Bu yayın ABD Ulusal Bilim Vakfı (DEB # 1021559) tarafından desteklenen Çevre Araştırma Koordinasyon Ağı Araştırma Enzimler tarafından finanse edildi. Bu araştırma ABD Ulusal Bilim Vakfı (DEB # 1021559) ve Bilim Enerji Dairesi (Biyolojik ve Çevresel Araştırma) ABD tarafından desteklenmiştir. Bu malzemenin ifade herhangi bir görüş, bulgular ve sonuçlar ve öneriler yazarların aittir ve ABD NSF görüşlerini yansıtmaz.

1.. Tahlil Set-up <ol><li> Etiket 3 derin kuyu plakaları: &quot;Örnek&quot;, &quot;MUB standart&quot; ve &quot;MUC standart&quot;. </li><li> Her bir standardı (0, 2.5, 5, 10, 25, 50, ve 100 mcM MUB) ve alt tabaka ayrı ayrı temiz, prelabeled rezervuarların içine (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) (satırlar) odaklı dökün . </li><li> MUB standart plaka (Tablo 1) karşılık gelen kuyu içine uygun MUB standart Pipet. <ol><li> MUB standart plaka sıra A içine 0 iM Mub Pipet 200 ul. </li><li> Pipet 200 MUB standart plaka sıra B içine 2.5 mcM Mub ul. </li><li> MUB standart plaka sıra C içine 5 mcM Mub Pipet 200 ul. </li><li> MUB standart plaka sıra D içine 10 mcM Mub Pipet 200 ul. </li><li> MUB standart plaka sıra E içine 25 mcM Mub Pipet 200 ul. </li><li> MUB standart plaka sıra F içine 50 iM Mub Pipet 200 ul. </li><li> 100 μ Pipet 200 ulMUB standart plaka sıra G içine M MUB. </li><li> MUC standart plaka ilgili kuyulara MUC standartları 1.3.8 - tekrarlayın 1.3.1 adımları. </li></ol></li><li> Her toprak örneği için hazırlık toprak çamurlar. <ol><li> Blender içine alan nemli toprakta 2.75 g tartılır. </li><li> 50 mM tampon 91 ml ilave edilir. 1 dakika boyunca yüksek üzerinde karıştırın. </li><li> En azından geniş bir karıştırma çubuğu ile 8-kanal pipet gibi temiz bir cam kasenin içine blender içeriğini dökün. </li><li> Düşük toprak çamurunu karıştırmak, heyecan plaka üzerine yerleştirin. </li><li> Pipet Örnek plakasının (Tablo 2) birinci sütuna toprak çamurunun 800 ul. </li><li> MUB standart ve MUC standart levhalar (Tablo 1) 1 st sütuna tekrar edin. </li><li> DI H 2 O ile blender, heyecan plaka ve karıştırma çubuğu durulayın veya toprak örneklerinin arasında tampon. </li><li> Sonraki her toprak örneği (Tablo 1 ile sonraki sütuna hareket, her bir örnek için) 1.4.7 ve - Tekrar 1.4.1 adımları2). </li></ol></li><li> Örnek plaka (Tablo 2) karşılık gelen oyuklarına (bu örnekte, 200 uM konsantrasyonu), uygun alt-tabakanın Pipet. <ol><li> Numune plaka sıra A içine BG substrat Pipet 200 ul. </li><li> Pipet Numune plaka sıra B içine CB substratın 200 ul. </li><li> Numune plaka satır C içine NAG substratı Pipet 200 ul. </li><li> Pipet Numune plaka sıra D içine PHOS substratın 200 ul. </li><li> Pipet Numune plaka satır E içine XYL substratın 200 ul. </li><li> Numune plaka satır F içine AG substrat Pipet 200 ul. </li><li> Numune plaka satır G içine LAP substrat Pipet 200 ul. </li><li> Her inkübasyon sıcaklığı numune plaka için 1.5.7 - tekrarlayın 1.5.1 adımları. </li></ol></li></ol> 2. Deney plakası inkübasyonu <ol><li> Derin kuyu plakaları (&quot;örnek&quot;, &quot;MUB standart&quot; ve &quot;MUC standart Seal4 ;) plaka paspaslar. </li><li> Çözelti iyice karıştırılır kadar elle her (mühürlü) plaka invert (~ 10x). </li><li> Gerekli inkübasyon süre (Tablo 3) uygun inkübatör tabak yerleştirin. </li><li> Zaman 0 olarak ilk defa kaydedin. Eğer inkübatör (Tablo 3) gelen plaka kaldırmak için ne zaman biliyor bu yüzden de uygun inkübasyon sürelerini kaydetmek. </li><li> Her bir kuluçka süresi, santrifüj ~ 2900 x g&#39;de 3 dakika boyunca sızdırmaz plakalar sonunda. </li><li> Sertifika sonra, (bir siyah plaka, her kuluçkalanmıştır derin kuyu plaka için kullanılacaktır), siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar içinde karşılık gelen kuyu içine kuluçkaya derin sağlam plakanın her çukuruna 250 ul aktarın. Bu, siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalarda aynı kuyu (örneğin, A1, ... A12, vb) içine kuluçkaya derin kuyulu plakalarda numune aktarmak için önemli olan (Tablo 1, 2). </li></ol> 3. Floresan ölçümleri onMikrotabak Fluorometer <ol><li> Kullanılan