנזים. הרעיון הכללי של assay אנזים הקרינה הוא שהמצעים סינטטיים כרוכים במחצית fluorogenic (צבע פלואורסצנטי), מתווספים לדגימות קרקע 27. במהלך השפלה מצע-זרז אנזים, את הקשר בין שובר את צבע הניאון ואת המצע. צבע פלואורסצנטי שוחרר מהמצע משמש ככתוצאה מכך הערכה עקיפה של פעילות אנזים, וניתן לכמת באמצעות קורא microplate כדי לזהות את עוצמת הקרינה של הצבע. בקיצור, כימות הקרינה מושגת כצבע המשוחרר פולט אור באורך גל אחד לאחר קליטת אור עם אורך גל שונה. עוצמת הקרינה שתועדה על ידי קורא צלחת מסוגל גם עירור וגילוי. פעילות אנזים ניתן לכמת בהמשך מבוסס על conce ניאון הצבע הידועntrations של המצע (כלומר כמויות ידועות של מצע סינטטי הוסיפו לדגימות קרקע), יחד עם התייחסות עקומה דילול סטנדרטי של עוצמות הקרינה למחצית fluorogenic הספציפית של המצע בשימוש assay (כלומר 4-methylumbelliferone (MUB) או 7-אמינו -4-methylcoumarin (MUC)). (נא עיין בסעיף הפרוטוקול לפרטים ספציפיים על כימות פעילות אנזים). מבחני אנזים אדמת מעבדה הם שימושיים להערכת תפקוד קהילת חיידקים, אבל יש כמה מגבלות טכניות שצריכים להכיר משתמשים 10. מבחני הקרינה יכולים לסבול מהפרעות שנגרמו על ידי זיהומים ו / או חוסר יציבות של תרכובות רבות ניאון כאשר הם נחשפים לאור, ולכן נדרשת זהירות בעת הטיפול במצעי ניאון 25. חלקיקי קרקע ו / או חומר אורגני באדמת slurries יכולים גם להפריע לעוצמות הקרינה, המכונים אפקט מרווה 26.יתר על כן, מבחני אנזים המעבדה מעריכים רק EEAS הפוטנציאלי בתנאי מעבדה. במבחני חוץ גופית למדוד EEAS בתנאים בהם פיזור מצע ושפע הוא nonlimiting. לכן, הנתונים שסופקו על ידי מבחני אלה לא יכולים להיות טוב לפרוקסי EEAS תחת בתנאי קרקע באתר 10. בסך הכל, פעילות אנזים היא מאוד שימושית עבור השוואות יחסי שבסוגי הקרקע דומים. עם זאת, בעת השימוש בשיטה זו כדי להשוות את פעילות בין קרקעות שונות בתכונות פיזיות או כימיות, יש להשתמש בזהירות. זאת בשל העובדה שהבדלים בסוג קרקע וטמפרטורה באופן דרסטי יכולים לשנות את המצב בקינטיקה אנזים באתרה. מגבלה נוספת היא שמספר קטן יחסית של מצעים זמינים מסחרי (בהשוואה לסביבה הטבעית). יתר על כן, מצעים סינטטיים המשמשים למבחני אנזים הם פשוטים יחסית (בקלות מסיסה) עלול שלא לייצג במדויק מצעי האדמה בהווה או בavailablדואר באתרם. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא כי באמצעות slurries אדמה יהיה לשלב את הפעילות של כמה אנזימים התייצבו (כלומר משותקים על ידי חומר או חרסית אורגני) שלא יכול להיות פעילה באתרו בתנאים 2. מבחני אנזים מעבדה גם לא מספקים מידע בנוגע להתמדה של אנזימים בקרקע (שיעורי תחלופת אנזים) או מידע לגבי המינים של חיידקים מסוימים שמייצרים אנזימי אדמה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#945;-D-glucopyranoside (AG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9766</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-glucopyranoside (BG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3633</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside (CB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6018</td>
			<td>Cellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2145</td>
			<td>Protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide (NAG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2133</td>
			<td>Chitin degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8883</td>
			<td>Phosphorus mineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl-&#946;-D-xylopyranoside (XYL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7008</td>
			<td>Hemicellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>acidic and neutral soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris base buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td>basic soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-65</td>
			<td>pipetting reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-684-265</td>
			<td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 101-1,250 &#956;l extended length natural tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1112 - 1720</td>
			<td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td>Lab disc magnetic stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring blender</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-509-7P</td>
			<td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-688-231</td>
			<td>Dispenser; range: 5-50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Unispense &#956;P peristaltic pumps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683-7</td>
			<td>Optional dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1451363SIX</td>
			<td>Used to stirr soil slurry afer blending</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass bowls</td>
			<td>World Kitchen</td>
			<td>5304218</td>
			<td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well black solid plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-590</td>
			<td>Used for plate reader step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well assay blocks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-700</td>
			<td>V-bottom; 2 ml; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-387-93</td>
			<td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3121</td>
			<td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016058</td>
			<td>Plate reader (this model is no longer available)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