fluorometrik plaka okuyucusu için üreticinin talimatlarına, 450 nm&#39;ye 365 nm ve emisyon dalga boyu eksitasyon dalga boyu: (veya uygun filtreler kullanın) sonra. </li><li> Florometre üzerinde üç tabak okuyun. Önemli: numuneler ve standart levhalar (yani MUB veya MUC) aynı kazancı kullanılarak okunması gerekir. <ol><li> Otomatik kazanç spektrofotometre ayarlayın ve MUC ve MUB Standart plakaları okuyun. </li><li> Set kılavuzuna kazanç ve optimum dan sonraki en düşük sayıya değeri azaltmak, her standart plaka için, en yakın beş yuvarlanır. Her bir plaka için 2x tekrarlayın. </li><li> Otomatiğe kazanç ayarlayın ve örnek plakayı. Standart plakaları (örneğin MUB ve MUC) her biri için en yüksek kazanç maç için elle örnek plaka yeniden çalıştırın. </li></ol></li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> MUB için tablo içine standart eğri floresan verilerini girin (Tablo 4a) Ve MUC standart (Tablo 4b) <ol><li> (Umol) &#39;den (uM) konsantrasyonları dönüştürme (Tablo 4a ve 4b). </li></ol></li><li> Her numunenin standart eğri floresan veri, eğim, y-kesişim, ve R Mub ve MUC (ľmol) standart konsantrasyonları 2 değerlerini hesaplamak. Uygun R2 değerleri her bir numune için 0.98 aşmalıdır (Tablo 4a ve 4b). Floresan bağımlı değişken (y-ekseni) ve standart bir konsantrasyonu (umol) bağımsız değişken (x-ekseni) (Şekil 1) olarak grafiğe olarak çizilmiştir okumaları ile, bir dağılım arsa standart eğrileri görselleştirmek için yararlı olabilir. </li><li> Bu potansiyel EEAS içine numune + madde ham floresan verileri hesaplamak için MUB ve MUC standart eğrisi eğimi ve y kesişim noktası değerlerini kullanacaktır. Önce yeni bir elektronik tabloya örnek + tabaka ham floresan verileri girin (Tablo 5a gerekir </strong&gt;). Sen de her bir numune için inkübasyon süresi (saat) ve toprak kuru ağırlığı (Tablo 5b) girmeniz gerekir. Numuneler 25 ° C (Tablo 3) ile inkübe edildi çünkü bu örnekte girilen zaman değerleri, 3 saattir, dikkat edin. <ol><li> Karşılık gelen örnek floresans değerlerinden standart eğri kesişim noktası değerlerini çıkarma ve daha sonra karşılık gelen standart eğri (Tablo 5 C) eğimi ile bölün. [Y = numune floresan ham okuma; MUB veya MUC standart bir eğriden b = kesmek, m = MUB ikinci eğim: x = (Yb) / m; Bunu gerçekleştirmek için, örnek enzim konsantrasyonu (x) için çözmek için standart bir çizgi denklemi yeniden düzenlemek veya MUC Standart eğri]. </li><li> 91 ml (toprak harç madde içinde kullanılan tampon hacim) (Tablo 5d) ile, yukarıda adım 4.3.1 dan, örnek umol çarpın. </li><li> [Enzim AMT: bölmek değeri örnek özgü inkübasyon süresi ve kuru toprak kütlesi (Tablo 5e) adım 4.3.2 elde. (&amp; #956; mol) ml x 1.000 x 0,8 91 ml x inkübasyon (saat) kuru toprağı (g) x x] Not: 0.8 ml de her birinde kullanılan harç maddenin hacmi, 1000 ve de her bir gerçek toprak miktarı için düzeltir. </li><li> İstenilen birimleri (nmol aktivite / g kuru toprak / saat) (Tablo 5f) almak için 1000 adım 4.3.3 elde değerini çarpın. </li></ol></li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Potansiyel toprak EEAS laboratuvar tabanlı ölçüm ekosistem işleyişi için önemli abiyotik çevreye mikrobiyal yanıtları içine anlayışlar ve bunların sonuçlarını sağlayabilir. Bu örnekte, veri kümesinin sonuçları minimal bir fark iklim tedavi araziler arasında kir enzim aktivitesi veya kinetik var olduğunu göstermektedir. Ancak, araziler arasında ters eğilimler, toprak nemi, toprak pH veya bitki büyümesi gibi mikrobiyal EEAS üretimini etkileyebilecek değişkenlerin daha fazla araştırma teşvik ediyoruz. Genel olarak, topraklarda (1) genel EEA, (2) EEA stoikiometride (3) Arrhenius araziler / aktivasyon enerjisi, ve (4) Q 10 ekosistem düzeyinde süreçlerin göstergesi olabilir yaklaşımların geniş bir spektrum sağlar açısından EEAS değerlendirilmesi sağlam toprak ekosistem fonksiyonel dinamiğini karakterize etmek için hangi. Yüksek verim flüoresan bazlı deneyler, EEA yaygın topraklarda potansiyel EEAS incelemek için kullanılan ve yararlı bir araçtırdiğer ortamlar. Önemlisi, potansiyel aktiviteler enzim havuzu boyutunu yansıtmaktadır, ancak kendileri tarafından enzim üretimi veya ciro oranlarını 46 ölçmek değil. Tekniği oldukça basit olsa da, laboratuvar protokolleri arasında görünüşte küçük farklılıklar sonuçlarının 13 karşılaştırılabilir engelleyebilir. Ne yazık ki, şu anda EEAS için uygun standart pozitif kontrolleri yok. Stokiyometrik oranların kullanımı bu zorlukların üstesinden gelmek için, bir yaklaşımdır. Aksi takdirde, yüksek verimli teknikleri gelişiyle ortamında 4 enzimlerin çalışma ilerlemiştir. Bu tahliller tarafından üretilen verinin dikkatli yorumlanması mikrobiyal aktiviteye önemli eğilimleri izah edebilir. Protokolün sağlamlığı bireysel örnekler özel koşullar seçmek için ileri gelmektedir, ancak bu da bir sınırlama neden olabilir. Modifikasyonları bir dizi örnekleri doğru olarak ölçülür sağlamak için gerekli olacaktır<html> Ayrı alan siteler: Tampon Seçtiğiniz tampon toprağın pH değerine bağlı olacaktır. Tamponlama da 27,47 yüksek pH bağımlı olan floresan standartların floresan yoğunluğu, stabilize eder. Örnek pH seviyeleri - Normal olarak, topraklı çamurun yapmak için kullanılan tampon, pH en iyi eşleşme toprağa tamponunun, özellikle asit ayrışma sabiti (pKa) için seçilmiş olan bir 50 mM sodyum asetat, Tris tamponudur. Sodyum asetat 4,76 arasında bir pKa&#39;ya sahiptir ve Tris 8,06 bir pKa değerine sahiptir, bu nedenle, bu iki tampon miktarları, ayrı ayrı örnek için istenen pKa değerine ulaşmak için değişecektir. Fosfat tamponu (pKa = 7.2) nötr / hafif bazik topraklar için önerilmiştir. Ancak, yüksek fosfat konsantrasyonları enzim aktivitesi ile müdahale olabilir, bu tampon kullanmadan önce ön çalışmalarda analitik değişkenlik test etmek için dikkatli olun. Floresan yüzeylerde Taşıma ve depolama jove_content &quot;&gt; Flüoresan tahliller ışığa maruz kaldığında kirlilikler ve / veya birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir, bu nedenle floresan tabakaları kullanırken dikkatli olunmalıdır. Önemle floresan substratları ve Mub ve MUC standartlarını etiketli için herhangi bir ışık maruziyeti en aza indirilmesi tavsiye . amber cam şişe kullanılması veya floresan substratları ve standartları yapmak ve saklamak için kullanılan cam ve kapları kapsayan önerilen; cam ve kapları sarmak için alüminyum folyo iyi çalışıyor Aynı şekilde, verimli bir tabak aşılanması ve karanlık inkübatörlere aktarılması en iyi uygulamadır. öneririz. (-20 ° C) için artık iki aydan (ışık onları korurken) substratları ve standartları depolanması ve çözülme yüzeyler (5 ° C) ~ öncesinde enzim tahlili (ler) başlamadan 24-48 saat. Tasarım ve Çoğaltma Iyi iyi örnek varyasyonları, negativ uygulanması için en iyi hesape tahlil kontrolleri ve tahlil çoğaltır (eğer mümkünse) önerilir. Varyasyon tipik olarak her bir oyuğa toprak parçacıklarının miktarı farklılıklar ve pipetleme hataları oluşur. Bu nedenle, güçlü karıştırma ve iyi pipetleme tekniği ölçüde iyi varyasyon iyi en aza indirecektir. Ayrıca, biz şiddetle zamanla yüzey tutarsızlıkları izlemek için negatif bir tahlil denetimi (tampon + substrat çözeltisi) uygulanması öneririz. (Normal olarak, 96-yuvalı plakalar üzerinde son sütunu kullanımı) negatif kontrol kuyuları karşılaştırarak enzim plakaları okurken bu kolayca izlenebilir. Negatif kontroller substrat bu nedenle de saptama sınırının üzerinde sinyal artar, bu alt-tabaka ve / veya standart çözeltilerin değiştirilmesini gerektiren kirlenme ya da alt-tabaka istikrarsızlık göstergesidir, tipik olarak stabildir. Diğer protokolleri bir tür gerçekleştirin rağmen verimi maksimize etmek için, bizim protokol, tek bir derin kuyu mikrotablada birkaç potansiyel EEAS içerirFarklı EEAS beri plaka (plaka başına yani bir alt tabaka) başına deney farklı hızlarda meydana gelir. Ne olursa olsun, enzim optimizasyonu yaklaşım ya da tek plaka yaklaşımı boyunca yüksek bu gerçekleştirmeden önce topraklar üzerinde yapılmalıdır. Reaksiyon hızları İnkübasyonun süre içinde, her bir enzim için nispeten tutarlı, birden çok alt-tabakalar, tek bir plaka üzerinde kullanılabilir. ~ 1 gram diğer protokoller 24 tavsiye