חיידקים בקרקעות וסביבות אחרות לייצר אנזימים תאיים לdepolymerize וhydrolyze מקרומולקולות האורגנית, כך שהם יכולים להיטמע לאנרגיה וחומרים מזינים. מדידת פעילות אנזים חיידקי אדמה היא קריטית בהבנת דינמיקה תפקודית מערכת אקולוגית בקרקע. הרעיון הכללי של assay אנזים הקרינה הוא שC-, הסינתטי N-, או מצעי P עשיר בכבול עם פלורסנט לצבוע מתווספים דגימות קרקע. כאשר שלם, מצעי שכותרתו לא לזרוח. פעילות אנזים נמדדה כגידול בקרינה כצבעי ניאון הם ביקע מהמצעים שלהם, המאפשר להם לזרוח. ניתן לבטא מדידות אנזים ביחידות של molarity או פעילות. כדי לבצע assay זה, slurries קרקע מוכן על ידי שילוב של אדמה עם חיץ pH. חיץ pH (בדרך כלל אצטט 50 מ&quot;מ נתרן או 50 חיץ מ&quot;מ טריס), נבחר לקבוע של החיץ מסוים חומצת דיסוציאציה (pKa) כדי להתאים את sa האדמה הטוב ביותרpH mple. Slurries האדמה מחוסן עם כמות nonlimiting של כותרתו מצע (כלומר C-, N-, או P-עשיר) fluorescently. שימוש slurries האדמה בassay משמש כדי למזער את המגבלות על אנזים ודיפוזיה מצע. לכן, בקרות assay זה להבדלים בהגבלת מצע, שיעורי דיפוזיה, ותנאי pH קרקע, ולכן איתור שיעורי פעילות אנזים פוטנציאל כפונקציה של ההבדל בריכוזי אנזים (לדוגמה). מבחני אנזים הקרינה הם בדרך כלל רגישים יותר ממבחני spectrophotometric (כלומר colorimetric), אבל יכולים לסבול מהפרעות שנגרמו על ידי זיהומים וחוסר היציבות של תרכובות רבות ניאון כאשר הם נחשפים לאור, לכן נדרשת זהירות בעת הטיפול במצעי ניאון. כמו כן, בשיטה זו מעריכה רק את פעילות אנזים פוטנציאלית בתנאי מעבדה, כאשר מצעים לא מגבילים. יש להשתמש בזהירות בעת פירוש הנתונים המייצגים את הצלבאתר השוואות עם טמפרטורות שונות או סוגי קרקע, כמו בסוג קרקע באתר וטמפרטורה יכולות להשפיע על קינטיקה אנזים.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities at JoVE.com

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

כדי למדוד את שיעורי פוטנציאל של פעילות אנזים תאית קרקע, מצעים סינטטיים המאוגדים צבע פלואורסצנטי מתווספים דגימות קרקע. פעילות אנזים נמדדה כצבע פלואורסצנטי משתחרר מהמצע על ידי תגובה-זרז אנזים, שבו הקרינה גבוהה יותר מצביעה יותר השפלה מצע.