edilirken Bizim protokol, ~ bulamaç, çözelti elde etmek için 2.75 g toprak önerir. Biz daha fazla toprak (eğer mümkünse) kullanarak içinde-örnek enzim aktivite düzeyleri toprak değişimi iyi yakalamak için etkili bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Diğerleri sadece alt-tabakalar, 50 ul toprak çamurunun 200 ul inkübe edilir ise, bu protokolde, 200 ul substrat ile toprak çamurunun 800 ul inkübe edin. Bu sadece en sonunda ölçülen aktivitesi değişmez ölçekleme bir fonksiyonudur. Pratik avantajları da vardırDaha büyük hacimli kullanmak için. Bir, florometre üzerinde yoğunluklarına kayıt işleminden önce siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar karşılık gelen pipetleme ise toprak partikülleri önlemek için daha kolaydır. Enzim ile ilgili floresan şiddetleri kayıttan önce florometre için siyah düz tabanlı 96 oyuklu plakalar aktarımı İkinci olarak, ek bir hacim kazara dökülmesi durumunda yararlıdır. Hacim bile küçük sapmalar önemli ölçüde kuyuların arasında floresan azalacaktır. Son olarak, bu nedeniyle protokolün yüksek kapasiteli yapısı nedeniyle, genellikle oldukça tahlil çoğaltır gerçekleştirerek daha enzim aktivite düzeyleri değişimi temsil etmek deneysel çoğaltma güvenmek seçerler. Her zaman analitik çoğaltır dahil etmek iyi bir uygulamadır, ama pratikte, bizim protokol sınırlı kaynaklar göz önüne alındığında, analitik ve deneysel suretin arasında dengeli bir dengeyi sağlar hissediyorum. Aynı şekilde, bizim yaklaşımımız doğasında olan, tahlil başına 25 görece daha iyi homojenize toprak (2.75 g) kullanırntly içi toprak varyasyonları azalır. Analitik çoğaltır kullanmak için karar dikkatle ön çalışmalarda 48 analitik hata için test tarafından kabul edilmelidir. Ancak, biz az 4 tedavi grubu çoğaltır deneysel tasarımlar güçlü deneyi çoğaltır kullanarak düşünmelisiniz öneririz. Toprak, Tampon Ciltler ve Substrat konsantrasyonu optimizasyonu Toprak tamponu: alt tabaka konsantrasyonu oranı, enzim tahlilleri gerçekleştirirken güçlü ölçülen floresan etkileyen önemli bir değişkendir. Bulamacın toprak miktarı tahlil ya da alt-tabaka konsantrasyonunun, bir toprak numunesi için enzim aktivitesine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir ilave edildi. Bu örnek için seçilen miktarları için alt-tabaka elverişliliğini deney koşulları (V max) altındaki maksimum potansiyel oranlarının ölçümü olduğu sınırlandırıcı olmayan, ve daha emin olmak için bu toprakların önceki test dayanmaktadır 44,45. Bununla birlikte, enzimlerin yüksek konsantrasyonlarda toprak örnekleri için, toprak ya da alt-tabaka konsantrasyonunun miktarı artırılmalıdır. Bu alt-tabaka, artan konsantrasyonlarda (ve buna uygun olarak standart eğri ayarlama) eğrinin lineer etkileyebilir bulduk. Bu nedenle, gerekli hacimleri tampon toprak miktarları ve / veya oransal ayarlamaları azaltılması önerilir. Ne olursa olsun, ölçülen EEAS doymuş ve alt doymuş substrat konsantrasyonları 26 arasında daha fazla bir büyüklük sırasına göre değişiklik olabilir, çünkü tahlil her toprak türü için substrat konsantrasyonu optimize etmek için önemlidir. Bu nedenle deneysel tedaviler (vb) arasındaki farklar tip II istatistiksel hata ve alt-doyurarak koşullarda tespit edilecek daha az olasıdır ve istatistiksel hata 27,35 duyarlıdır. Alt tabaka konsantrasyonları uygun hale getirmek için, ön enzim tahlilleri alt-tabaka konsantrasyonları geniş bir yelpazede kullanarak temsili toprak numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir gerekir. Sonrafloresan kayıt, sadece (benzer şekilde, standart eğri örnek, Şekil 1) veri arsa aktivitesi (y-ekseni) enzim karşılık gelen alt-tabaka konsantrasyonu (x-ekseni) tanımlamak için burada eğim seviyesi kapalı (0 ~). Aynı şekilde, eğim seviyesi kapalı (~ 0) o toprak için uygun alt-tabaka konsantrasyonunun bir göstergesi olduğunu noktasına karşılık gelen alt-tabaka konsantrasyonu. Bu deney, sonuçta enzim aracılı substrat depolimerizasyon bir sonucu olarak alt-tabaka yarılır flüorojenik kısmı tarafından üretilen belirli bir zaman içinde floresan ölçer. Bu nedenle, aşama 5 (alt-tabaka ekleme) kritiktir ve alt tabaka kirlerin eklendiğinde ve deneyler enkübe edildiği zaman arasındaki süreyi en aza indirmek için mümkün olduğu kadar etkin gerçekleştirilmelidir. Alt-tabaka, numune ile temas bir kez benzer şekilde, enzimatik reaksiyonlar meydana başlayacaktır. Biz bir çok kanalı kullanarak tavsiyeBu nedenle pipetle. Kuvvetle önce gün size enzim tahlilleri performans çok kanallı pipet kullanarak verimli olmak için önerilmektedir. Kolayca pipet ile 96-kuyu tabak içine birimleri aktarmak kadar bu başarmak için, su ile pipetlenmesini pratik yapabilirsiniz. Toprak Islah Su ile soğutma, toprak bulamaçlar-inkubasyon 26 parçacık ve / veya organik madde tarafından neden olunan floresan yoğunluğunun azaltılması anlamına gelir. Tampon oranları 25: söndürme toprak ayarlayarak etkilenmiş olabilir. Nedeniyle tek örneklerinden eşiğe için, bu arka plan (söndürme) floresan için hesap numuneleri ile standartları çalıştırmak için çok önemlidir. Bazı protokoller, sinyal doğrusal olduğu test edildikten sonra, tek bir konsantrasyonda kullanımı olsa da, şiddetle su verme etkilerinden en iyi kontrolü için her bir örnek için standart soğutma kontrol uygulanması önerilir. Aksi takdirde bir stand neden olacaktırörnek için geçerli değildir ard eğrisi ve enzimatik aktivite, yanlış bir kestirimi. Standart ekleme numunenin floresan arka plan etkilemez gibi kir bulamaçlara standartların eklenmesi, zamana duyarlı değildir. NaOH ilavesi NaOH ilavesi, sentetik alt tabakalardan salınan fluoresan boya&gt; pH 9.0 26,49 floresan tepe sergileyen için florimetrik enzim etkinlik ölçümleri optimize etmek için bir protokol kullanılır. Bu öneri göz önüne alındığında, toprak çamuru pH değerinde (örneğin pH&gt; 9) için gerekli olan NaOH konsantrasyonu belirli toprağa bağlı olarak değişir ve pH, tampon 26 kullanılır. Ancak, diğerleri sinyal yoğunluğu daha düşük pH değeri genellikle çok yüksektir, çünkü bu ölçüm hatası ek bir kaynak sunuyor çünkü NaOH gerekli olmayabilir savunuyorlar. Örneğin, çamur pH ve böylece MUB veya MUC fluore üzerinde NaOH ilavelerin etkisizaman üzerinde 25 scence değişir. Kadar 60 dakika boyunca 26 floresan azalma MUC sabit göstermiştir etmektedir; MUB bağlanmış alt-tabakalar seviyeleri koniklik önce NaOH ekleme takip eden 20 dakika boyunca sürekli artan flüoresans göstermek için gösterilmiştir. Bu nedenle, NaOH ilavesi ve floresan ölçümü arasındaki süre, standardize etmek önemlidir. Floresan seviyeleri NaOH eklemeden tahliller yapmak, eklenmeden yeterince tespit edilebilir, alternatif olarak, aynı şekilde kabul edilebilir bir alternatif olarak 26 önerilmiştir. Sıcaklık Inkübasyon sıcaklığı karar verirken sıcaklık duyarlılığı göz önüne alınmalıdır. Birincil ilgi gösterildiği gibi (sonuç bölümünde) Arrhenius araziler kullanarak üç veya daha fazla sıcaklıklar kullanılarak, enzim kinetiği anlayış ise sağlam bir yaklaşımdır. Örnek site gibi sonra buzlanma toprak, duratio karakteristik olarak düşük sıcaklık varsainkübasyon n soğuk inkübasyon sıcaklıklarda tepkimeye enzimler için izin vermek için uzatılabilir gerekebilir. Geleneksel enzim kinetiği sıcaklığındaki bir artış, enzim aktivitesi ile sonuçlanmalıdır göstermektedir birlikte, enzimler, sıcaklık 50 duyarlılık açısından belirli bir site olabileceğini bulduk. Bu nedenle alana özgü enzim aktivitesi potansiyelini anlamak için bu inkübasyon sıcaklığı ve süresi alan yeri değerlerini yansıtacak şekilde ayarlanması önemlidir. Sonuç EES topraklarda biyokimyasal süreçlerin kritik sürücüleri, ve böylece biz onların faaliyetlerini ölçmek gerekiyor. Girişim ve engellenmesi dahil topraklarda EEAS, ölçüm için pek çok zorlukları vardır. Bu zorluklara rağmen, (burada tarif edilen gibi) standart protokolleri evrensel enzimleri geniş bir yelpazede EEAS ölçülmesi için tatbik edilebilir. O, bu protokoller aşağıdaki kalite verilerini oluşturmak oldukça kolay olsaekolojik bağlamda bu rakamların tef si bu tahlilleri gerçekten ölçüm şeyin dikkatli bir değerlendirme gerektirir ve nasıl tahlil koşulları altında EEAS yerinde koşulları altında farklı olabilir.