תפוקה גבוהה fluorometric מדידה של קרקע פוטנציאלית פעילויות אנזים תאיות

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

high-throughput-fluorometric-measurement-potential-soil-extracellular

Research

JoVE Journal

Environment

46.0K Views.  Colorado State University.  כדי למדוד את שיעורי פוטנציאל של פעילות אנזים תאית קרקע, מצעים סינטטיים המאוגדים צבע פלואורסצנטי מתווספים דגימות קרקע. פעילות אנזים נמדדה כצבע פלואורסצנטי משתחרר מהמצע על ידי תגובה-זרז אנזים, שבו הקרינה גבוהה יותר מצביעה יותר השפלה מצע. 

Video: High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

עיצוב והפעלה של רציף<sup&gt; 13</sup&gt; C ו<sup&gt; 15</sup&gt; N תיוג הלשכה לאחיד או דיפרנציאלי, מטבולית ומבנית, צמח איזוטופ תיוג

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

מדידה של שטף גזי חממה מקרקעות חקלאיות באמצעות לשכות סטטי

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

הקרנת תפוקה למחצה גבוהה לבצורת סובלנות פוטנציאלית בחסה (<em&gt; Sativa Lactuca</em&gt; אוספים germplasm)

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

לוח א gusseted Thermogradient לשלוט טמפרטורות קרקע להערכת גדילת צמחי ניטור תהליכי אדמה

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Use of Principal Components for Scaling Up Topographic Models to Map Soil Redistribution and Soil Organic Carbon

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it regulates the gravity-driven soil movement induced by runoff and tillage activities. The recent application of Light Detection and Ranging (LiDAR) data holds promise for generating high spatial resolution topographic metrics that can be used to investigate soil property variability. In this study, fifteen topographic metrics derived from LiDAR data were used to investigate topographic impacts on redistribution of soil and spatial distribution of soil organic carbon (SOC). Specifically, we explored the use of topographic principal components (TPCs) for characterizing topography metrics and stepwise principal component regression (SPCR) to develop topography-based soil erosion and SOC models at site and watershed scales. Performance of SPCR models was evaluated against stepwise ordinary least square regression (SOLSR) models. Results showed that SPCR models outperformed SOLSR models in predicting soil redistribution rates and SOC density at different spatial scales. Use of TPCs removes potential collinearity between individual input variables, and dimensionality reduction by principal component analysis (PCA) diminishes the risk of overfitting the prediction models. This study proposes a new approach for modeling soil redistribution across various spatial scales. For one application, access to private lands is often limited, and the need to extrapolate findings from representative study sites to larger settings that include private lands can be important.

Landscape processes are critical components of soil formation and play important roles in determining soil properties and spatial structure in landscapes. We propose a new approach using stepwise principal component regression to predict soil redistribution and soil organic carbon across various spatial scales.

השימוש של הרכיבים העיקריים עבור קנה מידה את סימון שבילים מודלים למיפוי פחמן אורגני הפצה אדמה וקרקע

Landscape topography is a critical factor affecting soil formation and plays an important role in determining soil properties on the earth surface, as it ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a significant role in plant growth and development by providing strength, rigidity, rate and direction of cell growth, cell shape maintenance, and protection from biotic and abiotic stressors. The cell wall is primarily composed of cellulose, lignin, hemicellulose and pectin. Recently plant cell walls have been targeted for the second-generation biofuel and bioenergy production. Specifically, the cellulose component of the plant cell wall is used for the production of cellulosic ethanol. Estimation of cellulose content of biomass is critical for fundamental and applied cell wall research. The Updegraff method is simple, robust, and the most widely used method for the estimation of crystalline cellulose content of plant biomass. The alcohol insoluble crude cell wall fraction upon treatment with Updegraff reagent eliminates the hemicellulose and lignin fractions. Later, the Updegraff reagent resistant cellulose fraction is subjected to sulfuric acid treatment to hydrolyze the cellulose homopolymer into monomeric glucose units. A regression line is developed using various concentrations of glucose and used to estimate the amount of the glucose released upon cellulose hydrolysis in the experimental samples. Finally, the cellulose content is estimated based on the amount of glucose monomers by colorimetric anthrone assay.

The Updegraff method is the most widely used method for the cellulose estimation. The main purpose of this demonstration is to provide a detailed Updegraff protocol for estimation of cellulose content in plant biomass samples.

הערכת תכולת תאית גבישית של ביומסה צמחית בשיטת Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...