Toprak bakteri, mantar, ve arkelerin tarafından üretilen hücre dışı enzimler (EES) sayısız biyokimyasal süreçlerde ve işleme, istikrar, ve karasal ekosistemler 1 toprak organik madde ve besin döngüsü istikrarsızlık merkezi vardır. EES üreterek, toprak mikroplar ayrıştırmak ve böylece bitki ve mikroplar toprakta mevcut besin asimile sağlar önce bağlı mikro ve makro besinleri, özgürleştirici, daha küçük çözünür moleküller halinde polimerik organik madde dönüşümü. Doğrudan enzimleri tespit ve ölçmek çok zordur çünkü EES, öncelikle laboratuvar deneylerinde 2-4 faaliyetlerini ölçerek, yıllardır çalışılmıştır. Hücre dışı enzim aktivitesi (EEA), en kuvvetli enzimler ve karşılık gelen alt-tabakaların konsantrasyonu ile kontrol edilir. Bolluğu, farklı C-, N-ve P-topraklarda bozundurucu enzimler, çok sayıda faktör tarafından kontrol edilir imikrobiyal biyokütle, topluluk kompozisyonu, yüzey kullanılabilirliği, mikroklima ve stokiyometrik taleplerini 5,6 ncluding. Ancak, toprak ortamı içinde in situ EEAS da boyut, yüzey kullanılabilirliği açısından, sıcaklık 7,8, toprak killeri ve hümik özellikleri 2&#39;ye enzimlerin bağlayıcı ve sonuçta aktif enzim havuzu düzenleyen difüzyon kısıtlamaları 9, etkilenir ve devir oranları 10-12. Farklı çevre siteler arasında toprak mikrobiyal şekilde yorumlamak için laboratuvar enzim testiyle nedenle, yerinde toprak koşullarında kabul önemlidir. EEA Birçok farklı sınıflar (daha fazla detay için &quot;Reaktifler Tablo Listesi&quot; bakınız) sentetik yüzeylerde kullanarak çeşitli laboratuar deneylerinde belirlenebilir. Bazı protokoller w, bir spektrofotometre ile tespit edilebilir bir kolorimetrik reaksiyon kuple edilir deneylerde alt tabakaları kullanırbir floresan parçasına bağlanmıştır alt tabakaları kullanır, burada tarif protokol de dahil olmak hile diğerleri. Floresan EE deneyler tipik haliyle kolorimetrik analizler göre (büyüklük sırasına göre) daha hassastır (sentetik alt-tabaka ile bağlanmış bir kromojenik grubu kullanan) 12-14. Bir ilgi bileşiğinin miktarı ile ilgilidir tespit ve en tespit potansiyel enzim aktivitesi için diğer ilgili: EEA saptanmasında duyarlılık iki yönü içerir. Kolorimetrik p-nitrofenol için yöntemler, (PnP) dayalı tahliller geçmişte bulunabilir 15,16 çalışır. Kısaca, toprak içinde en iyi ya da alan uygun sıcaklık ve pH inkübe edilir (tipik olarak &lt;2 mm ve hava ile kurutularak için elenmiş). Serbest reaksiyon ürünü bir spektrofotometre 14 ile kolorimetrik tespit edildiği hızı. Floresan enzim deneylerinin yüksek hassasiyet substr ilişkili fluorojenik parçası ayırma daha hassas bir şekilde tespit kısmen kaynaklanmaktadırBelirli bir dalga boyundaki bir spesifik kromojenik kısmının ayrılmasından sonra bozulmasını yerine kayıt absorbans yedi. En yaygın olarak kullanılan sentetik floresan göstergeleri 4-metilumbelliferon (MUB) 17 ve 7-amino-4-metilkumarin (MUC) 18,19 vardır. MUC-bağlanmış alt tabakalar genellikle bu tür proteinlerin ve / veya amino asitler gibi N-zengin sentetik alt-tabakalar ile ilişkilidir. Floresan teknikleri ilk su numuneleri 20,21 için geliştirilen ve topraklara uygulama sinyal söndürme ve müdahale 22,23 için denetimler gerektirir edildi. Deneyler Ya büyük hacimli geleneksel &quot;masa üstü&quot; kimyası kullanılarak yapılabilir, veya artmış verim, ancak muhtemelen daha yüksek ölçüm hatası ile, mikro göre protokollerinde de kullanılabilecektir. Topraklarda 24 EEAS floresan tespiti için çeşitli yaygın olarak anılan protokoller olsa da, birçok laboratuvar genellikle yanlışlıkla veya bağlı farkı, bu protokoller üzerinde ince varyasyonları istihdamlaboratuar ekipmanları veya reaktiflerdeki s. Protokollerinin ayrıntıları görünüşte küçük farklılıklar şiddetle EEAS 25,26 ölçülebilir etkiler ve standart enzimlerin eksikliği, farklı laboratuarlar arasında deneyleri kalibre zorlaştırmaktadır. Böylece, EEA testlerin standardizasyonu teşvik detaylı protokollerin yayılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Protokolde, toprak numuneleri, bir pH tampon maddesi ile toprak örnekleri birleştiren ve bir karıştırıcı ile homojenize edilmesi suretiyle hazırlanır. Bulamaçlar daha sonra, floresanla işaretlenmiş sınırlayıcı olmayan bir miktarı ile aşılanır = C-,-N ya da P açısından zengin alt tabaka, ilgi konusu özel bir araştırma söz bağlı olarak seçilir. Enzim deneylerde toprak bulamaçları kullanarak alt-tabaka difüzyon sınırlamaları en aza indirmek için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Flüoresan kısımları kendi ilgili bir substrattan ayrılmaktadır kadar söndürüldü, ve floresan boya alt-tabaka b serbest olarak bu şekilde enzim aktivitesi tespit edilebiliry bir enzim katalizli reaksiyon. Zaman içinde artan flüoresan yoğunluğu, enzim-katalizörlü reaksiyon oranını yansıtır. Floresans enzim tahlilinin genel kavramı flüorojenik yarımı (flüoresan boya) ile bağlı sentetik alt-tabakalar, toprak örneği 27 eklenir olmasıdır. Enzim-alt tabaka katalize bozulması sırasında bağ floresan boya ve alt-tabaka arasında keser. Substrattan serbest floresan boya sonuç olarak enzim aktivitesinin dolaylı bir değerlendirme olarak kullanılır ve boyanın floresans yoğunluğunu tespit etmek için bir mikro-plaka okuyucu kullanarak ölçülebilir. Serbest kalan boya farklı bir dalga boyunda ışık emici sonra bir dalga boyunda ışık yayan olarak Kısaca, floresan ölçümü gerçekleştirilir. Floresan yoğunluğu uyarı ve tespit hem edebilen bir plaka okuyucu tarafından kaydedilir. Enzim aktivitesi, daha sonra bilinen bir floresan boya conce göre tayin edilebilirDeneyde (örneğin 4-metilumbelliferon (MUB) ya da 7-amino kullanılan alt-tabakanın özgül flüorojenik kısmı için floresan yoğunlukları standart bir seyreltme eğrisi referans ile birlikte alt-tabaka (örneğin, sentetik bir alt tabakanın bilinen bir miktarda toprak numunelere ilave edilen) ntrations -4-metilkumarin (MUC)). (Enzim aktivitesi ölçümü ile ilgili özel ayrıntılar için protokol bölümüne bakınız). Laboratuvar toprak enzim tahlilleri mikrobiyal topluluk fonksiyonunu değerlendirmek için yararlıdır, ancak kullanıcılar 10 tanıması gereken birkaç teknik sınırlamalar vardır. Floresan deneyleri ışığa maruz kaldığında kirlilikler ve / veya birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir, bu nedenle floresan Alt tabakalar 25 tutarken dikkatli olunmalıdır. Toprak çamurlarında kir tanecikleri ve / veya organik madde de söndürme etkisi 26 olarak bilinen floresan yoğunlukları, engelleyebilir.Bundan başka, laboratuar deneyleri, enzim sadece laboratuar koşulları altında potansiyel EEAS değerlendirir. In vitro deneyler, alt-tabaka ve bolluk difüzyon sınırlayıcı olmayan koşullar altında EEAS ölçer. Bu nedenle, bu deneyleri tarafından sağlanan veri in situ toprak koşulları altında 10 EEAS için iyi bir vekil olmayabilir. Genel olarak, enzim aktivitesi, toprak tipi benzer olan nispi karşılaştırması için çok yararlıdır. Fiziksel ya da kimyasal özellikleri açısından farklılık gösteren etkinlikleri kirlerin arasındaki karşılaştırma, bu yöntem kullanılarak, ancak, dikkatli kullanılmalıdır. Bu, toprak tipi, sıcaklık farklılıkları büyük ölçüde yerinde enzim kinetik durumunu değiştirebilir olmasından kaynaklanmaktadır. Diğer bir sınırlama, nispeten az sayıda alt-tabakalar (doğal ortamı ile karşılaştırıldığında) ticari olarak temin edilebilir olmasıdır. Ayrıca, enzim deneyleri için kullanılan alt-tabakalar, sentetik doğru mevcut veya availabl toprak tabakaları temsil etmeyebilir (kolay eriyen) nispeten basitin situ e. Dikkate alınacak diğer bir faktör toprak bulamaçlarından kullanılarak in situ koşullarında 2 altında aktif olmayabilir (yani organik madde ya da killerin hareketsiz) bazı stabilize enzimlerin aktivitesini dahil olacaktır. Laboratuvar enzim tahlilleri de toprak (enzim ciro oranları) veya toprak enzimleri üreten özel mikrobiyal türler konusunda bilgiler enzimlerin kalıcılığı ile ilgili bilgi vermemektedir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents: </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#945;-D-glucopyranoside (AG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9766</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-glucopyranoside (BG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3633</td>
			<td>Sugar degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl &#946;-D-cellobioside (CB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6018</td>
			<td>Cellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2145</td>
			<td>Protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&#946;-D-glucosaminide (NAG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2133</td>
			<td>Chitin degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8883</td>
			<td>Phosphorus mineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl-&#946;-D-xylopyranoside (XYL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7008</td>
			<td>Hemicellulose degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S210-500</td>
			<td>acidic and neutral soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris base buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP154-1</td>
			<td>basic soils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-65</td>
			<td>pipetting reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-684-265</td>
			<td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 101-1,250 &#956;l extended length natural tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1112 - 1720</td>
			<td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-100-100SH</td>
			<td>Lab disc magnetic stir plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring blender</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-509-7P</td>
			<td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-688-231</td>
			<td>Dispenser; range: 5-50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Unispense &#956;P peristaltic pumps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-683-7</td>
			<td>Optional dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1451363SIX</td>
			<td>Used to stirr soil slurry afer blending</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass bowls</td>
			<td>World Kitchen</td>
			<td>5304218</td>
			<td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well black solid plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-590</td>
			<td>Used for plate reader step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96-well assay blocks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-700</td>
			<td>V-bottom; 2 ml; sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-387-93</td>
			<td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3121</td>
			<td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30016058</td>
			<td>Plate reader (this model is no longer available)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

Kirlerin ve diğer ortamlarda mikroplar için enerji ve besin asimile edilebilir, böylece organik makromolekülleri depolimerize ve hidrolize etmek için hücre dışı enzimler üretir. Toprak mikrobiyal enzim aktivitesini ölçmek toprak ekosistem işlevsel dinamiklerini anlamak çok önemlidir. Floresans enzim tahlilinin genel kavramı sentetik C-, N-, veya bir floresan boya ile bağlı P açısından zengin alt tabakalar toprak örneklerinin eklenir olmasıdır. Zaman sağlam, etiketli substratlar floresan değildir. Enzim etkinliği fluoresan boyalar onları floresan sağlar kendi alt-tabakalar, ayrıldı olarak floresansta artış olarak ölçülür. Enzim ölçümleri molarite veya etkinliğinin birimleri olarak ifade edilebilir. Bu tahlili gerçekleştirmek için, toprak harç maddeleri, pH tampon maddesi ile toprak birleştirerek hazırlanır. PH tampon maddesi (genellikle 50 mM sodyum asetat ve 50 mM Tris tamponu), en iyi kir sa eşleştirmek için tamponunun belirli asit ayrışma sabiti (pKa) için seçilmiştirmple pH. Toprak bulamaçlar floresan (yani C-N-ya da P-zengin) alt-tabaka olarak etiketlenmiş bir sınırlayıcı olmayan bir miktarı ile aşılanır. Deneyde toprak harç maddelerin kullanılması, enzim ve alt tabaka difüzyon sınırlamaları en aza indirmek için hizmet eder. Bu nedenle, alt-tabaka bir sınırlama farklılıklara, difüzyon oranları, ve toprak pH koşulları için, bu deney, kontroller, bu yüzden (örnek başına) enzim konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak potansiyel bir enzim aktivitesi oranlarının saptanması. Floresan enzim tahlilleri genellikle spektrofotometrik (yani kolorimetrik) tahlillerinde daha duyarlı, ancak kirlilikler ve ışığa maruz birçok floresan bileşikler istikrarsızlık nedeniyle parazit muzdarip olabilir; böylece floresan tabakaları kullanırken dikkatli olunmalıdır. Alt tabakalar sınırlayıcı değildir Benzer şekilde, bu yöntem sadece laboratuar koşulları altında potansiyel enzim aktivitesini değerlendirir. Haçı temsil eden verileri yorumlarken dikkatli kullanılmalıdırYerinde toprak tipi ve sıcaklık gibi farklı sıcaklıklar veya toprak türleri ile-site karşılaştırmalar enzim kinetiği etkileyebilir.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities at JoVE.com

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Toprak dışı enzim faaliyetlerinin muhtemel değerlerini ölçmek için, bir floresan boya bağlanmıştır sentetik alt-tabakalar toprak örneklerinin eklenir. Floresan boya yüksek flüoresans daha fazla alt bozulmasını gösteren bir enzim-katalizörlü reaksiyonu ile alt-tabakadan salınmaktadır gibi enzim aktivitesi ölçülmüştür.

Potansiyel Toprak Ekstrasellüler Enzim Aktivitelerinin Yüksek verim Florimetrik Ölçme

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

high-throughput-fluorometric-measurement-potential-soil-extracellular

Research

JoVE Journal

Environment

45.9K Görüntüleme.  Colorado State University.  Toprak dışı enzim faaliyetlerinin muhtemel değerlerini ölçmek için, bir floresan boya bağlanmıştır sentetik alt-tabakalar toprak örneklerinin eklenir. Floresan boya yüksek flüoresans daha fazla alt bozulmasını gösteren bir enzim-katalizörlü reaksiyonu ile alt-tabakadan salınmaktadır gibi enzim aktivitesi ölçülmüştür. 